RSF has received funding from the European Union's - Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n&#176; 618432 &#8211; MC&#8212;Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).

윤리 성명 :이 연구의 동물 관리 및 사용에 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 문을 본했다. 모든 실험은 로컬 윤리위원회에 의해 승인되었다. 마우스의 변형을 표현하는 적합한 Cre 호텔 - 재조합 효소를 선택하십시오 <ol><li> 조사하는 구매 (26)와 대상 조직에 따라 사용할 수 Cre 호텔의 형질 전환 라인의 큰 다양성의 부족, Cre 호텔 재조합 효소 유전자가 관심의 조직에 특이 프로모터에 의해 제어되는 Cre 호텔 형질 전환 마우스 변형을 선택합니다. 경우 시간적 제어가 필요한에서, 유도 Cre 호텔 라인을 선택합니다. 참고 : 우리는 특별히 윤부 각막 상피 줄기 / 전구 세포 (24)에 라벨을 붙이기 위해 타목시펜 유도 K14-Cre 호텔 ERT의 유전자를 선택했다. 디 지 롤라 모 동료가 자신의 K1에 대한 각막 식으로 윤부 특이성을보고, 균주 사이에 차이가있을 수 있습니다4-Cre 호텔 ERT (22). Cre 호텔 유도 트랜스 제닉 마우스를 사용하는 장점은 다목적 타임 프레임에서 추적 혈통의 유도를 허용한다는 것이다. </li></ol> 2. 적절한 브롬 마우스 스트레인을 선택 <ol><li> 연구 문제 및 사용 가능한 Cre 호텔 라인 16,18,20에 따라 적절한 브롬 카세트를 선택합니다. <ol><li> 비 - 유도 Cre 호텔 마우스 균주를 사용하는 경우, 연속적인 DNA 반전 / 절개를 허용하고, 따라서 (16) (실시 예 Br1.0 또는 Br1.1 용) 데드 엔드 제품을 초래하지 않는 브롬 카세트를 선택한다. </li></ol></li></ol> 3. 관심의 유전자 변형 라인 크로스 <ol><li> 여기에 표시된 프로토콜의 경우, hemizygous 새끼 쥐를 얻기 위해 동형 접합 Cre 호텔 ERT 변형 (Cre 호텔 ERT / Cre 호텔 ERT)와 동형 접합 R26R - 색종이 변형 (Br2.1 / Br2.1)를 건너 (Br2.1 / +; Cre 호텔 / +) 모노 대립 유전자 모두가 하나의 Br2.1 대립 유전자를 포함하기 때문에 추적 혈통과 준비가 그단일 Cre 호텔 대립 유전자. 참고 : 한 개의 Cre 호텔 대립 (Br2.1 / +; Cre 호텔 / Cre 호텔)가 포함 된 마우스를 생성 할 수있는 표지의 효율성을 높이기 위해 두 동안 Br2.1 대립 유전자 (Br2.1 / Br2.1; Cre 호텔 / +) 것 (22에서 설명하는대로) 색상 조합을 증가시킨다. </li></ol> 4. Cre 호텔 - 재조합 효소 유도 주 :이 실험에서 타목시펜 투여는 윤부 각막 기저의 K14 양성 줄기 / 선조의 핵으로 Cre 호텔 ERT 재조합 효소의 전좌를 유도하기 위하여 3-4 일 동안 매일 복강 내 주사에 의해 행했다 상피 세포. 다음 프로토콜은 네 개의 마우스의 주입에 사용될 수있다. 또한, 안구 표면에 타목시펜의 국소 적용은 높은 효율을 얻을 수 있습니다. 타목시펜 용액 일주일까지 4 ℃에서 어둠 속에서 유지 될 수있다. 사용하기 전에 솔루션을 따뜻하게. <ol><li> 타목시펜 100 mg의 무게와 옥수수 기름 5 ㎖로에서 용해20 ㎎ / ㎖ 타목시펜 솔루션을 형성한다. </li><li> 복강 3 ~ 4 일 연속 8 주 된 쥐에 타목시펜 (4 mg)을 용액 200 μl를 주입한다. 주 : 타목시펜 용액 1 주일까지 4 ℃에서 어둠 속에서 유지 될 수있다. 사용하기 전에 솔루션을 따뜻하게. </li><li> 국소 적용 : 타목시펜 60 mg의 무게가 60 ㎎ / ㎖ 타목시펜 용액을 형성 옥수수 유 1 ㎖에 용해. 와류 65 유지 진탕 수욕 용액을 설정할 ° C가 사용 때까지 목욕 명확한 휴가를 될 때까지. <ol><li> 조심스럽게 마우스의 각 안구 표면에 타목시펜의 용액 100 μl를 적용합니다. </li></ol></li></ol> 이미징 5. 조직 준비 <ol><li> 이소 플루 란을 이용하여 희생 동물 타목시펜 주입 및 COL 다음 적절한 시점에서 CO 2 흡입 마취 하였다 (반사의 부족에 의해 적절한 마취 확인) (2 % 산소에서 기화)관련 조직을 [선택]. <ol><li> 이 실험을 위해, 다음의 시점에서의 눈을 명백히하다 : 1, 4, 8, 12, 16 주 후에 타목시펜 주입. 곡선 집게를 사용하여 안구 적출술을 얻을 수 있습니다. 안구가 눈 소켓에서 튀어 원인 눈꺼풀을 누릅니다. 시신경을 들고 안구 뒤 집게를 놓습니다. 조심스럽게 안구를 당겨을 분리합니다. 주의 : 아래에 설명한 바와 같이이 단계에서, 표지화 된 세포가 조직의 wholemount 분석을 위해 제조 될 수있다. 일반 냉동 조직 절편은 PFA로 고정하고 후술하는 바와 같이 (제 6 및 22 참조)를 묘화, 제조 할 수있다. </li></ol></li><li> PBS로 가득 60mm 접시에 각각의 눈을 놓습니다. </li><li> 입체 현미경을 사용하여 집게가 아래로 향하게 각막 시신경 근처 눈을 길게 시신경, 근육 및 결합 조직을 제거하고 눈의 후방 부에 작은 절개를하기 위하여 메스를 사용한다. </li><li> 봄 가위를 사용하여 조심스럽게 확대렌즈가 튀어과 집게를 사용하여 조리개를 제거시키는 잘라. </li><li> 메스를 사용하여 둘레 방향 중심부터 반경 4-5 절개함으로써 각막을 평탄화. </li><li> 윤부 이상 초과 주변 조직을 잘라 메스를 사용합니다. </li><li> 다음 간단히 PBS로 씻어, 10 분 동안 PFA 4 %의 각막을 고정합니다. </li><li> 10 분 동안 DAPI와 샘플을 품어 간단히 PBS로 씻는다. </li><li> 상피면이 위를 향하게하여 유리 슬라이드에 마운트 각막. 커버 유리와 각막과 커버의 상단에 미디어를 장착 한 방울을 놓습니다. 슬라이드 RT에서 O / N을 건조 시키십시오. 4 ° C에서 슬라이드를 유지합니다. </li></ol> 6. 공 초점 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> YFP / GFP / CFP 배출의 분리를 가능하게하는 스펙트럼 공 촛점 시스템을 사용합니다. 세트 형광 여기 및 브롬 카세트의 형광 단백질에 따라 발광 파장. 크로스 최소화를 목표로 각 단백질에 대한 최적의 여기 파장을 선택할자극. 다른 단백질로부터의 신호의 누설을 최소화하기 위해 좁은 출사 범위를 선택한다. <ol><li> Br2.1 카세트를 들어,이 시작점으로 형광 여기 (예) 및 배출 (EM)의 설정 다음을 사용 : - CFP 전 405 nm의 / EM 420-480 nm의 - DAPI 전 458 nm의 / EM 470-500 나노, GFP - 전 488 nm의 / EM 497-508 nm의, YFP - 전 514 nm의 / EM 529-540 nm의, 및 RFP - 전 561 nm의 / EM은 575-615 nm의. </li></ol></li><li> 고해상도 대형 조직 영역을 시각화하기 위해서, 타일 화상을 취득. 즉,도 2A-B, 12 × 12 화상 이미지의 어레이를 획득하여 전체 각막에 도시 된 결과를, 각 필드에 위치한 4 형광 채널을 이용하여 필드 (144) (512 X 512)를 취득. 전부 576 이미지를 수집 한 후 병합합니다. </li><li> 다른 깊이와 조직의 구조에 태그 세포의 현지화를 탐색하려면, 관심의 다른 지역의 Z - 스택 이미지를 수집. 주문 T에서O 이미지 각막의 전체 깊이는, 3 μm의 간격으로 8 광학 섹션을 획득. 최대 세기에 기초하여 예측 화상뿐만 아니라 수집 섹션 직교 뷰는 종래 이미징 소프트웨어 (24)를 사용하여 구성 될 수있다. </li></ol> 타목시펜 유도 7. 각막 손상 결합 <ol><li> 이소 플루 란과 마우스 (산소에서 기화 2 %)를 마취하고 관리 진통제 (10 ㎎ / ㎏ Carpofen는 피하 주사). 발가락 핀치에 응답하지 않는하여 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 타목시펜 분말 1g을 달아 200 ㎎ / ㎖ 농도의 용액을 제조하기 위해 무균 DMSO 5ml에 그것을 녹인다. </li><li> 이 맑은 용액이 될 때까지 수조에서 65 ° C로 타목시펜 용액을 가온. 사용할 때까지 목욕 솔루션을 유지합니다. </li><li> 마취 중 탈수를 방지하기 위해 처리되지 않은 반대편 눈에 눈 연고를 적용합니다. 충분한 사기꾼을 회복했다 무인 때까지 동물을 방치하지 마십시오흉골 드러 누움을 유지하기 위해 대한 의식. 완전히 회복 될 때까지 다른 생쥐의 회사에 상처 눈을 시행 한 쥐를 반환하지 않습니다. 마우스가 밀접하게 부상 다음 모니터링해야한다. 그들의 체중의 10 % 이상을 상실하는 경우에, 각막 미란, 또는 불편 고통, 실험이 중단되어야한다. 반복 진통제 투여 전체 실험을하는 동안 매 24 시간. </li><li> 첨부 바늘없이 멸균 주사기를 사용하는 단계; 국소 각 마우스의 한쪽 눈의 전체 각막 표면에 200 μL 타목시펜 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 주 : 액체 용액을 RT에서 안구 표면에 빠르게 고화. 각막 손상의 효과는 상처의 중증도에 따라 다르다. 타목시펜 / DMSO 용액 1 도포 후 부작용은 마우스에서 관찰되지 않는다. 반복되는 응용 프로그램의 경우 각막 혼탁이 관찰 될 수있다. </li><li> 종파 참조 (조직 준비 및 이미징 계속이온 (5)와 관련된 시점에서 6). 일주일 후 상처 (그림 2, 24) (단계 5.1에서 설명하는대로) 여기에 표시된 결과는 쥐를 희생. </li></ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal+behavior.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior.</a> Dev Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148, 33-45 (2012).</li><li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing.">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).</li><li>Beck, B., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+cancer+stem+cell+potential.">Unravelling cancer stem cell potential.</a> Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).</li><li>Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vital+dye+analysis+of+the+timing+and+pathways+of+avian+trunk+neural+crest+cell+migration.">A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration.</a> Development. 106, 809-816 (1989).</li><li>Eagleson, G. W., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+presumptive+brain+regions+in+the+neural+plate+of+Xenopus+laevis.">Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis.</a> J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).</li><li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate:+implications+on+epithelial+stem+cells.">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li><li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adult+stem+cells.">Tracking adult stem cells.</a> EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin.">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li><li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+marks+cycling,+yet+long-lived,+hair+follicle+stem+cells.">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li><li>Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-layer+and+lineage-restricted+stem/progenitors+regenerate+the+mouse+digit+tip.">Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip.</a> Nature. 476, 409-413 (2011).</li><li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland.">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+podocyte+reporter+highlights+heterogeneous+podocyte+changes+in+focal+segmental+glomerulosclerosis.">A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney Int. 85, 972-980 (2014).</li><li>Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+and+imaging+multicolor+Brainbow+mice.">Generating and imaging multicolor Brainbow mice.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+new+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199, 293-306 (2015).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nat Methods. 10, 540-547 (2013).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Di Girolamo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+fate+of+limbal+epithelial+progenitor+cells+in+the+murine+cornea.">Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea.</a> Stem Cells. 33, 157-169 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+stem+and+progenitor+cells+of+the+murine+corneal+epithelium.">Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium.</a> Stem Cells. 33, 230-239 (2015).</li><li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+Lgr5++stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas.">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337, 730-735 (2012).</li><li>Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+Cre+mice.">Inducible Cre mice.</a> Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).</li><li>Collinson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+patterns+of+growth,+stem+cell+activity,+and+cell+movement+during+the+development+and+maintenance+of+the+murine+corneal+epithelium.">Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium.</a> Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).</li><li>Buck, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+centripetal+migration+of+normal+corneal+epithelial+cells+in+the+mouse.">Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).</li><li>Nagasaki, T., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+movement+of+corneal+epithelial+cells+in+the+normal+adult+mouse.">Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).</li><li>Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopotent+stem+cells+are+distributed+throughout+the+mammalian+ocular+surface.">Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface.</a> Nature. 456, 250-254 (2008).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10, 508-513 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

리니지 추적 실험은 수년 동안 진행되어왔다. 최근의 기술 향상과 색종이 마우스 균주의 출현은 연구에 새로운 길을 열었다. 오늘은, 연구자들은 상업적으로 이용 가능한 조직 특이 Cre 호텔 라인, 녹아웃 마우스 및 형질 전환 마우스의 많은 혜택을 누릴 수 있습니다. 이것은 견고하고 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 동시에, 연습 힘드는 회피 기본적인 전문 과학적 질문 어드레싱 다목적 실험 시스템을 설계하기위한 기회를 제공한다. R26R - 색종이 마우스는 효율적인 추적 및 살아있는 유기체 세포의 성격과 행동을 연구하기위한 우아한 도구입니다. 시스템 구축이 용이하며, 배아 발생 동안 단일 세포의 비 침습적 혈통 추적을 허용 줄기 세포 재생을 항상성하에, 또는 상해, 염증 및 암과 같은 상이한 상황. 얻을 수있는 데이터는 강력한 Descript를 제공정량 방식으로 대상 세포 클론 세포의 확장과 세포 이동의 생존의 이온. 중요한 단계는 확실하게 정확한 발달 단계에서 효율적인 조직 특정 표시를 허용 할 수 있습니다 적절한 유전 마우스 변형을 선택하는 것입니다. 이 시스템의 한 가지 제한은 생체 모니터링, 조직에 접근하고 투명해야한다는 것이다. 마찬가지로, 살아있는 동물 내에서 조직의 두께를 추적은 두 광자 또는 다중 광자 현미경에 의해 촉진 될 수있다. 그러나, 세포 추적은 사후 조직 섹션에 가능하며이 선명도 방법 (32, 33)에 의해 투명하게하기 위해 변환 된 후 아마도 손상 조직을 연구 할 수있다. 고려해야 할 또 다른 한계는 동일한 형광을 발현 인접 셀 가능성 동일한 클론 계보에 속할지라도, 그들은 임의로 동일한 형광성 유전자를 발현 독립적 인 기원 세포로부터 유도 될 수 있다는 것도 가능하다는 것이다. 이 possibili다수의 색상 조합을 허용하는 다수의 브롬 대립 유전자를 사용하는 경우가 매우 어려울 TY된다. 앞으로 유전자와 건강과 병리학에서의 돌연변이 연구를 허용합니다 가능한 유전 적 도구 (즉, 녹아웃, 올림피아 및 형질 전환 마우스 모델)와 색종이 시스템을 결합. 마찬가지로, 혈통 세포 운명 결정에 신호 전달 경로의 참여에 새로운 통찰력을 가져올 것이다 다른 시스템 섭동 (즉, 세포 틈새 파괴, 레이저 매개 세포 제거, 약물 치료, 줄기)에서 추적. 궁극적으로, 형광 및 생물 발광 라벨의 조합 사용은 가장자리 현미경을 신호 경로 및 절단의 유전 기자 연구자에게 그들의 자신의 네이티브 환경에서 주변에 대응하는 방법을 하나의 세포를 배울 수있는 강력한 시스템을 제공 할 것입니다.

배아 발생 동안, 조직 및 기관의 형태 형성은 세포 증식, 세포 이동 및 계통 1-4 명세서의 관점에서 기술 될 수 정확한 프로그램을 통해 일어난다. 이러한 생물학적 과정은 세포 재생 줄기 필요 성인 조직의 항상성을 유지에 참여하고 있습니다. 리니지 추적, 식별 및 세포 집단의 특정 유형의 자손의 추적, 배아를 연구하고 세포의 항상성을 막기위한 중요한 도구를 제공합니다. 실제로, 더욱 연구의 많은 분야에서 사용되고있다. 특히, 혈통 추적은 항상성과 암 발달에 기원과 줄기 세포의 운명을 식별에 필수적인 도구가되었다. 이 세포 분리에 체외 배양 또는 transplantati에 대조적으로, 최소한의 실험적인 개입은 그대로 세포 조직 또는 유기체의 컨텍스트에서 동작하는 방법에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있기 때문이다그에 원치 않는 편견의 원인이 될 수 있습니다. 전통적으로, 세포의 세포막에 통합 같은 지용성 카보시 등의 염료, 리니지 추적을 위해 사용되었다. 이런 종류의 실험을 성공적으로 발생 생물학 5,6- 주요 발견과 모양 독창적 개념을 주도하고 있지만, 그들은 타겟 세포의 특이성을 제어하기 어려운, 셀 동작에 염료의 원치 않는 영향 희석을 포함한 몇 가지 제한을 가지고 시간이 지남에 따라 라벨. 염기 아날로그 표시 방식은 아마도 줄기 세포 7,8은 대기에 해당 &quot;레이블 유지 셀&quot;천천히 자전거의 존재를 문서화 사용할 수 있습니다. 이 방법은 제한된 기간 동안 증식 느린 동역학에 기초한 순환 세포의 존재를 입증 할 수있는 동안 그러나 줄기 세포의 기능과 관련된 실질적인 통찰력을 제공 할 수 없었다. 최적의 혈통 추적 메타odology는 현저한 세포, 그 자손, 또는 이웃의 표시 특성에 미치는 영향을 최소화한다. 또한,이 단계 및 시간 의존적 방식으로뿐만 아니라 단일 세포 (클론) 방식에 대한 관심이 세포 집단을 태그 할 수있는 능력을 갖도록, 즉, 라벨 유도에 제어를 갖는 것이 유익 할 것이다. 레이블이 시간 유지하고, 인접하는 셀에 전사되지 해 지도록 설립자 셀의 모든 자손에게 전달되어 안정하고 비가역적인 표식 방법은 중요하다. 최근에, 세포의 표지 유전자 접근법이 개발되었다. 이러한 시스템에서, 세포 특이 적 프로모터는 녹색 형광 단백질 또는 Β 갈 락토시다 제 리포터 유전자 9-13 같이 리포터 유전자의 발현은 loxP-측면 장애물을 제거하고 허용하기 위해 Cre 호텔 재조합 발현을 유발하는데 사용될 수있다. 이 방법뿐만 아니라 세포 및 그 자손의 추적을 가능하게하지만, 또한 세포가 허용olation 및 분자 특성. 단일 세포 수준에서의 셀 추적은 단일 형광성 리포터 유전자의 발현 유도에 의해 가능하게되었다. 본 시스템의 하나의 중요한 한계는 세포의 매우 낮은 백분율이 각각의 클론을 분리하고 추적 할 수있다 표지 만 사실이다. 여러 가지 빛깔의 기자가 사용할 수있는 이러한 한계를 극복합니다. 다색 표시를 사용하는 경우, 동일한 틈새에서 인접 셀의 차동 운명의 트래킹을 효율적으로 14-17을 달성 할 수있다. 최근 Brainbow (BR) 대립 유전자의 다양한 Cre 호텔 / LOX 체계를 이용하여 다수의 형광 리포터 유전자의 발현을 활성화 스토캐스틱 리니지 추적 실험을 위해 개발되었다. Cre 호텔 / LOX 시스템은 인식하고 그러한에 loxP 사이트와 같은 특정 DNA 서열에 결합 Cre 호텔 재조합 효소로 구성되어 있습니다. 다음은 Cre 호텔 재조합 효소의 결합은, 사이트 특이 적 재조합이 발생,에 loxP의 제거 측면 시퀀스 resultin 일으키는다른 형광 단백질 발현의 임의의 g (기구에 대하여 설명한다). 브롬 라인의 다양한 (리뷰 16,18,19 참조)를 사용할 수 있습니다. 브롬 균주 사이의 주요 차이점은 2 (BR 2.0), 3 (Br1.0)에서 4 (Br1.1, Br2.1) 형광 유전자에 이르기까지, 카세트에 포함 된 형광 유전자의 수 (I)의 차이를 포함 (ⅱ) 왕복 배향 LOX 사이트의 존재는 사용되는 LOX 사이트 (III) 타입, (ⅳ) 식 또는 형광 유전자 발현의 침묵 전에 Cre 호텔 활성화에, 유전자 반전 (Br2.0-2.1)을 허용한다. 최근에 설립 Br3 등의 트리 뉴런의 여러 가지 빛깔의 이미징을위한 개선 된 방법을 제공합니다. 이 전사의 주요 특징 중 하나는 최상의 신경의 염색에도 20 처리를 가능 광 안정성 farnesylated 형광 단백질의 새로운 세트를 포함한다는 것이다. 중요한 것은, 브롬 카세트의 다른 버전 Thy1 홍보 신경 특정을 포함 할 수있다omoter 또는 재하는 CAG (CMV) 프로모터를 표명했다. 브롬 트랜스 제닉 마우스 중 일부는 단일 브롬 형질 전환 유전자를 함유 할 수있는 동안 마지막으로, 다른하여 각 셀에서 발현되는 색상의 조합 가능성의 엄청난 수의 생산을 허용하는, 다중 트랜스 유전자 카피로 구성 될 수있다 (예 16 참조). 우리의 연구에서, 우리는 브롬 2.1 카세트 (21)를 포함하는 R26R - 색종이 마우스를 사용했다. Br2.1는 고유 Cre 호텔 - 중재 DNA 반전 때문에에 loxP 사이트 (그림 1)의 역수 방향뿐만 아니라 절개를 할 수 있도록 설계되었습니다. 따라서, 색 변화로 이어질 이러한 반전 / 절단 이벤트는 한 Cre 호텔 16 존재로 계속 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로, 유도 시간 Cre 호텔 발현 시스템은 안정적인 셀 추적 Br2.1을 사용을 위해 필수적이다. 도면에 도시 된 바와 같이. 1, Br2.1는에 loxP-측면 네오 R의 -casse 다음 유비쿼터스 CAG 프로모터를 포함전사 장애물 역할을 TTE는, 그 두 탠덤에 위치 노란색, 녹색, 4 형광 리포터 유전자, 인코딩 (GFP), (YFP), 적색 (RFP) 및 시안 (CFP) 형광 단백질,옵니다. 형광은 Cre 호텔 활성화 이전에 표시되지 않습니다. Cre 호텔 재조합 효소의 유도는 특정 세포에 4 형광 단백질 중 하나의 임의의 표현을 가능 R 네오 카세트의 제거를 야기한다. 두 번째 세그먼트에 loxP-측면 RFP와 반전 CFP을 포함하는 동안 첫 번째 세그먼트는,에 loxP-측면 GFP 및 반전 YFP가 포함되어 있습니다. 이러한 DNA 세그먼트는 연속 한 Cre 호텔 재조합 효소가 존재하는 바와 같이, (반대 방향 인에 loxP 사용) 반전, 또는 절제 될 수있다. 따라서, 과도하고 제어 Cre 호텔의 형질 전환 유전자를 사용해야합니다. YFP의 발현 및 RFP는 세포질이며, GFP는 핵이고 CFP는 세포막에 결합된다 Br2.1 카세트 위치 신호에 중첩 배출 구별하는 우수한 시스템을 제공한다. GFP및 RFP 배출량은 쉽게 기존의 형광 현미경으로 분리된다. YFP / GFP / CFP 배출을 분리하기 위해, 스펙트럼 공 초점 영상 시스템이 필요하다. 전부, Br2.1 카세트는 각 대상 셀에 1 ~ 4 중 별개의 형광 유전자의 무작위 유도하고, 조직 특이 적 발현을 할 수 있습니다. 컬러 조합의 더 큰 수 필요할 때 실제로, 하나 따라서 각 셀의 2 색 태그 식 및 (10)에 가능한 색 조합의 수를 높여 결과적 Br2.1 2 대립 유전자를 포함하는 동형 접합체 생쥐를 생성 할 수있다 카세트의 여러 복사본들이 유전체 (16)에 통합 된 이후 22. 브롬 마우스 균주의 일부는 가능한 색 조합의 더 큰 수의 표현을 가능하게한다. 그러나, 대부분의 경우, 하나의 대립 유전자 Br2.1 의해 제공된 네 가지 색상의 조합은 충분하다. 여기에 제공된 프로토콜에 따라, 하나는 spectr의 비교적 간단한 설치 프로그램을 사용하여이 방법을 설정할 수 있습니다교정 조금있는 경우 필요에 알 현미경. 여기에서 우리는 각막 상피​​의 혈통 추적 실험을 위해, 하나의 Br2.1 대립 유전자를 포함하는 R26R - 색종이 마우스의 사용에 대한 적응 프로토콜을 제공합니다. 이 트랜스 제닉 마우스 균주 결장 21,23 각막 상피 줄기 세포 (22, 24)의 원점과 거동을 연구에 사용 된, 및 국소 분절 사구체에서 신장 발 세포를 특성화 장암 25 줄기 세포 활성의 존재 (FSGS) 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette.</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>strain #013731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K14CreERT2 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>strain #005107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane USP Terrell</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprieve 30</td>
			<td>b.wt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>used at concentration of 4&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immu Mount</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage .</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed &#34;spectral fingerprinting&#34; enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratears-eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

최근에는 줄기 세포 및 각막 상피 (24)의 전구 세포의 기원, 생존 및 이주를 식별 목적. 증거를 축적하면 각막 상피​​는 각막 윤부 틈새 시장, 각막 주변에 링 모양의 지역에 독점적으로있는 줄기 세포가 재생되는 교리를 지원합니다. 이 이론은 시험 관내 및 생체 내 데이타에 의해, 그리고 성공적인 선구 윤부 줄기 세포 요법 27-29위한 기초를 제공 임상 증거에 의해지지된다. 그러나,이 주제는 매우 인해 마우스 윤부 각막 갱신 (30)에 참여하지 않는 것이 좋습니다 윤부 이식 실험을 기반으로 연구에 최근 몇 년 동안 논쟁 남아 있었다. 이 흥미로운 가설을 테스트하기 위해, R26R - 색종이 마우스를 실시했다 사용 혈통 추적 실험은 최대 120 일 (24)에 대한 정상 상태 조건에서 윤부 각막 상피 줄기 / 전구 세포의 운명을 따르십시오.눈을 적출하고 평탄한 장착 각막 10 120 일 타목시펜 주입을 게시 스펙트럼 공 초점 레이저 주사 현미경으로 형광 분석 하였다. 예상대로 각막 중심을 향해 윤부에서 연장 1-4개월 이상 (그림 2B, 24), 긴 줄무늬가 천천히 개발하면서, 형광 세포의 작은 산발적 클러스터는 10 일 주사 후 안구 표면에 걸쳐 관찰되었다. 이 결과는 각막은 각막의 중심을 향해 윤부 세포에서 마이그레이션에 의해 재생되는 것을 시사한다. 다음에, 부상 상태에서 각막 재생을 조사 하였다. 효율적인 세포 추적을 유도하면서 조건 하에서 부상 K14 양성 윤부 / 각막 세포의 운명을 시험하기 위해, 우리는 국소 적용시 각막 손상을 야기 디메틸 술폭 시드에 타목시펜 (DMSO)에 용해. 하나의 국소 적용 (그림 2C에게), 미주리 적용된 경우이 방법으로 우리는 가벼운 상처를 유도하기 위해 관리<html> 추가 DMSO 단독 치료가 타목시펜 유도 또는 DMSO 혼자 국소 타목시펜 유도 이전에 2 연속 일에 적용되었다 심한 상처 전날에 적용된 경우 부상 레이팅. 천천히 개발되고 정상 상태 조건 하에서 4개월 내의 각막 중심에 도달 얇은 줄무늬 윤부 달리 손상 후 세포의 이동이 빨랐다. 놀랍게도, 길고 두꺼운 각막 윤부 줄무늬는 이미 7 일 이내에 이러한 조건에서 개발되었다. 흥미롭게도, 색상의 다양성은 종종 최소 (도 2D)이었다. 우리의 손에, 때때로, 주로 적혈구 특정 형광 편중 될 수 색상의 다양성을 나타내는, 전체 각막에 확인되었다. Br1.0L 31 및 21 Br2.1 이전에보고 된이 불필요한 바이어스 용량 반응 시험에 의해 교정 될 수있다. 레 / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; R26R - 색종이 구조 그림 1. 도식입니다. (A) R26R - 색종이 구조가 높은 발현 수준에 대한 CAG 프로모터를 포함에 loxP (검은 색 삼각형)는 네오 R의 -roadblock 및 Rosa26의 궤적 16,21에서 Brainbow2.1 카세트를 -flanked. Brainbow2.1 카세트는 두 개의 머리 - 꼬리에 loxP-측면 이량 체를 포함한다. 한 이량 체는 핵 지역화 된 녹색 형광 단백질 (GFP)과 역 중심의 세포질 노란색 형광 단백질 (- PFY 반전 방향이 지정되어 YFP)로 구성되어 있습니다. 16 - 두 번째 이량 체는 세포질 RFP 및 역 중심의 막 닿는 시안 형광 단백질 (PFC 반전 방향이 지정되어 CFP 등)이 포함되어 있습니다. (B - E) Cre 호텔 - 재조합 효소 활성화되면, 다른 절제와 반전 이벤트가 발생할 수 있습니다; 가능한 결과는 exemplifi 있습니다B의 ED - E. Cre 호텔 활동 따라서 유전자 제거 및 / 또는 역전 4 개의 형광 단백질 중 하나의 랜덤 식의 결과로 이어지는 카세트의 확률 재 배열을 유도한다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> 그림 2. 항상성 및 부상에서 추적 각막 혈통. R26R-색종이 / 프로토콜에 자세히 K14-Cre 호텔 마우스는 4 mg의 타목시펜 주사 하였다. (A - B) 지점을 게시 지정된 시간에 유도는 각막이 몇 군데 있었다 평평. Cre 호텔 유도 결합 각막 상처가 DMSO에 용해 타목시펜의 국소 적용에 의해 달성되었다 (C - D). 모자이크 화상을 얻을스펙트럼 공 초점 현미경을 타일링 멀티 채널으로 표시됩니다 (- D). 항상성, 슬로우 마이그레이션 세포의 방사상 각막 윤부 줄무늬 윤부 각막 중심 사이의 확장. 이 줄무늬 4-5 개월 (B) 내에서 각막 중심에 도달, 천천히 개발했다. 각막 세포의 클러스터뿐만 아니라 (흰색 화살표, B) 분명했다. 반면에, 큰 윤부 줄무늬가 상처를 입는 조건 (C)에서 하나의 주일 이내에 나타났다. 적혈구 (D)으로 컬러 다양성의 바이어스에 대한 예. 윤부 - 각막 테두리 점선으로 주석된다. 스케일 바는 500 μm의입니다. 요약 : CFP, 시안 형광 단백질; GFP, 녹색 형광 단백질; RFP, 적색 형광 단백질; YFP, 노란색 형광 단백질. 이 수치가 24에서 수정되었습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice at JoVE.com

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

a-method-for-lineage-tracing-corneal-cells-using-multi-color

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.3K 조회수.  Israel Institute of Technology. In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

비디오: A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

연구

발생학

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...