이 프로토콜은 우리가 중요한 순도로 정지와 상해 유도한 활성화된 섬유아세포 인구를 둘 다 격리할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 즉흥연주를 위한 유연성입니다. 유동뿐만 아니라 비드 기반 절연의 경우, 오염된 세포에 대한 항체를 통합하여 격리된 표적 세포에서 제외할 수 있다.
이 기술은 주로 심장 섬유아세포 격리에 사용됩니다. 그러나, 그것은 다른 조직에서 섬유 아 세포를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 학부 인턴인 Meiling Melzer와 제 실험실의 연구 조교인 데이비드 비어(David Beier)가 될 것입니다.
해부 동안 6개의 하트를 보관할 수 있는 6웰 플레이트를 준비하려면 차가운 KHB 2밀리리터를 각 우물에 분배하고 접시를 얼음 위에 놓습니다. 몸에 70%에탄올을 뿌림합니다. 복부 면이 실험자에게 직면할 수 있도록 방향을 지정합니다.
간섭을 방지하기 위해 부속물을 고정합니다. 간을 관통하지 않고 복부 피부와 근육을 잘라냅니다. 흉골을 향해 수직으로 자르고 심장을 관통하지 않고 흉부를 조심스럽게 열어 주세요.
다음으로 흉곽을 계속 잘라 서 심장을 노출합니다. 집게를 사용하여 심장을 가슴 밖으로 부드럽게 들어 올려 심장 바깥쪽에 부착된 폐 또는 과잉 조직을 잘라냅니다. 왼쪽 심실을 분리합니다.
각 해부에 대해, 6 웰 플레이트의 별도의 우물에 심실을 배치합니다. 첫째, 집게를 사용하여 KHB의 심실을 반복적으로 짜내고 동요하여 과도한 혈액을 제거하십시오. 심실을 깨끗하고 멸균된 10센티미터 평방 플레이트로 옮기습니다.
다음으로, 단날 블레이드를 사용하여 심실을 작은 조각으로 빠르게 다진다. 콜라게나아제 소화 칵테일 1밀리리터를 넣고 계속 다진 다듬습니다. 조각이 1 밀리리터 마이크로 파이프로 전송할 만큼 작을 때 50 밀리리터 원뿔 튜브로 옮기십시오.
두 밀리리터의 칵테일로 접시를 두 번 씻고 세척을 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 30분 동안 배양하고, 5밀리리터 파이펫을 사용하여 원고에 설명된 바와 같이 세포를 재보선한다. 초기 재서스펜션 후, 세포를 15분 동안 배양하고 10밀리리터 파이펫을 사용하여 다시 다시 중단합니다.
그런 다음 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 새로운 50밀리리터 원뿔 튜브 위에 놓고 KHB의 1~2밀리리터로 습식하여 스트레이너를 프라임합니다. 소화 현탁액에 25 밀리리터의 KHB를 추가하고 다시 중단합니다. 여과기를 통해 서스펜션을 필터링하고 필요에 따라 여과기를 교체합니다.
10 분 동안 400 배 g와 섭씨 4도에서 여과물을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 심장 당 5 밀리리터를 사용하여 1x RBC 리시스 버퍼에서 펠릿을 다시 분리합니다. 실온에서 2분 동안 서스펜션을 배양한 후 실온에서 10분 동안 서스펜션을 400배 g로 원심분리합니다.
상체를 제거한 다음 KHB의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 그런 다음 서스펜션에 KHB의 9 밀리리터를 추가합니다. 40마이크로미터 의 셀 스트레이너를 통해 서스펜션을 새로운 50밀리리터 원유형 튜브로 필터링합니다.
원심 분리는 실온에서 10 분 동안 400 배 g에서 원심 튜브를 분리합니다. 마지막으로, 상체를 제거하고 섬유아세포 미디어 또는 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리한다. 세포 수가 결정된 후, 섬유아세포는 원고에 기재된 세 가지 다른 방법에 의해 현탁액으로부터 분리될 수 있다.
차동 도금에 의한 격리를 시작하려면 각 웰에 섬유아세포 미디어 2밀리리터를 추가하여 6웰 플레이트를 준비합니다. 접시를 소용돌이치고 잘 바닥을 덮습니다. 마우스 심장 세포가 PBS에서 중단되는 경우에, 원심분리기 및 심혼 당 섬유아세포 매체의 1 밀리리터에서 그(것)들을 재중단합니다.
각 웰에 한 심장에 해당하는 세포 현탁액 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 소용돌이어 세포를 균등하게 분배합니다. 잘 당 최대 4 밀리리터의 총 볼륨에 대한 섬유 아세포 미디어의 1 ~ 2 밀리리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하세요. 섬유아세포는 우물을 선택적으로 고수하기 때문에 미디어를 제거하고 폐기하여 격리될 수 있습니다. 나머지 부착된 세포를 PBS 2밀리리터로 세척한 다음, 잘 하면 멸균 섬유아세포 미디어 2~4밀리리터를 첨가합니다.
37도에서 컨서적 일 때까지 배양하여 2 ~4 일마다 미디어를 변경합니다. CD45 양성 조혈 세포의 자기 라벨링 및 분리를 시작하려면 5 분 동안 500 배 g에서 마우스 심장 세포의 현탁액을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 평형 버퍼의 1 밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 분리합니다.
혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 다시 원심분리한 후, 세포 펠릿을 평형 버퍼로 재보페킹한다. CD45 양성 자성 구슬을 추가하고 잘 섞습니다.
섭씨 4도에서 최소 15분 동안 배양하세요. 평형 버퍼를 추가하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 500 배 g에서 원심 분리를 추가하여 세포를 씻으하십시오. 상체를 제거하고 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.
평형 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 40마이크로미터 필터를 통해 서스펜션을 전달하여 세포 집계가 분리 열을 막히는 것을 방지합니다. 다음으로, 적절한 분리기의 자기장에 분리 열을 배치하고, PBS의 적어도 3 밀리리터로 컬럼을 상형화한다.
컬럼을 통해 세포 현탁액을 붓고, 15밀리리터 원내 튜브에 표지되지 않은 세포를 포함하는 흐름을 수집한다. 평형 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 세 번 세척하고 세척을 흐름 통과와 결합합니다. 분리기에서 컬럼을 제거하고 15밀리리터 원판 튜브에 컬럼을 놓습니다.
표시된 CD45 양성 셀을 elute하려면 평형 버퍼5 밀리리터를 열에 넣고 열을 단단히 급락시합니다. 원심 분리는 용액의 튜브와 500 배 g에서 유동 튜브를 유량 관통합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.
격리를 완료하려면 CD31 양성 내피 세포 및 MEFSK4 양성 섬유아세포에 대한 원고의 프로토콜을 따르십시오. 형광 활성화 세포 분류는 심근 경색 다음 알파-SMA-GFP 마우스 심혼으로부터 분리된 단일 세포에서 수행되었다. 대표적인 게이팅 방식은 CD31, CD45 또는 AN2를 공동 발현하는 GFP 양성 세포를 시연한다.
부상당한 마우스 심혼에서, 내피 세포및 조혈 세포의 작은 백분율은 GFP를 표현했습니다. 그러나, GFP 양성/CD31-음수/CD45-음수 세포는 AN2, pericyte 마커를 발현하지 않았다. GFP 양성 세포는 알파-SMA, 콜라겐 1알파1, 페리오틴 및 비멘틴을 발현하였다.
선택적 접착력에 의해 분리된 부상되지 않은 섬유아세포는 비멘틴을 표현했지만 알파-SMA, periostin 또는 콜라겐 1알파1의 발현을 보여주지 않았다. 부상되지 않은 섬유아세포와 활성 섬유아세포 는 모두 MEFSK4 항원으로 표현되었습니다. 선택적 접착력에 의해 분리된 부상하지 않은 섬유아세포와 알파-SMA-GFP 마우스에서 분리및 정렬된 근섬유아세포는 콜라겐을 계약하는 능력을 입증했습니다.
배양 하기 전에 조직을 완전히 다진 것이 중요 하다. 비드 계 분리 전에, 세포 응집을 방지하기 위해 40 마이크로미터 필터를 통해 서스펜션을 통과하는 것이 중요하다. 이 방법에 의해 정제된 세포는 높은 수준의 순도를 보장하기 위해 pericyte 특이적 항체와 관련된 자기 비드를 사용하여 더욱 정제될 수 있었다.
새로운 비드-컨쥬게이드 항체뿐만 아니라 리포터 형질성 마우스의 가용성으로, 하나는 섬유 아세포뿐만 아니라 뚜렷한 세포 집단을 격리하고 연구하기 위해 이러한 기술을 활용할 수 있습니다.
