우리의 프로토콜은 박테리아 오염을 피하는 데 중점을 두고 1 차 섬유아 세포 격리를위한 쉽고 빠른 접근 방식을 제공하며 이는 큰 문제가 될 수 있습니다. 특히 초보자를위한. 우리의 기술의 주요 장점은 단순성입니다.
그것은 광범위한 수동 기술이나 경험을 필요로하지 않기 때문에 짧은 훈련 기간 내에 모두가 쉽게 배울 수 있습니다. 이 기술을 제시하는 것은 아웃 실험실의 기술자 인 Manja Newe가 될 것입니다. 해부를 시작하기 전에, 일회용 장갑 두 켤레를 착용, 다른 위에 하나.
그리고 폴리스티렌 패드에 마우스를 고정합니다. 70%에탄올로 털을 소독하여 동물이 흠뻑 젖었는지 확인합니다. 그리고 에탄올 살균 수술 용 집게와 외상성 가위를 사용하여 비뇨 생식기 위 바로 위에 피부를 컵.
초기 절개에서 목에 이르는 미드라인을 따라 3~4센티미터를 자르고 팔다리에 릴리프 컷을 추가했습니다. 그리고 복강을 덮고 있는 근육에 최적 접근을 달성하기 위해 피부에 패드에 고정합니다. 그런 다음, 신선한 70 %에탄올로 복부 근육을 두 번 소독.
에탄올이 건조되면 첫 번째 장갑을 제거합니다. 그리고 새로운 멸균 세트의 집게와 가위를 사용하여 복강과 흉부를 열기 위해 근육 층을 절개합니다. 관심있는 장기를 제거하려면 조직을 관통하지 않고 외과 용 집게로 각 장기를 부드럽게 잡습니다.
그리고 가위를 사용하여 기관의 진입점 근처의 공급 혈관을 조심스럽게 절단하십시오. 각 장기를 멸균, 차가운 PBS 튜브에 넣고 튜브를 단단히 닫습니다. 장기가 수집될 때 각 튜브를 젖은 얼음 위에 놓습니다.
모든 장기를 수확하면 멸균 세포 배양 후드에 넣기 전에 튜브에 70 %에탄올로 튜브를 스프레이하십시오. 신선한 장갑을 착용하고 멸균 집게를 사용하여 각 장기를 멸균 6센티미터 페트리 접시의 절반으로 옮긴다. 그리고 간략하게 과잉 혈액을 제거하기 위해 신선한 PBS로 장기를 씻어.
각 페트리 접시의 후반부에 헹구는 장기를 옮기고 초과 PBS를 제거합니다. 두 개의 멸균 메스를 사용하여 장기를 1~ 2밀리미터 조각으로 다진다. 그리고 멸균 주걱을 사용하여 조직 조각을 새로운 개인, 멸균, 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오.
각 튜브에 0.25%의 트립신 용액2밀리리터를 추가합니다. 그리고 5 분 동안 섭씨 37도에서 세포 배양 인큐베이터에 튜브를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브를 분당 약 1,400회 회전하여 10초 동안 소용돌이를 피합니다.
그리고 튜브 당 태아 송아지 혈청으로 보충 된 적절한 배양 매체의 4 밀리리터로 트립신 반응을 체포한다. 다음으로 각 튜브에 적절한 콜라게나아제 블렌드 솔루션을 추가합니다. 그리고 튜브를 섭씨 37도의 초음파 수조에 10분 간 배치합니다.
초음파 처리가 끝나면 튜브를 10 초 동안 부드럽게 소용돌이시다. 튜브를 초음파 수조에 10 분 이상 다시 넣기 전에. 두 번째 초음파 처리가 끝나면 튜브를 10 초 더 소용돌이시다.
그리고 70 %에탄올로 튜브를 소독하십시오. 세포 배양 후드에서, 개별 40 마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 멸균 튜브, 15 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 그리고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.
튜브 당 신선한 매체의 1 밀리 리터에 펠 릿을 다시 중단. 그리고 적절한 도금 밀도에서 적합한 세포 배양 용기에서 세포를 참조하십시오. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터에 하룻밤 동안 배치합니다.
다음 날 아침, 신선한 배지를 추가하고 인큐베이터에 세포를 반환하기 전에 PBS로 각 문화를 세 번 세척합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 실행 가능한 섬유아세포는 후속 실험에서 사용하기 위해 얻을 수 있습니다. 아미노산 형광 염색 또는 증식 실험과 같은.
성인 섬유아세포는 일반적으로 단층층에서 성장하는 다중 세포 과정을 가진 평평한 스핀들 모양의 세포입니다. 그러나 다른 장기에서 섬유아세포 집단에 있는 뚜렷한 형태학 적 다름은 관찰될 수 있습니다. 예를 들면, 신장 섬유아세포는 더 작고 심장, 폐 또는 간 섬유아세포 보다는 더 높은 밀도에서 증가합니다.
고립된 섬유아세포는 높은 증식률을 표시하여 약 6일 후에 90% 이상의 광학 적 합류에 도달합니다. 여기서, 특유의 알파 평활근 액틴 마이크로필라멘트를 가진 차별화된 심오섬유블라스트를 관찰할 수 있다. 이 세포는 심장, 신장, 간 및 폐 세포 배양에서 풍부하게 발견됩니다.
고립및 배양세포의 약 20~30%만이 질서 정연하게 표현하고, 배열된 알파 스무스 근육 액틴 마이크로필라멘트이지만, 사실상 모든 세포는 7일간의 배양 후 비멘틴과 디스코시딘 도메인 수용체 2에 긍정적이다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 박테리아 오염을 피해야 하기 때문에 절차 전반에 걸쳐 올바른 기술을 사용하는 것입니다. 1 차적인 섬유아세포 격리 후에, 세포는 정신과 실험 및 특성화의 모든 종류에 이용될 수 있습니다.
면역 세포 화학 증식 또는 상처 치유 에세이, 또는 분자 생물학적 평가와 같은.
