This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.

모든 프로토콜을 검토하고 텍사스 A &amp; 치과 M 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 동물 사육 <ol><li> 이 연구에서 세 동물 모델을 사용합니다. 먼저 사용 Col10a1-Cre 호텔 15 쥐 외과 형성의 배아 연골 세포의 운명을 조사하고 Rosa26 tdTomato로 교차합니다 (B6, 129S6- GT는 (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) 마우스를 Col10a1-를 얻기 위해 CRE와 Rosa26 tdTomato 쥐. 다음으로, 2.3Col1a1-GFP 마우스 16이 쥐를 교차. Col10a1-Cre 호텔을 사용합니다; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP 마우스는 셀 혈통 추적 실험 (그림 1B)를 수행 할 수 있습니다. </li><li> 출생 후 연골 세포의 운명을 연구하기 위해, 단계 1.1에서와 동일한 절차를 수행하지만, Aggrecan-CRE의 ERT2 (AGG-Cre 호텔 ERT2를 사용) 17, 18 라인과 AGG-Cre 호텔 ERT2을 유지; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP 마우스는 세포 계보 추적 실험 (도 1C)을 수행한다. 생후 14 일에 타목시펜을 주입한다. </li><li> 면역과 기술을 추적 세포 혈통을 결합하려면, AGG-Cre 호텔 ERT2 마우스와 Rosa26 tdTomato 마우스를 교차. 실험에 모두 유전자를 가지고 마우스를 사용하여 출생 후 3 일 (그림 1D)에 타목시펜을 주입. </li></ol> 2. 재료 준비 <ol><li> 10 ㎎ / ㎖의 농도에서 10 % 에탄올 및 90 % 옥수수 유에서 타목시펜 분말을 녹인다. 주사 투여 량은 75 ㎎ / ㎏이다. </li><li> 7.4의 pH 값을 조정하기 위해 2 M 나트륨 수화물을 사용하여 4 %의 농도로 PBS에 파라 포름 알데히드 (PFA) 분말을 녹인다. 희생 후 조직 (하악 외과와 뒷다리가 여기에 사용되는)를 해결하기 위해 4 % PFA 솔루션을 사용합니다. 때문에 자사의독성, 장갑과 안면 마스크와 후드에 PFA를 처리합니다. </li><li> 7.4의 pH 값을 조정하기 위해 2 M 나트륨 수화물을 사용하여 10 %의 농도로 증류수에 EDTA 분말을 녹인다. 하악 외과와 뒷다리를 석회 10 %의 EDTA를 사용합니다. </li><li> 15 %와 30 %의 농도로 PBS에서 자당 분말을 녹여. 탈회 후 조직을 탈수 자당 솔루션을 사용합니다. </li><li> 2 ㎎ / ㎖, pH 5.0으로의 농도로 PBS에 히알루 분말을 녹인다. 이 솔루션은 면역 항원 검색을위한 것입니다. </li><li> Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 20 %의 염소 혈청이 포함 된 차단 용액을 제조 1.5mL 용량 튜브를 사용한다. </li><li> Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 2 % 염소 혈청을 포함하는 일차 항체 용액을 제조 1.5mL 용량 튜브를 사용한다. Runx2 400 및 1 : 100 DMP1 대한 일차 항체의 농도는 1이다. </li><li> 제조 1.5 ㎖의 튜브를 사용하여거짓 긍정적 인 결과를 피하기 위해 면역 염색에 대한 제어와 토끼 IgG의 솔루션입니다. 이 솔루션은 PBS의 2 % 염소 혈청이 포함되어 있습니다. Runx2 제어 토끼 IgG의 농도는 1 : 400; 100 : DMP1, 1. 동시에 실험 및 제어 염색을 수행합니다. </li><li> Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 2 % 염소 혈청을 포함하는 이차 항체 용액을 제조 1.5 ㎖의 튜브를 사용한다. 500 : 1의 희석에 차 항체를 사용합니다. </li></ol> 3. 슬라이드 공 초점 현미경을위한 준비 (만 추적 휴대 리니지, 면역 형광 아니오 조합) <ol><li> 유리한 시점에서 AGG-CRE ERT2 마우스에서 타목시펜을 주입한다. <ol><li> 첫째, 케이지에서 마우스를 제거합니다. 그런 다음, 복부를 노출, 마우스의 뒷면에있는 피부를 잡아 뒤집 왼쪽 엄지와 검지 손가락을 사용합니다. 주사기를 잡고 오른손을 사용합니다. 주입을위한 최적의 엔트리 포인트는 L에EFT 또는 hypogastrium의 오른쪽, 간 및 방광을 피하는. </li><li> 마우스의 뒷다리에 주사기 평행을 유지하고 복강 주사. 주사 투여 량은 75 ㎎ / ㎏이다. 각각 18g - 9g, 11 - - 13g, 16 이주 3 주, 그리고 옛 사주의 나이에 마우스의 무게는 약 7이다. </li></ol></li><li> 크 실라 / Ketaset 조합으로 쥐를 마취. <ol><li> 작동 용액을 제조하기 위해, 각각 제 1 ㎎ / ㎖, 5 ㎎ / ㎖의 농도로 증류수 및 크 실라 Ketaset 희석. 이 비율 다음으로, (1)의 크 실라와 Ketaset 섞는다. 주사 투여 량은 30 μL / g이다. </li><li> 단계 3.1에서와 같이 주입한다. 마우스의 발목을 곤란하게하여 마취를 확인합니다. 그것은 아무 반응이없는 경우 마우스가 의식이다. </li></ol></li><li> 마취 후 4 % PFA와 마우스를 관류. <ol><li> 마우스가 의식을 잃게 한 후, entirel하기 위해 보드에 마우스의 4 개의 다리를 고정y는 복부를 노출합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 포화 중간 선을 따라 목에 하복부에서 절제를합니다. 복막 멤브레인을 나타 내기 위해 측면에 피부를 당겨 동시에 핀치합니다. 길이 절단을 만들기 위해 해부 가위를 사용합니다. </li><li> 잘라와 마음을 노출 전면 갈비뼈를 제거합니다. 오른쪽 귓바퀴에 슬롯을 잘라 동시에, 22 G 주사기와 좌심실에서 심장에 구멍 주사기를 개최합니다. </li><li> 천천히 심혈을 따라 관류하는 4 % PFA를 주입하는 동안 오른쪽 귓바퀴에서 컷 아웃 혈액 플러시. 관류를위한 PFA의 부피 1 ㎖ / g이다. 하드 덕트 건물의 배기 시스템에있는 클래스 I의 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다. </li></ol></li><li> 마우스의 피부를 벗겨 및 4 ℃에서 하룻밤 해결하기 위해 4 % PFA 40 ml에 포함 된 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 몸 전체를 넣어. </li><li>조심스럽게 몸에서 하악과 뒷다리를 제거하는 해부 가위와 # 3, # 5 집게를 사용하여 표면에 근육과 힘줄을 제거 할 수 있습니다. 하드 덕트 건물의 배기 시스템에있는 클래스 I의 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다. </li><li> 세 번째 몰의 말단 부위에 두 개의 조각으로 하악을 잘라. 마찬가지로, 탈회를 가속화하기 위해 골수 공동을 노출 간부의 대퇴골과 경골을 자른다. 외과와 과두 과정을 포함하는 부분을 넣고 10 % EDTA의 40 ㎖의에 뒷다리와 함께 2 4 ° C에서 석회하기 - 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 사일. </li><li> 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 4 ° C에서 외과 하룻밤 뒷다리를 탈수 15 % 자당의 50 ㎖를 사용합니다. </li><li> 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에서 밤새 4 ° C에서 외과와 뒷다리를 탈수 30 % 자당을 사용합니다. </li><li> 시상면 함께 샘플을 포함동결 절단 (Cryosections) 기계의 절삭 접시에 10월 <ol><li> 수평 외과 또는 설치 금형의 뒷다리를하다. OCT에서 조직을 잠수함과 OCT를 정지 할 때까지 동결 절단 (Cryosections) 기계에 둡니다. </li><li> 절단 접시에 OCT의 블록을 탑재합니다. OCT를 완전히 얼어 붙은 있는지 확인하기 위해 절단하기 전에 약 15 분 동안 기다립니다. </li></ol></li><li> 10 μm의 섹션으로 외과와 뒷다리를 잘라. -20 ° C에서 슬라이드 및 저장에 섹션을 수집합니다. </li><li> 염색하기 전에 물을 제거하기 위해 37 °의 C 챔버 슬라이드를 부화. </li><li> 5 분 동안 증류수로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 각 섹션 주위에 물을 닦아냅니다. 섹션을 원과 원에 DAPI 또는 비 형광 안티 - 페이드 장착 솔루션을 드롭 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 조심스럽게 커버 슬립을 누워. </li></ol> Runx2와 DMP1 4. 면역 조직 화학 염색 참고 : IgG의 콘면역 조직 화학 염색이 거짓 양성 신호를 방지하기 위해 트롤이 필요합니다. 실험 및 대조군에 대한 염색은 동시에 수행 될 필요가있다. <ol><li> 염색하기 전에 물을 제거하기 위해 37 °의 C 챔버 슬라이드를 부화. </li><li> 증류수로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드의 모든 부분에 동그라미를하는 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 이 단계에서 완전히 섹션을 다루 원에 준비된 솔루션을 모두 추가 할 수 있습니다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C에서 습기 챔버에서 히알루와 섹션을 처리합니다. (단계 4.5 - 4.8) 용액의 부피는 부분의 크기에 의존한다. 긴 뼈의 외과 용 용액 50 ㎕를 100 μl를 사용합니다. (0.1 % 함유 PBS 트윈 20) PBST로 3 회 씻는다. </li><li> 준비하고 각 섹션에 블로킹 용액을 적용하고, 실온에서 1 시간 동안 습윤 챔버에이를 부화. </li><li> 차와 섹션을 품어밤새 4 ° C에서 항체 용액 (토끼 항 - 마우스의 Runx2, 또는 토끼 항 - 마우스 DMP1). PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 차 항체 용액 (염소 항 - 토끼 알렉사 형석 488)와 섹션을 인큐베이션. PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 절 주위에 물을 닦아 슬라이드 섹션을 다루 원에 DAPI 놓습니다. 조심스럽게 커버 슬립을 누워. </li></ol> 5. 공 초점 현미경 <ol><li> 488 μm의 (녹색)에서 561 μm의 (적색)에 이르기까지 다양한 파장에서 공 초점 현미경을 사용하여 형광 세포 이미지를 캡처합니다. 10X, 20X 및 63X 렌즈를 사용하여 19 200 Hz에서 여러 누적 된 이미지를 가지고 (1,024 × 1,024의 치수). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

기술적 한계로 인해, 생체 내에서 세포의 거동을 조사하는 것이 어렵다. 그러나, 셀 혈통 추적 기술은 세포 생물학 7-9을 연구하기위한 강력한 도구로 증명된다. 본 연구에서는 상기 면역과 조합하여 프로토콜을 향상시킨다. 이러한 방식으로, 세포 운명 리니지 추적의 적용을 넓혀 연관된 여러 마커에 의해 정의 될 수있다. 또한, 면역, 토마토 신호의이 공동 현지화 동시에 단독으로 ...

개발하는 동안, 연골 내 골 형성의 골격 체적의 80 % 이상을 차지한다. 널리은 비대 연골 세포의 사멸로 시작하는 것으로 생각된다. 그 후, 기본 골수의 세포 침입과 뼈 marrow- 및 골막 유래 세포 1,2에 의해 새로운 뼈 증착 다음에 혈관 신생을 시작합니다. 비대 연골 세포 운명 HCS ()는, 그러나, 수십 년 3 논쟁의 문제였다. 초기의 HC는 연골 세포 분화 경로의 종료로 간주하고, 일반적으로 아폽토시스의 HC의 궁극적 운명 것으로 생각되었다. 지금, 일부 연구자들은 적어도 일부의 HC가 살아남을 수 및 연골 뼈 형성에 기여하는 것이 좋습니다. 그들이 그 성장을 제안했지만 판 연골 세포는 미세 구조, 면역 조직 화학 염색을 기반으로 조골 세포에 transdifferentiate 수있는 능력을 가지고 있었고, 시험 관내에서, 46이 방법 w 전혀 연구되지조골 세포 계보에 연골 세포의 기여를 입증에 결정적인 감수해야. 셀 혈통 추적 기술은 세포의 운명을 연구하는보다 엄격한 방법을 제공합니다. 간단히 말하자면, 오직 셀의 특정 유형에서 발현되는 재조합 효소, 리포터 유전자의 발현을 자극한다. 이러한 방식으로,이 세포의 종류와 그 후손 영구적 7로 표시된다. Cre 호텔-에 loxP 시스템은 일반적으로 혈통 추적에 사용됩니다. CRE (재조합 효소 효소) 둘에 loxP 부위 사이 STOP 서열을 절제하고 특정 세포주 (도 1a)에서 리포터를 활성화한다. 일부의 경우, 연구자는 에스트로겐 수용체 (Cre 호텔 ERT2) (8)의 수정 된 형태로 융합 Cre 호텔을 일으키는 등 타목시펜과 같은 약물을 사용하여 Cre 호텔을 활성화 유리한 시점을 선택할 수 있습니다. 형광 기자는 극적으로 복잡성을 줄일 수 있기 때문에 실험을 추적 혈통의 표준이되었다및 8,9 추적 세포 운명의 정확성과 효율성을 향상시킨다. 그것은 쉽게 7 (도 1A)를 시각화하게 밝은 형광 단백질과 강한 표면 형광을 갖기 때문에 tdTomato 형광 리포터 중에서 최상의 선택되고있다. 시스템을 추적 Rosa26 tdTomato 계보를 사용하여, 우리 그룹과 다른 연구자의 HC 개발 10-14 동안 뼈 세포로 자신의 표현형을 변경할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 2.3Col1a1-GFP (조골 세포에 특정)과 면역 (뼈 세포에 특정) :이 작업을 수행하기 위해, 우리는 Rosa26의 tdtomato (유비쿼터스 식 모든 셀에서) / Cre 호텔 (연골 세포에 특정) 마우스와 조합을 추적하는 두 세트를 개발했다. 데이터는 두 가지 방법이 생체 내에서 세포의 운명을 연구하는 가능한 방법이라는 것을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tamoxifen&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T5648</td>
			<td style="width:496px;">activate the Cre event&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fix the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10713</td>
			<td>decalcify the hard tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td>dehydrate the tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>retrieve antigen for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A3059</td>
			<td>blocking solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">primary antibody for Runx2&#160;</td>
			<td>Cell Signal</td>
			<td>D1L7F</td>
			<td>primary antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">primary antibody for DMP1</td>
			<td style="width:220px;">provided by Dr. Chunlin Qin</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>primary antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">18140</td>
			<td>control for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>second antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>embed the sample for frozen section</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>PBST</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">non-fluorescing antifade mountant</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td>mounting slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td>nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>circle the section on the slide for for immunochemical staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine</td>
			<td style="width:220px;">AnaSed</td>
			<td></td>
			<td>anesthetization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaset&#160;</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>anesthetization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">cryosection machine</td>
			<td style="width:220px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:220px;">Leica</td>
			<td>DM6000 CFS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-localization of cell lineage markers and the tomato signal

셀 혈통 추적 시스템이 발달 생물학 연구에서 주로 사용되어왔다. Cre 호텔 재조합 효소의 사용은 특정 세포주 모든 자손의 리포터의 활성을 허용한다. 여기, 우리가 연골 세포를 직접 긴 뼈와 Cre 호텔, Col10a1-Cre 호텔과 Aggrecan-Cre 호텔 ERT2 (AGG-Cre 호텔 ERT2) 두 종류를 사용하여 하악 외과 개발 과정에서 조골 세포와 골 세포로 변형을 입증하는 기술을 추적 세포 혈통을 사용 Rosa26 교차 tdTomato. Col10과 aggrecan 모두 연골 세포에 대한 마커를 잘 인식하고 있습니다. 이를 바탕으로, 우리는 특정 세포 마커의 발현을 면역 형광 분석하여 정의 간 세포 운명과 함께 추적하는 새로운 방법 세포 계보를 개발했다. Runx2 (초기 단계의 조골 세포에 대한 마커) 및 상아질 매트릭스 protein1 (DMP1; 말기 조골 세포 마커) 있었다연골 유래 뼈 세포 및 분화 상태를 식별하는 데 사용된다. 이 조합은 셀의 혈통 추적의 적용을 넓혀, 또한 화합물 마우스의 생성을 간소화 아닙니다. 더 중요한 것은, 부모 세포 자손의 수, 위치 및 분화 상태는 단독으로 추적 세포 혈통보다 더 많은 정보를 제공하는 동시에 표시됩니다. 결론적으로, 셀 혈통 추적 기술과 면역의 공동 응용 프로그램은 생체 내에서 세포 생물학을 조사하기위한 강력한 도구입니다.

연골 세포는 직접 하악 외과와 긴 뼈의 뼈 세포 (조골 세포와 골 세포)로 변환. Aggrecan, 연골위한 중요한 유전자는 주로 조기 성숙 연골 세포 (18)로 표현된다. 그 결과, AGG-Cre 호텔 ERT2 연령 2 주에서 타목시펜의 주입; Rosa26 tdTomato 마우스는 모든 연골 세포와 자신의 딸 세?...

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Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

면역과 (조골 세포에 특정) 2.3Col1a1-GFP 하나 하나 (뼈 세포에 특정) : 우리는 두 / Cre 호텔이 마우스를 (특히 연골 세포에서 발현) (보편적으로 모든 세포에서 발현) Rosa26의 tdtomato의 조합을 추적 세트를 개발했다. 데이터는 골 연골 세포로의 직접적인 변환을 보여준다.

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

co-localization-of-cell-lineage-markers-and-the-tomato-signal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K 조회수.  Texas A&M University College of Dentistry.  면역과 (조골 세포에 특정) 2.3Col1a1-GFP 하나 하나 (뼈 세포에 특정) : 우리는 두 / Cre 호텔이 마우스를 (특히 연골 세포에서 발현) (보편적으로 모든 세포에서 발현) Rosa26의 tdtomato의 조합을 추적 세트를 개발했다. 데이터는 골 연골 세포로의 직접적인 변환을 보여준다. 

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Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

연구

발생학

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

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SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

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단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

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라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기