RSF has received funding from the European Union's - Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n&#176; 618432 &#8211; MC&#8212;Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).

倫理声明は、本研究の動物のケアと使用時には眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠しました。全ての実験は、地元の倫理委員会によって承認されました。 1.適したCreリコンビナーゼを発現するマウス系統を選択してください<ol><li>購入26、調査対象の標的組織に依存ために利用可能なのCreトランスジェニック株の多種多様のうち、Creリコンビナーゼ遺伝子が目的の組織に特異的なプロモーターによって制御されるのCreトランスジェニックマウス系統を選択します。ケースでは時間的な制御が必要とされ、誘導性のCreラインを選択します。 注意：我々は、具体的には24角膜縁と角膜上皮幹/前駆細胞を標識するタモキシフェン誘導K14-CreをERT導入遺伝子を選択しました。ディジローラモと同僚が自分のK1のためのない角膜輪部式で特異性を報告したように、菌株間の違いがあるかもしれないことに注意してください4-CreをERT 22。誘導可能なトランスジェニックCreマウスを使用する利点は、多用途の時間枠でのトレース系統の誘導を可能にすることです。 </li></ol> 2.適当なBrのマウス系統を選択してください<ol><li>研究課題と利用できるのCreライン16,18,20に応じて適切なBrのカセットを選択してください。 <ol><li>非誘導のCreマウス系統を使用する場合は、連続したDNA反転/切除を可能にするため、16（例えばBr1.0またはBr1.1用）デッドエンド製品を生じないBrのカセットを選択します。 </li></ol></li></ol> 3.金利のクロストランスジェニック系統<ol><li>ここに示されているプロトコルでは、ヘミ接合子孫を得るために、ホモ接合性のCre ERT株 （CRE ERT / CreをERT）とホモ接合R26R-紙吹雪株（Br2.1 / Br2.1）を横切る（Br2.1 / +;のCre / +）モノ対立遺伝子、それらすべてが単一のBr2.1対立遺伝子を含むので、トレース系統との準備ができていること単一のCre対立。 注：1は、2つのCre対立遺伝子（Br2.1 / +;のCre / Creを）が含まれているマウスを作製することができ、標識の効率を向上させるために、しばらく2 Br2.1対立遺伝子（Br2.1 / Br2.1;のCre / +）だろう（22で詳述）色の組み合わせを増やします。 </li></ol> 4.のCreリコンビナーゼ誘導注：これらの実験におけるタモキシフェンの投与は角膜縁と角膜の基礎のK14陽性幹細胞/前駆細胞の核内にCreをERTリコンビナーゼの転位を誘導するために、3〜4日の期間、毎日腹腔内注射することにより行いました上皮細胞。以下のプロトコルは、4匹のマウスの注射のために使用することができます。また、眼表面へのタモキシフェンの局所適用は、より高い効率が得られます。タモキシフェン溶液は、1週間まで4℃で暗所に保管することができます。使用前の溶液を温め。 <ol><li>タモキシフェン100mgを秤量し、コーン油を5mlにそれを溶解します20 mg / mlのタモキシフェン溶液を形成します。 </li><li> 3-4日間連続して8週齢のマウスの腹腔内にタモキシフェン（4 mg）を溶液200μlを注入します。 注：タモキシフェン溶液を1週間まで4℃で暗所に保管することができます。使用前の溶液を温め。 </li><li>局所適用のためにタモキシフェンの60ミリグラムを秤量し、60 mg / mlのタモキシフェン溶液を形成するコーン油1ml中に溶解します。 65に維持振盪水浴中の溶液をボルテックスし、設定 それは使用するまで浴にそれを残す透明になるまでC°。 <ol><li>マウスの各眼表面にタモキシフェン溶液100μlを慎重に適用されます。 </li></ol></li></ol>イメージング5.組織調製<ol><li>タモキシフェン注射とCOL後の適切な時点でのCO 2吸入が続くイソフルラン（酸素中で気化2％）麻酔を（反射の欠如によって適切な麻酔を確認する）を使用して、犠牲の動物関連する組織をLECT。 <ol><li>これらの実験のために、次の時点で目を摘出：1、4、8、12、及び16週間後のタモキシフェン注射。曲がったピンセットを使用して摘出を実現。眼球が眼窩から飛び出すせるまぶたを押します。視神経を保持している眼球の後ろに鉗子を置きます。静かに眼球を引き、それを取り外します。 注：以下に述べるように、この段階では、組織は、標識された細胞のホールマウント分析のために調製することができます。正規の凍結組織切片は、（セクション6および22を参照）、調製PFAで固定し、下記のように画像化することができます。 </li></ol></li><li> PBSで満たされた60ミリメートル皿にそれぞれの目を配置します。 </li><li>ステレオ顕微鏡下で使用して鉗子は、角膜を下に向けて視神経の近くに目を保持し、視神経、筋肉や結合組織を除去し、眼の後方部分に小さな切開を作るためにメスを使用しています。 </li><li>春のはさみを使用して、慎重に拡大しますレンズが飛び出すとピンセットを用いて、虹彩を削除させるカット。 </li><li>メスを用いて周辺に向かって中心から始まる4-5放射状の切開を行うことで、角膜を平らに。 </li><li>角膜輪部を超えて過剰周辺組織を切断するためにメスを使用してください。 </li><li>その後、簡単にPBSでそれらを洗浄し、10分間、4％PFAで角膜を修正。 </li><li> 10分間DAPIでサンプルをインキュベートし、簡単に、PBSで洗浄します。 </li><li>上皮側を上に向けてスライドガラス上にマウント角膜。角膜の上に取り付けメディアのドロップを置き、カバーガラスでカバーしています。スライドは、RT中のO / Nを乾燥させます。 4℃でスライドしてください。 </li></ol> 6.共焦点顕微鏡およびイメージング解析<ol><li> YFP / GFP / CFPの排出量の分離を可能にするスペクトル共焦点システムを使用してください。 Brのカセットの蛍光タンパク質に応じて蛍光励起および発光波長を設定します。交差を最小化を目指して、各タンパク質に最も適した励起波長を選択します励起。異なるタンパク質からの信号の漏れを最小限に抑えるために、狭い発光範囲を選択します。 <ol><li> Br2.1カセットの場合は、出発点として、蛍光励起（EX）と発光（EM）の設定次のコマンドを使用します。DAPI - EXの405nm /全角420から480 nmで、CFP - EX 458ナノメートル/全角470から500 NM、GFP - 元の488nm /全角497から508 nmのYFP - EX 514ナノメートル/全角529から540 nmであり、RFP - EX 561ナノメートル/全角575から615 nmの。 </li></ol></li><li>高解像度で大きな組織領域を可視化するために、タイル画像を取得します。 図2A-Bに示す結果、12×12画像の配列を取得することにより、画像全体の角膜の場合、 すなわち、各分野の4蛍光チャネルを使用して144フィールド（512×512）を取得します。全部で576の画像を収集して、マージします。 </li><li>組織の異なる深さや構造でタグ付けされた細胞の局在を調べるために、関心の異なる領域のZスタック画像を取得します。オーダーTにO画像角膜の完全な深さは、3μmの間隔で8光学切片を取得。最大強度に基づいて画像投影並びに収集部の直交するビューは、従来の撮像ソフトウェア24を用いて構成することができます 。 </li></ol>タモキシフェン誘導7.角膜損傷コンバインド<ol><li>イソフルランでマウスを麻酔（酸素で気化2％）および鎮痛薬投与（10mg / kgのCarpofenを、皮下注射）。つま先ピンチに無反応によって適切な麻酔を確認してください。 </li><li>タモキシフェン粉末1gを秤量し、200 mg / mlの濃度の溶液を生成するために、滅菌DMSO 5ml中に溶解します。 </li><li>溶液が透明になるまで水浴中で65℃にタモキシフェン溶液を温めます。使用するまで浴に解決してください。 </li><li>麻酔中の脱水を防ぐために、未処理の反対側の眼に眼軟膏を適用します。それは十分な詐欺を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨の横臥位を維持するためにsciousness。完全に回復するまで、他のマウスの会社に負傷目を受けたマウスを返さないでください。マウスは密接に損傷後の監視する必要があります。彼らの体重の10％以上を失った場合に、角膜びらん、または不快に苦しんで、実験を停止しなければなりません。繰り返し鎮痛薬投与実験全体を通して24時間ごと。 </li><li>それに取り付けられた針なし、無菌注射器を使用しました。各マウスの一方の眼の全角膜表面上で局所的に200μlのタモキシフェンソリューションを適用します。 注：溶液を室温で眼の表面に速やかに固化します。角膜損傷の効果は、創傷の重症度に依存します。タモキシフェン/ DMSO溶液の1つの適用に続いて何の悪影響はマウスで観察されていません。反復適用角膜混濁の場合に観察することができます。 </li><li>組織調製およびイメージングを続行（宗派を見ます該当する時点でイオン5及び6）。 1週間後の創傷（ 図2および24）（ステージ5.1で説明するように）ここに示す結果は、マウスを犠牲にするために。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

リネージュトレース実験は、長年にわたって行われてきました。最近の技術の向上と紙吹雪のマウス株の出現は、研究のための新たな道を開きました。現在、研究者らは、市販の組織特異的Creをライン、ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスの多くの恩恵を受けることができます。これは、堅牢で信頼性の高いデータを提供しながら、骨の折れる練習を回避し、基本的な専門知識を持つ科学的問題に対処するための多彩な実験系を設計するための機会を提供します。 R26R-紙吹雪マウスは、効率的な追跡および生体内の細胞の性質や挙動を研究するためのエレガントなツールです。システムが確立するのは簡単であり、それは、胚発生の間に単一細胞の非侵襲的系譜トレースを可能にする幹細胞の再生を恒常性の下で、またはそのような損傷、炎症および癌などの異なる状況下で。入手データは、堅牢なDESCRIPTを提供定量化の方法で標的細胞、クローン細胞増殖および細胞遊走の生存のイオン。重要なステップは、確実に正確な発達段階で効率的な組織特異的標識を可能にすることができる適切な遺伝的マウス系統を選択することであろう。このシステムの1つの制限は、生体を監視するために、組織がアクセス可能で、透明でなければならないということです。同様に、生きている動物内の厚い組織を追跡するのみ二光子または多光子顕微鏡法によって容易にすることができます。しかし、細胞の追跡は、死後の組織切片上で可能であり、それはCLARITY方法32,33により透明になるように変換された後、おそらく無傷組織を研究することができます。考慮すべきもう一つの制限は、同じフルオロフォアを発現する隣接セルは、おそらく同じクローン系統に属しているが、それは彼らがランダムに同じ蛍光遺伝子を発現した独立した細胞起源に由来してもよいこともまた可能であることです。このpossibili多数の色の組み合わせを可能にするために、複数のBr対立遺伝子を使用した場合tyが非常ににくくなります。 将来的には、利用可能な遺伝子ツール（ すなわち、ノックアウト、ノックイントランスジェニックマウスモデル）と紙吹雪システムを組み合わせることにより、遺伝子と健康と病理学におけるその変異の研究を可能にします。同様に、異なるシステム摂動の下でトレース系統（すなわち、細胞ニッチの破壊、レーザー媒介細胞除去、薬物治療を幹）細胞の運命決定にシグナル伝達経路の関与に新たな洞察をもたらすでしょう。最終的には、蛍光および生物発光標識の組合せ使用は、シグナル伝達経路およびエッジ顕微鏡を切断する遺伝記者は、研究者が自分の母国の環境で周囲にどのように対応するか、単一の細胞を学習するための堅牢なシステムを提供します。

胚発生の間に、組織および器官の形態形成は、細胞増殖、細胞遊走および系統仕様1-4に関して説明することができる正確なプログラムを介して行われます。これらの生物学的プロセスは、細胞の再生幹必要成体組織の恒常性の維持に関与しています。リネージュトレース、細胞集団の特定のタイプの子孫の識別と追跡は、胚を研究し、細胞の恒常性幹ための重要なツールを提供します。実際、それは、ますます研究の多くの分野で使用されています。特に、系統のトレースは、恒常性と癌発生における幹細胞の起源と運命を特定するのに不可欠なツールとなりました。それは、細胞が細胞単離とは対照的に、かつインビトロ培養またはtransplantati に 、最小限の実験的介入で、無傷の組織または生物との関連でどのように動作するかについての基本的な情報を提供することができるためですその上で、不要なバイアスをもたらす可能性があります。 伝統的に、細胞の原形質膜に組み込むような脂溶性カルボシアニン染料としては、系統追跡のために使用しました。実験のこれらの種類が正常に発生生物学5,6に主要な発見や形状の精液概念につながっているが、それらは、標的細胞の特異性を制御する難しさ、細胞の挙動の色素の不要な影響や希釈などのいくつかの制限を持っていますラベルの時間。ヌクレオチドアナログラベリングアプローチは、おそらく幹細胞7,8を静止状態に対応する「ラベル保持細胞「スローサイクリングの存在を文書有効にしています。この技術は、限られた時間の期間にわたって増殖動態に基づいてスローサイクリング細胞の存在を実証することができながら、しかし、それは幹細胞の機能性に関する実質的な洞察を提供することができませんでした。最適な系譜トレースメタodologyはマークされた細胞、その子孫、またはその隣の性質上の標識の影響を最小限に抑える必要があります。加えて、ステージと、時間依存的な様式で、ならびに、単一の細胞（クローン）の方法で目的の細胞集団をタグ付けする能力を有すること、すなわち、標識誘導の制御を有することが有益であろう。ラベルは時間をかけて保持され、隣接セルに転送されないことになるように創始細胞のすべての子孫に渡され、安定かつ不可逆的な標識方法は重要です。 より最近では、細胞標識の遺伝的アプローチが開発されました。これらのシステムでは、細胞特異的プロモーターは、loxP隣接障害を除去し、例えば、緑色蛍光タンパク質またはΒガラクトシダーゼレポーター遺伝子9-13などのレポーター遺伝子の発現を可能にするために、Creリコンビナーゼの発現を誘発するために使用することができます。このアプローチだけでなく、細胞やその子孫の追跡を可能にするだけでなく、細胞であることが可能オレーションや分子特性。単一細胞レベルでの細胞の追跡は、単一の蛍光レポーター遺伝子の発現を誘導することにより可能となりました。このシステムの一つの重要な制約は、細胞の非常に低い割合が標識されている場合にのみ、個々のクローンを分離し、追跡することが可能であるという事実です。レポーターを使用することができ、この限界を克服するために、多色。多色標識を使用する場合は、同じニッチにおける隣接セルの差動運命の追跡を効率的に14-17を達成することができます。最近、Brainbow（BR）の対立遺伝子の多様性は、Cre / lox系を利用して、複数の蛍光レポーター遺伝子の確率的な発現を可能にする、系統トレーシング実験のために開発されました。 Cre / lox系が認識し、そのようなloxP部位として特定のDNA配列に結合するCreリコンビナーゼ酵素、から構成されています。以下のCreリコンビナーゼの結合は、部位特異的組換えが発生し、loxP配列の除去挟まれたシーケンスがresultin引き起こします種々の蛍光タンパク質の発現のランダムグラム（メカニズムを以下に説明します）。 Brのラインの様々な（レビュー16,18,19を参照してください ）使用できます。 Brの株の主な違いは、2（BR 2.0）、3（Br1.0）から4（Br1.1、Br2.1）蛍光遺伝子に至るまで、カセットに含まれる蛍光遺伝子の数（I）の違いを含めますこと、（ii）相互に向いlox部位の存在が使用lox部位の（iii）のタイプ、および（iv）式または蛍光遺伝子発現の沈黙の前のCre活性化に、遺伝子反転（Br2.0-2.1）を可能にします。最近設立されたB​​R3は、ニューロンの多色イメージングのための改良された方法を提供しています。この転写産物の主な特徴の一つは、最高級の神経細胞20を処理するのであっても染色を可能にする光安定ファルネシル化蛍光タンパク質の新しいセットが含まれていることです。 重要なことは、Brのカセットの異なるバージョンは、ニューロンの特定はThy1 PRを含んでいてもよいですomoterまたは偏在的CAG（CMV）プロモーターを表明しました。 Brのトランスジェニックマウスのいくつかは、単一のBr導入遺伝子を含有することができる一方で、最終的に、他の人がそれによって各細胞内で発現される色の組み合わせの可能性の膨大な数の生産を可能にする、複数の導入遺伝子のコピーからなってもよい（例えば、16を参照のこと）。 私たちの研究では、Brの2.1 カセット 21 を含んで R26R-紙吹雪のマウスを使用していました。 Br2.1は、一意のCre媒介DNA逆位と理由loxP部位（ 図1）の逆数の向きだけでなく切除を可能にするように設計されています。このように、色の変化につながるこれらの反転/切除イベントは限りのCreが16存在するとして継続することができます。そのため、一時的な誘導性Cre発現系はBr2.1を用いた信頼性の細胞追跡のために必須です。 図に示すように。 1、Br2.1はloxP隣接ネオR -casse続いユビキタスCAGプロモーターが含まれています転写の障害として作用するTTEは、それは、二つのタンデムに配置さ黄緑4蛍光レポーター遺伝子をコードする（GFP）、（YFP）、赤色（RFP）、シアン（CFP）蛍光タンパク質、が続きます。いいえ蛍光は、Creの活性化に先立って表現されていません。 Creリコンビナーゼの誘導は、所定の細胞に4蛍光タンパク質の一つのランダムな発現を可能にする新Rカセットの除去を引き起こします。第二のセグメントは、loxP隣接RFPと逆CFPが含まれていながら、最初のセグメントは、loxP隣接GFPと逆YFPが含まれています。これらのDNAセグメントは、連続している限り、Creリコンビナーゼが存在するように、（逆向きであるのloxPを使用して）、反転、または切除されてもよいです。したがって、一過性と制御のCre導入遺伝子を使用する必要があります。 Br2.1カセットは、信号位置に基づく重複の排出量とを区別するための優れたシステムを提供します：YFPおよびRFPの発現は、細胞質である、GFPが核であり、CFPは、細胞膜に結合されます。 GFPおよびRFPの排出が容易に従来の蛍光顕微鏡で分離されています。 YFP / GFP / CFPの排出を分離するために、スペクトル共焦点イメージングシステムが必要とされます。要するに、Br2.1カセットは、各標的細胞における4つの異なる蛍光遺伝子のうち1つ、ランダム誘導性、および組織特異的発現を可能にします。色の組み合わせの多数が必要とされるときに、実際には、一つは、このように各セルの2色タグの発現および10に可能な色の組み合わせの数を上げ、その結果、Br2.1の2対立遺伝子を含むホモ接合性のマウスを生成することができカセットの複数のコピーがそのゲノム16に統合されたので、22。Brのマウス系統の一部は、可能な色の組み合わせのはるかに多数の発現を可能にします。しかし、ほとんどの場合、単一Br2.1対立遺伝子によって設けられた4つの色の組み合わせで十分です。ここで提供されたプロトコルに続いて、一つはSPECTRの比較的簡単なセットアップを使用してこの方法を確立することができますキャリブレーションのための任意の必要がある場合はほとんどないとアル顕微鏡。 ここでは、角膜上皮の系譜トレース実験のために、単一Br2.1対立遺伝子を含んでR26R-紙吹雪マウスの使用に適合プロトコルを提供します。このトランスジェニックマウス株は、腸ガン25における幹細胞活性の存在を結腸21,23および角膜上皮幹細胞22,24の起源と運命を研究するため、ならびに巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）で腎臓足細胞を特徴付けるために使用されています17。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette.</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>strain #013731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K14CreERT2 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>strain #005107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane USP Terrell</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprieve 30</td>
			<td>b.wt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>used at concentration of 4&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immu Mount</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage .</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed &#34;spectral fingerprinting&#34; enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratears-eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

最近、我々は、幹細胞および角膜上皮24の前駆細胞の起源、生存および遊走を特定することを目的と。証拠を蓄積すると、角膜上皮が角膜縁ニッチ、角膜周辺部にリング状のゾーンに排他的に位置する幹細胞によって再生される教義をサポートしています。この理論は、 インビトロ およびインビボのデータであり、成功した先駆的な輪部幹細胞療法27-29の基礎を提供した臨床上の証拠によって支持されています。しかし、この話題は非常にマウスの角膜縁が角膜リニューアル30に参加していないことを示唆した輪部移植実験に基づく研究と近年の議論のままでした。この興味深い仮説を試験するために、R26R、紙ふぶきマウスを用いた系統トレース実験は、最大120日24定常状態下縁と角膜上皮幹/前駆細胞の運命を追跡するために、実施しました。眼を摘出し、フラットマウント角膜タモキシフェン噴射ポスト10および120日スペクトル共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡によって分析しました。予想されるようにしながら1-4ヶ月後（ 図2Bおよび24）、蛍光細胞の小さな散発的クラスターは、10日間の注射後に眼表面全体にゆっくりと開発した角膜中心に向かって輪部から延びる細長い筋が観察されました。この結果は、角膜は、角膜の中心に向かって縁から移動する細胞によって再生されることを示唆しています。次に、負傷の条件下で角膜再生を検討しました。効率的な細胞追跡を誘導しながら創傷条件下K14陽性輪部/角膜の細胞の運命を調べるために、我々は、局所適用の際に角膜損傷を引き起こすジメチルスルホキシド（DMSO）にタモキシフェンを溶解しました。単一の局所適用が適用された場合、我々は（ 図2C）、軽度の創傷を誘導するために管理このように、MO<html>追加のDMSO単独の治療はタモキシフェン誘導またはDMSO単独では局所的にタモキシフェン誘導する前に、2日間連続で適用した深刻な傷前日に適用された場合は負傷ディレーティング。 ゆっくりと開発され、定常状態の条件の下で4カ月以内に、角膜中央に達し薄い輪部のストライプとは対照的に、損傷後の細胞の移動は急速でした。注目すべきは、長くて太い輪部のストライプは、すでに7日以内に、これらの条件の下で開発されました。 興味深いことに、色の多様性は、（ 図2D）時には最小でした。我々の手では、時々、主に赤血球を、特定のフルオロフォアに向かって付勢することができる色の多様性を示し、全体の角膜で同定されました。 Br1.0L 31およびBr2.1 21において以前に報告されているように、この不要なバイアスは、用量応答試験によって較正することができます。 レ/ ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; 図1. R26R-紙吹雪 の模式図を 構築する。（A） R26R-紙吹雪構築物は高い発現レベルのためのCAGプロモーターを含む、loxP配列（黒三角）は、ネオのR -roadblockとRosa26遺伝子座16,21でBrainbow2.1カセットを-flanked。 Brainbow2.1カセットは2頭 - 尾loxP隣接二量体が含まれています。一つの二量体は、核局在緑色蛍光タンパク質（GFP）と逆向きの細胞質黄色蛍光タンパク質（ - PFY YFP、逆方向が指定されている）で構成されています。 16 - 2番目の二量体は、細胞質RFPと逆向きの膜係留シアン蛍光タンパク質（PFC逆向きが指定されたCFPを、）が含まれています。 （B - E）のCreリコンビナーゼの活性化の際に、異なる切除および反転イベントが発生する可能性があります。可能な結果がexemplifiですE - Bに編。 Cre活性は遺伝子の削除および/ ​​または逆位と4蛍光タンパク質の一つのランダムな表現でこのような結果につながるカセットの確率的な再配置を誘導する。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> 図2。 恒常性と傷害の下でトレース角膜系統。R26R-紙吹雪/ K14-Creマウスは、プロトコルで説明するように4 mgのタモキシフェンを注射しました。 （ - B A）点が投稿示された時間では誘導が角膜を画像化した平坦化。 Cre誘導に結合角膜創傷は（ - D C）DMSOに溶解したタモキシフェンの局所適用によって達成されました。モザイク画像を得ますスペクトル共焦点顕微鏡をタイルのマルチチャネルで示されている（A - D）。恒常性では、ゆっくりと移動する細胞の半径輪部のストライプは、角膜輪部と角膜中心部の間に延長しました。これらのストライプは、4-5ヶ月（B）内の角膜の中心に到達し、徐々に開発します。角膜細胞のクラスターは、ウェル（白矢印A、B）のように明らかでした。これとは対照的に、大きな輪部筋が負傷条件（C）の下で1週間以内に現れました。赤血球（D）に向けて、色の多様性のバイアスのための一例。輪部角膜の境界を破線で注釈されています。スケールバーは500μmです。略語：CFP、シアン蛍光タンパク質。 GFP、緑色蛍光タンパク質。 RFP、赤色蛍光タンパク質。 YFP、黄色蛍光タンパク質。この図は、24から変更されている。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a>この図。

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A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.3K ビュー.  Israel Institute of Technology. In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

ビデオ: A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

発生生物学

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

細胞系譜マーカーの共局在とトマト信号

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...