Name: isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
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This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

폐기 인간의 수술 환자의 조직과 차 문화의 설립을 얻기위한 프로토콜은 텍사스 의료 분기 및 뉴 멕시코 임상 시험 심사 보드의 대학의 대학에 의해 승인되었다. 인체 조직 표본의 조달을위한 일반적인 요건은 다음과 같다. MFS 냉동 조직, 바이오 뱅크 및 상업 공급 업체에서 고립 될 수 있기 때문에 또한 실행 가능한 옵션입니다 있습니다. 1. 인체 조직을 구합니다 <ol><li> 승인 기관 심사위원회에 인간의 대장 조직을 얻기 위해 프로토콜을 제출합니다. </li><li> 연구를 위해 인체 조직을 얻기 위해 일반 외과 및 / 또는 대장 외과 의사와 협력을 설정합니다. 그들이 진단을 위해 필요하지 않습니다 및 연구를 위해 지정 될 수있다 조직을 결정하는 바와 같이 병리 부서와의 협력은 필수입니다. </li><li> grossl 후 종양에서 조직을 제공하기 위해 병리학 조언종양 정상적인 점막 Y 적어도 5cm. 즉시 얼음처럼 차가운 세척 매체에 샘플을 배치하고 얼음에 배치합니다. 병리학 연구를 위해 안전하게들 수 조직의 양을 결정할 것이다. MF 분리에 필요한 최소한의 티슈는 1.5 mm 2이다. </li><li> 미래의 격리를위한 -80 ° C에서 차 문화 또는 동결과 장소를 설정 얻어진 조직 중 즉시 사용합니다. <ol><li> -80 ℃에서 동결 미디어 (아래 참조), 저장의 1 ml의 극저온 튜브에 배치, 2 MM 2 개 - 나중에 분리에 대한 동결 경우, 약 1로 조직을 잘라. 참고 :이 프로토콜을 이용, 4 년 동안 동결 조직에서 MFS의 성공적인 분리가 관찰되었다. </li></ol></li></ol> 2. 시약 준비 <ol><li> 콜라게나 솔루션의 경우 : 칼슘과 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 100 U / ㎖ 콜라게나 제 I, II 및 IV 준비 / 마그네슘 2+ (재료 표 참조 </stronG&gt;). 주의 : 콜라게나 제 활성 단위 농도 및 순도 월 점막 세포 표면 에피토프 티슈 소화 및 / 또는 보존 효율을 방해 할 수 벤더 벤더마다 다르다. 이러한 가능성을 방지하기 위해 함정, 순도 (≥95 %)의 가장 높은 정도 콜라겐을 사용하여 활성 단위의 농도에 기초하여 상기 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 10 밀리그램 / ㎖ (3.55 UA / mg)을 물 기반 DNase의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 워시 매체를 준비합니다 (MEM : 89 ml에, 항생제 - 안티 곰팡이, 100 배 : 1 ml의 열 불 활성화 FCS : 10 ㎖) </li><li> MEM : 섬유 아세포 성장 미디어를 준비 500ml의 병; L- 글루타민 (200 mM)을 5 ㎖; MEM 비 필수 아미노산, 100 배 용액 5 ml의; 염산 시프로플록사신 (10 ㎎ / ㎖) 570 μL; 항생제 안티 곰팡이, 100 배 용액 10 ml의; 피루브산 나트륨 (100 mM)을 5 ㎖; 열 불 활성화 FCS : 50 ㎖ </li><li> 동결 매체 제조 : 섬유 아세포 성장 배지 10 %의 디메틸 설폭 시드 부가 (DMSO)와 (시약 2.4) 후 - 필터링을 아이돌0.22 μm의 필터로 ilize. </li></ol> 3. 효소 다이제스트 인간의 조직 <ol><li> 조직이 따뜻한 (~ 37 ° C) 물에 동결 미디어, 장소 cryovial에 동결 된 경우 조직 및 미디어가 해동 될 때까지. </li><li> 4 - 조직의 2mm 2 개 5, 칼슘 / 마그네슘 2+없이 두 번 HBSS 10 mL로 조직을 씻는다. </li><li> 조직이 중력에 의해 정착되면, 조심스럽게 샘플을 회전하지 않고 상층 액을 버린다. </li><li> 샘플 콜라게나 제 용액 10 ㎖를 추가로 멸균의 DNase /의 RNase가없는 튜브로 조직 혼합액을 전송 내장 된 샘플 해리 용 로터. 상피 세포의 기저 부분을 둘러싸는 점막 고유 층의 비 세포 분획을 형성하는 세포 외 기질을 해리 콜라게나 제를 사용한다. </li><li> 단단히 가까운 튜브 및 dissociator (예를 들어, GentleMACs)의 소매에 거꾸로 부착. 연구소는 T로 액세스 권한이없는 경우그는 장비 상술 유사한 결과를 얻기 위해 각각의 분해 공정의 시간을 증가시킨다. </li><li> 프로그램 h_tumor_01을 실행, 미리 설정된 프로파일은 기계 (- 실행 당 268 원과 4,000 rpm으로,에 이르기까지 간헐적 인 펄스와 36 초 총 지속 시간, 1,000)에 포함. </li><li> 프로그램의 종료 후, 관 dissociator로부터 분리. </li><li> 140 rpm에서 진탕 기에서 연속 회전에서 37 ° C에서 45 분 동안 샘플을 품어. 주 : 조직 샘플의 양을 변화시키기위한, 소화 시간은 비례 적으로 감소하거나 증가 될 수있다 (즉, 조직의 더 많은 양의 추가적인 시간이 필요할 수 있음). </li><li> dissociator의 소매에 거꾸로 튜브를 연결합니다. </li><li> (- 실행 당 235 원으로, 4,000 RPM 1,000에 이르기까지 간헐적 인 펄스, 37 초 총 시간)을 선택하고 프로그램 h_tumor_02를 실행합니다. </li><li> 프로그램의 종료 후, 관 dissociator로부터 분리. </li><li> DNase의 주식 솔루션의 50 μl를 추가. / 해리 죽은 세포와 응집 셀에 이르게 세포 파편의 DNA의 일부를 제거하기 위해 DNase를 사용합니다. </li><li> 60 rpm에서 진탕에 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 다시 dissociator의 소매에 거꾸로 튜브를 연결합니다. </li><li> (- 실행 당 168 원으로, 4,000 RPM 1,000에 이르기까지 간헐적 인 펄스, 37 초 총 시간)을 선택하고 프로그램 h_tumor_03를 실행합니다. 주 : 조직이 완전히 분해되지 않는 경우 20 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 원심 분리, 세포 해리 용액 2 ml의 상등액을 폐기 재현 탁하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 멸균 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 20 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 원심 분리 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는. </li><li> 세척 세포 칼슘 / 마그네슘 2+없이 두 번 HBSS 25 mL를 펠렛과 상층 액을 버린다. </li><li> 마지막으로 이전했다H는, 실험실에서 사용 가능한 자동화 된 셀 카운팅 시스템을 사용하거나 수동 혈구를 사용하여 세포 수를 카운트. MF 차 문화의 생성을위한 분석 단계 3.19.1 동안 진행 또는 단계 3.19.2 동안 진행 유동 세포 계측법 사용 MFS의 정렬. <ol><li> 분리 및 순수 MF 문화의 성장 (그림 1)의 경우, 미디어의 3 ㎖에 4 × 10 6 셀을 배정하는 데 필요한 섬유 아세포 절연 매체의 적절한 양의 마지막 원심 분리에 resuspend 세포 펠렛에서 뜨는을 버리고 당 잘 6 아니라, 세포 배양은 처리 플레이트. 3.20 단계로 진행합니다. </li><li> 분석을 위해 또는, 유동 세포 계측법 (24)의 섬유 아세포 분리 미디어 2 ㎖에 2 × 10 6까지 배치 아니라, 낮은 바인딩 플레이트와 5 % CO 2와 37 ° C에서 O / N을 배양하여 MFS의 정렬. 이것은 효소 적 절차에 의해 영향을받을 수있는 세포 표면 에피토프를 복원하는 것이다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 복구 세포를 계산하고 진행및 면역 염색에 대한 분석 8 유동 세포 계측법. </li></ol></li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 성장한다. 80 %의 합류 MF 단층 ~의 형성 (그림 1D-E)까지 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. </li><li> 통로 6 웰 플레이트에서 비율 1에서와 T25 플라스크에 세포 : 1 ~ 10 성장 - 100 % 컨 플루 - 섬유 아세포 성장 매체의 14 일 (80)을 달성했다. </li><li> 2 : 1 비율로 T75 세포 T25에서 세포를 계대에 의해 문화를 확장합니다. 세포가 포화 상태에 도달하면, 이전에 5 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 사용 고립 MF 순도의 분석을 위해 하나의 플라스크를 사용합니다. 3 : 1 비율로 MF 문화의 또 다른 T75 플라스크를 동결 또는 통로. 참고 : EpCAM-, CD31-, CD45-, 멘틴의 + α-SMA +, CD90 + : 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 때,이 중간 엽 기원의 GI 점막 기질 MF 문화에서 성장하는 것은 다음과 같은 표현형을 때 것으로 예상된다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 잠재적 인 암 예후 바이오 마커 및 치료 대상으로 기질 세포의 매우 중요한 성장의 빛만을 조사 어플리케이션을 위해 개발되었지만, 나중에 사용하기 위해 &quot;기능적&quot;biospecimens을 고정 할 수있는 능력은 상당한 이점을 제공한다. 이 개인화 된 약 10, 11의 개발을 진행하는 역할을하는 등의 추가 도구를 제공 할 수있는, 임상 biorepository의 생성을위한 독특한 장점을 나타낸...

근섬유 아세포는 / 섬유 아세포 (MFS)은 위장관 점막 세포의 풍부한 인구를 나타냅니다. 이러한 기질 세포는 상피 아래에 위치하며, 장내 점막 고유 층 내에서 상호 연결된 네트워크를 형성하고 있습니다. MFS하지 외 기질의 증착 만 담당하지만, 분비 조절을 통해 인접한 상피 1, 2의 전해질 수송 반발 및 장벽 기능에 영향을 미칠 수있다. 또한, MFS 염증 및 조직에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 3,4- 리모델링. 근섬유 아세포는 또한 암 - 관련 아세포로 알려진 종양 미세 환경의 중요한 부분이며, 종양 세포 성장에 기여 암 줄기 세포 (3)에 대한 틈새의 역할을한다. 신흥 데이터는 MFS는 또한 지역의 항원 제시 세포를 제공 할 수 있음을 시사한다. 또한, MFS 기능 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 규제, produ의사이토 카인과 성장 인자 (5)의 다양한 향하도록. 건강한 사람에서, MFS 세포는이 세포는 vimentin에 긍정적이다. 중간 엽 줄기 세포로부터 분화와 그 세포 표면, 중간 엽 마커, CD90 3, 5에 표현하는 것으로되어 있지만, 상피 및 조혈 세포 마커는 EpCAM과 CD45에 대한 부정적인 각각. 근섬유 아세포가 섬유 아세포의 활성화 된 형태로 제시되고, α-SMA (5)의 식에 의해 비 활성화 된 섬유 아세포에서 구별 될 수있다. 지난 10 년 동안, 인간 대장 점막에서 근육 섬유 모세포의 분리를위한 여러 방법이 게시-주로 원래 Mahida 외. 5-8에서 기술 된 방법에 기초하고있다. 개별 연구는 다양한 장내 점막, 여러 위장관의 영역 (즉, 위, 작은 l로부터 MFS의 분리에 대한 더 보편적 인 프로토콜에서 분리 절차를보고 있지만ARGE 장 점막)이 출판되었습니다. 본 명세서에서 프로토콜은 테스트를 성공적으로 상술 한 조직의 세 종류에 사용되어왔다. . 또한, 냉동 GI 점막에서 MFS를 단리하기위한 절차는보고되지 않았다. 여기, 우리는 효소 소화를 기반으로하는 최적화 된 방법을 제시하고, 동시에 문화에 대한 인간의 장내 점막 MFS의 분리를 허용 갓 소화, 단일 세포, 점막 준비에 분석 유동 세포 계측법. 이 기술은 확실하게 MF 표현형과 차 문화를 산출한다. 또한, 동일한 방법뿐만 아니라 위 및 소장 동결 조직 시료로부터 MFS를 분리하는데 사용될 수있다. 신선한 GI 조직으로부터 근육 섬유 모세포의 분리는 전술 한 내용; 그러나, 냉동 검체의 사용은 많은 이점을 제공한다. 즉, 연구자들은 capabi가 전 세계에 걸쳐 공동 작업자의 숫자에서 수집하고 저장하는 조직 할 수있을 것입니다lity 냉동 조직 샘플을 제공합니다. 또한, 연구진은 현재 실험 일정과 충돌에 절연을위한 조직을 처리 수술실 및 / 또는 내시경 제품군 즉시에서 폐기 조직의 컬렉션을 찾을 수 있습니다. 또한, 수술의 예측할 수없는 특성으로 인해, 조직 조달은 처리 조직에 대해 남아있는 시간을 제한 할 매우 늦게 하루에 발생할 수 있습니다. 나중에 처리를 위해 조직을 동결하는 것은 이러한 문제를 개선 할 것이다. 마지막으로,이 방법은 성공적으로 대장 암과 염증성 장 질환 등의 질병 상태에서, 대장 위 및 소장 근육 섬유 모세포의 분리에 활용되고있다.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acids</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&amp;nbsp;Clostridium histolyticum, Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&amp;nbsp;Clostridium histolyticum, Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Accumax cell dissociation solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (70 &amp;micro;m)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>Clone RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoclonal Anti-Actin, &amp;alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Clone 1A4</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Clone 5E10</td></tr></tbody></table>

isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens

섬유 아세포 / 근육 섬유 모세포 (MFS)의 발병 기전에서의 역할과 종양 미세 환경 모두 상처 치유 및 홍보에 대한 그들의 공헌 증가 주목을 받고있다. 현재 위장관 (GI) 조직에서 MFS의 분리를위한 많은 기술이 있지만,이 프로토콜은 냉동 조직에서 이러한 기질 세포의 분리의 새로운 요소를 소개합니다. GI 조직 표본을 동결하는 것은뿐만 아니라 전 세계적으로 공동, 바이오 뱅크, 상업 공급 업체의 샘플을 수집 할 수있는 연구자가, 그것도 신선한 샘플의 지연 처리를 허용 할 수 있습니다. 설명 프로토콜은 지속적으로 마커 CD90, α-SMA 및 멘틴을 표현 MF 표현형과 특성 스핀들 모양의 세포를 얻을 것입니다. 이러한 세포가 환자 샘플에서 유래 된 바와 같이, 일차 전지의 사용은 질환 상태 - 즉 암 및 염증성 장 질환으로부터 가깝게 모방 MFS의 이점을 부여한다. 이 기술은 꿀벌이N 위, 소장 및 대장 MF 차 문화 발전에 확인. MF 일차 배양 통로 걸쳐 실험의 광대 한 배열로 사용될 수 있고, 그 순도는 모두 면역 세포 화학 분석에 의해 평가하고, 유동 세포 계측법.

이 효소 소화 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 분리하고 위장관 수술 표본과 생체 검사 (그림 1)에서 MF 인구 굿 CD90 + 점막 기질 세포 성장을 할 수 있었다. 6 웰 플레이트 (그림 1A-B)로 단핵 세포 현탁액 시드 - 5 보이는 MF 식민지 증식은 2 일에 관찰 할 수있다. MF 차 문화 도달 ~ 50 - 11 (그림 1C-D) - 7 일 70 %의 합류. <p cla...

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Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

인간의 냉동 위장 표본에서 CD 90+ 섬유 아세포 / 근섬유 아세포의 분리


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K 조회수.  University of Texas Medical Branch. Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production. 

비디오: Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

유전학

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

의학

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

생체공학

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

생물학

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of primary fibroblasts derived from keloid tissue are the basis for further studies of the biological function and molecular mechanisms of keloids, as well as new therapeutic strategies for treating them. The traditional method of obtaining primary fibroblasts has limitations, such as poor cellular state, mixing with other types of cells, and susceptibility to contamination. This paper describes an optimized and easily reproducible protocol that could reduce the occurrence of possible issues when obtaining fibroblasts. In this protocol, fibroblasts can be observed 5 days after isolation and reach nearly 80% confluency after 10 days of culture. Then, the fibroblasts are passaged and verified using PDGFR&#945; and vimentin antibodies for immunofluorescence assays and CD90 antibodies for flow cytometry. In conclusion, fibroblasts from keloid tissue can be easily acquired through this protocol, which can provide an abundant and stable source of cells in the laboratory for keloid research.

This study describes an optimized protocol for establishing primary fibroblasts from keloid tissues that can effectively and steadily provide pure and viable fibroblasts.

인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...