Name: assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
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This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

다음 프로토콜은 초기 내피 세포 이동의 조사 방법을 설명합니다. 혈관 내피 세포의 적절한 재배 내피 표현형의 적절한 증식과 유지 보수를 보장하기 위해 젤라틴과 세포 배양 플라스크의 사전 코팅이 필요합니다. 세포 배양 플라스크 1. 사전 코팅 <ol><li> 0.1 %의 최종 농도 0.1 M PBS에 젤라틴을 녹인다. </li><li> (자세한 내용은 특정 오토 클레이브의 지침을 참조하십시오) 액체 고압 증기 멸균에 대한 매개 변수를 사용하여 솔루션을 압력솥. </li><li> 무균 세포 배양 플라스크 (T25 세포 배양 용 플라스크 예, 적어도 5 ㎖)을 오토 클레이브 젤라틴 용액의 충분한 양을 추가한다. </li><li> 인큐베이터로 플라스크로 이동 (37 ℃, 5 % CO 2는 필요하지 않지만 방해하지 않는) 적어도 30 분 동안. </li><li> 나머지 젤라틴 용액을 제거합니다. 이후 사전 코팅 된 플라스크를 사용하십시오 (세포 배양) 또는 S사용할 때까지 무균 상태에서 찢었다. </li></ol> 초기 내피 세포의 2. 세포 배양 주 : 앞서 설명 된 바와 같이 10, 11, 배아 줄기 세포 유래의 초기 내피 세포 (EEC)를 PECAM-1 양성 세포 분획의 자기 활성화 세포 정렬하여 차별화 뮤린 배양체로부터 수득 하였다. <ol><li> DMEM에서 젤라틴 코팅 된 세포 배양 접시에 배양 EEC 15 % FCS, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 U로 보충 / ㎖ 스트렙토 마이신, 200 μM L- 글루타민, 100 μM의 ß 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산. 멸균 조건에서 세포를 처리합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 세포를 배양하고, 95 % 습도의 합류 부 (최대. 80 %)까지. </li><li> 5 비율 : 하위 합류, 1에서 세포를 분리. 참고 : 내피 세포의 박리가 중요한 단계입니다. <ol><li> RT의 accutase와 세포를 수확. 용지를 제거 PBS로 씻어 25cm 당 accutase 1 ㎖를 추가 <sup&gt; 2. </li><li> 세포가 분리 될 때까지 2 내지 10 분 동안 실온에서 플라스크를 인큐베이션. 세포를 분산하고 원하는 응용 프로그램으로 전송합니다. 참고 : accutase의 화학적 중화가 시드 세포는 37 ° C에서 인큐베이터에 저장됩니다 때 발생으로 필요하지 않습니다. 그러나 accutase 활동도 FCS 함유 DMEM을 첨가함으로써 감소 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 보이든 상공 회의소 주 : 보이든 챔버 분석은 8 ㎛의 공경을 갖는 광 불 투과 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 삽입 시스템을 사용하여 수행된다. <ol><li> 프리 코트를 적어도 30 분 동안 0.1 M PBS에 용해시킨 0.1 % 젤라틴의 500 μl를 첨가하여 필터 인서트 (따라서 보이 덴 챔버를 생성하는 세포 배양 웰 내부 그 착용감). </li><li> 세포 독성 화학 물질에 노출 될 경우, 세포를 수확하기 전에 특정 실험 디자인에 따라 노출. 주 : 세포 / ㎖ DMEM 12.5 μg의 클로 노출시켰다24 시간 동안. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 수확 EEC는 카운팅 셀 챔버를 이용하여 세포 수를 확인하고. 참고 : 자동 계산 장치를 사용할 수 있지만,주의하여 사용되어야한다 : 수동 세포 계수가 더 정확하며 강력히 추천된다. </li><li> 보이든 챔버의 하부 챔버 구획에 500 μL 세포 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 상부 챔버 구획에 필터를 삽입 당 500 μL 세포 배양 배지에서 정확히 10 4 EEC를 추가합니다. 거품을 제거합니다. </li><li> 정확히 8 시간 동안 인큐베이터에서 필터 삽입을 품어. </li><li> PBS로 한번 씻어 세포 고정 용 25 분 동안 두 구획에 0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 매체를 교체합니다. 광범위하게 필터를 세척하지만 0.1 M PBS로 3 회 이상. </li><li> 메스와 점막을 절제. </li><li> 핵 stainin에 대한 DAPI를 포함하는 설치 매체와 함께 두 개의 유리 커버 전표 사이의 막 마운트G. 방향에주의를 기울이십시오. 멤브레인의 낮은 구획쪽으로 마이그레이션 만 세포가 계산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 400X 배율 형광 현미경으로 막의 하부 구획실쪽으로 이주 셀 개수. 마이그레이션 세포 (그림 1A, 1B)와 막 모공을 혼동하지 마십시오. 생물 복제의 적절한 수 (조건 당 적어도 3 생물 복제)을 조사합니다. </li></ol> 4. 상처 치유 분석 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 라이브 세포 이미징에 적합한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 4cm의 유리 바닥 배양 접시에 적합) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 않습니다. </li><li> 멸균 10 μL 피펫 팁 단일 층을 긁어. 접시 표면에 너무 많은 압력없이 부드럽게 끝을 누르고 분리 된 세포를 제거하기 위해 0.1 M PBS로 세포를 두 번 other.Wash 한 측에서 원활하게 직선으로 이동합니다. </li><li> 배양 접시에 매체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 해당되는 경우, 조사해야 화합물을 추가합니다. 주 : 1.5 mL를 함유하는 배지 15 NG / ㎖ 알파 리놀렌산을 첨가 하였다. </li><li> 라이브 세포 이미징 할 수있는 현미경으로 배양 접시를 탑재합니다. 이산화탄소 5 %, 37 ° C와 가습 분위기를 확인합니다. 주 : 가습 매체 증발을 방지하는 것이 특히 중요하다. </li><li> 10 분 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 큰 파일 크기에 대한 계획. 주 : 512 X 512 픽셀의 해상도가 충분합니다; 그러나, 우리는 적어도 1,024 X 1,0의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다(24). </li><li> 오픈 소스 소프트웨어 (예를 ImageJ에) 현미경 구비 길이 소프트웨어 도구를 사용 = 24 시간 t = 0에서 시간 t와의 갭 폭을 측정하거나 사용한다. 참고 : 일반적으로 특정 이미지 수집 및 분석 소프트웨어의 제조업체에서 제공합니다. 따라서, 소프트웨어의 사용에 대한 기술적 인 세부 사항은 설명서를 참조하십시오. </li></ol> 5. 셀 추적 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 적합한 세포 배양 장치에 보충 DMEM에 5 × 104 EEC 시드 (예, 24 멀티 웰 플레이트), 37 ° C, 1-2 일 동안 95 %의 습도에서 5 % CO 2 세포를 배양. </li><li> 세포는 80까지 성장하는 경우%의 합류는, 각각의 시험 물질의 존재의 미디어와 문화를 새로운 매체를 사용하여 세포를 제거 (예를 들어, 12.5 μg의 클로 람 부실 / ㎖ DMEM). 항상 (개별 분석 시스템에 따라 24 시간)에서 일정 시간 동안 37 ° C에서 (용매, 예를 들면, 에탄올로 처리) 대조군 세포를 포함한다. </li><li> 라이브 세포 이미징 (37 ° C, 5 % CO 2, 95 % 습도) 가능한 현미경 배양 접시를 탑재. 미리 정의 된 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 10 분 간격으로 화상을 취득. </li><li> ImageJ에 플러그인 MTrackJ를 사용하여 수동으로 EEC의 추적을 수행합니다. 시야에서 무작위로 10 셀을 선택하고이 MTrackJ의 명령을 &quot;추가&quot;를 사용하여 시간에 포인트 당 데이터 포인트를 추가하여 그들의 움직임을 추적 할 수 있습니다. </li></ol> [. Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;] MTrackJ가에서 무료로 사용할 수 있습니다 및 ImageJ에는 availab입니다 참고 :[Rasband, ImageJ에. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]에서 제작 :. MTrackJ 플러그인에 대한 상세한 매뉴얼은 &quot;http://www.imagescience.org&quot;에서 확인할 수있다. 6. 라이브 세포 이미징 / 미토콘드리아 막의 평가 가능성 <ol><li> 적절한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 라이브 세포 이미징에 적합한 4cm의 유리 바닥 페트리 접시) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 마십시오. </li><li> 해당되는 경우, 화학 물질로 세포를 노출. 참고 : 세포는 24 시간 동안 12.5 μg의 / ㎖의 클로 람 부실에 노출되었다. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 테트라 메틸에 DMSO (TMRM)의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 빛으로부터 보호합니다. 주 : 원액 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> (: 1000 희석 1) 10 μM의 농도로 작동 용액 세포 배양 배지에 원액을 희석. 빛으로부터 보호가능한 한 빨리 사용한다. 주 : 작업 용액은 몇 시간 (&gt; 1 시간) 동안 실온에서 유지 될 수 있지만, 새로운 작동 용액의 조제 추천된다. </li><li> 1ml의 신선한 세포 배양 배지 (로딩 용액)로 작동 용액 2 μl를 추가. </li><li> 로딩 용액으로 세포 배양 배지로 대체하여 세포를로드. 37 ° C, 5 % CO 2 및 가습 분위기 (배양기)에서 15 분 동안 인큐베이션. 주의 : 거의 모든 형광 지표는 시간이 지남에 살아있는 세포 내 보낸; 따라서 오랜 로딩 또는 지연 분석을 피하십시오. </li><li> 세척하지 않고, 살아있는 세포 이미징에 적합한 현미경으로 접시를 놓습니다. 중요 : 형광 지표 따라서, 불필요한 빛 노출을 방지, 빛에 매우 민감하다. </li><li> 다른 이미지 사이의 비교를 위해 획득 파라미터를 변경하지 않고 이미지를 획득. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

독성 화학 물질에 대한 피부 노출은 종종 심한 상처 치유에 장애를 초래한다. 기본 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 상처 치유는 서로 다른 단계 (지혈, 염증, 증식 및 리모델링)로 구성된 복잡한 과정이다. 세포 이동은 그러나, 육아 조직의 형성에 가장 중요하고, 모든 단계에 관여한다. 여기서, 새로운 혈관은 혈관 형성 또는 angio- 의해 하나 형성된다. 두 과정은 전구체 및...

세포 이동은 피부 손상 후 개발, 각종 질병 및 상처 치유 등 많은 생리 및 병리 생리 학적 과정에 중요하다. 피부 손상에 따라, 염증은 손상 또는 괴사 조직과 육아 드라이브를 예비 상처 봉합을 제거하고 혈관 생성을 통해 새로운 모세 혈관의 네트워크 형성 (소설 형성) 또는 혈관 신생 (기존 소포의 발아) 1-3 수 있습니다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 이동을 필요로한다. 혈관의 네트워크가 증가하는 궁극적 각질화를 받아야 각질 세포 증식에​​ 산소와 영양분을 운반하는 것이 필수적이며, 새로운 상피를 형성하고 상처 봉합을 제공한다. 내피 세포의 손상 마이그레이션 장애 4,5 상처 치유의 근본 원인이다. 초기 내피 세포의 따라서, 방법을 평가하기 위해 마이그레이션 pathophysiol을 탐구하는 데 필요한세포 이동이 ogy 질환 및 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인한다. 알킬화제 (예를 들면, 황 및 질소 머스타드)에 피부 노출 장애 (6) 상처 치유됩니다. 이러한 화합물로 인해 정치적으로 불안정한 지역과 비교적 간단한 합성의 기존 비축에 강한 우려에 대한 이유를 20 세기에 여러 갈등 화학 전쟁 에이전트로 사용 남아 있었다. 황 머스타드 먼저 1822 년 합성되었지만, SM 노출의 분자량과 임상 병리학 상세히 이해되지 않고 SM 노광용 해독제가 확인되지 않았다. 몇몇 연구는 이해하고 SM 노광 후에 손상된 상처 치유를 모델링하고 그 효과를 확보 할 수있는 잠재적 후보 화합물을 시험하기 위해 수행되었다. 슈미트 외. (2009) 클로 람 부실의 영향, 양해 각서 (MOU)에 SM과 유사한 특성을 가진 알킬화 화합물을 테스트SE 배아 체 모델 및 혈관 형성 7 극적인, 때때로 99 % 이상의 감소를 알았다. 이 부작용은 대부분, 생리 학적 조건 하에서, 증식 및 혈관 내피 전구 세포의 이동에 의해 지배된다 개발 단계에서 두드러졌다. 따라서, 이들 세포는 알킬화제에 특히 민감한 것으로 확인되었다. Steinritz 외. (2010)에, 마우스 배아 체 모델에서 특히 SM 독성을 감소시키는 그들의 능력에 대하여 특히, N- 아세틸 시스테인 (NAC)과 알파 리놀렌산 (ALA)에서 반응성 산소 종 (ROS)의 청소부 테스트 혈관 형성 (8)를 복원합니다. 임시 보호 효과는 과도한 활성 산소의 형성은 상처 치유에 SM의 부작용에 ​​기여할 가능성이되었음을 나타내는, 관찰되었다. 이러한 효과는 영구 없었고 두 후보 화합물은 장기 8에서 혈관 형성 및 상처 치유를 복원 할 수 없을 수도있다. HoweveR, 그 실험은 세포 이동의 조사를 허용했다 복잡한 3D 모델에서 실시 하였다. 따라서, 우리는 이후 용기 (9)의 형성 과정에서 중요한 역할을 EEC의 세포 이동에 대한 유익한 효과에 대한 ALA NAC 및 시험. 또한, 셀 극성 세포 이동을 위해 필요하다는 증거가있다. ROS의 형성으로 이어지는 미토콘드리아 기능 장애 세포 극성을 저해하는 것으로하고, 따라서 악영향 세포 이동에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 미토콘드리아 기능에 관한 라이브 세포 이미징을 수행하고, ROS 제거제의 효과를 조사 하였다. 다음 프로토콜은 EEC, 보이든 챔버 분석, 세포 추적 분석 및 세부에서 미토콘드리아 기능의 평가 TMRM의 사용을 포함하여 분석 상처 치유의 재배에 대한 일반 요구 사항에 대해 설명합니다. EEC 재배 및 마이그레이션을위한 실험 프로토콜의 중요한 측면이 강조된다.

<table><tbody><tr><td>Boyden Chamber&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &amp;micro;m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &amp;micro;m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&amp;nbsp; healing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Assessment of mitochondrial potential</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Linolenic acid</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&amp;nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

(황 및 질소 겨자 등의 알킬화 화학 전쟁 에이전트 포함) 화학 물질에 노출되면 상처 치유 장애를 포함하여 임상 증상의 과다 발생합니다. 상처 치유의 생리 학적 과정은 매우 복잡하다. 어느 혈관 생성을 통한 (신규 형성) 또는 혈관 생성 (기존 용기의 돋) - 육아 조직의 형성은 예비 상처 봉합의 결과 및 새로운 모세 혈관의 네트워크가 제공하는이 과정에서 중요한 단계이다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 기능, 지시 마이그레이션을 필요로한다. 따라서, 초기 내피 세포 (EEC) 이전의 조사는 잠재적으로 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인 장애를 치유 화학 물질에 의한 상처의 병태 생리를 이해하고하는 것이 중요하다. 우리는 에이전트 노출을 알킬화 후 손상된 상처 치유를 평가하고, TR에 대한 잠재적 인 후보 화합물을 테스트eatment. 우리는이 프로토콜에 설명 된 기법들을 사용 하였다. 수정 된 보이든 챔버는 정량적 EEC의 chemokinesis 설명한다보고자 하였다. 더욱이, 정 성적으로 마이그레이션을 평가하기 위해 트랙 분석과 조합하여 분석 상처 치유의 사용이 예시된다. 마지막으로, 우리는 교란 된 세포 이동의 기본 메커니즘을 식별하는 미토콘드리아 막전위의 조사 TMRM 형광 염료의 사용을 입증한다. 다음 프로토콜은 EEC의 조사를 위해 적응 된 기본 기술에 대해 설명합니다.

알킬화제에 대한 피부 노출은 홍반, 수포 형성 및 상처 치유 장애와 관련된 피부 궤양을 유발. 상처 치유는 내피 세포의 이동을 기반으로 angio- 및 혈관 생성을 필요로한다. 정량적 마이그레이션 된 Boyden 챔버 에세이를 사용하여 평가 될 수있다. 알킬화제 클로 람에 EEC의도 1c에 도시 한 바와 같이 노광시에 세포 이동 (9)에 상당한 감소 결과. 직접 24 시간 동안 클로 람 부실에 노...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K 조회수.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

비디오: Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

연구

면역학 및 감염병학

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

생체공학

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous system (CNS). Due to the limited access to disease-related BBB samples, it is still not well understood whether BBB malfunction is causative for disease development or rather a consequence of the neuroinflammatory or neurodegenerative process. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) therefore provide a novel opportunity to establish in vitro BBB models from healthy donors and patients, and thus to study disease-specific BBB characteristics from individual patients. Several differentiation protocols have been established for deriving brain microvascular endothelial cell (BMEC)-like cells from hiPSCs. Consideration of the specific research question is mandatory for the correct choice of the respective BMEC-differentiation protocol. Here, we describe the extended endothelial cell culture method (EECM), which is optimized to differentiate hiPSCs into BMEC-like cells with a mature immune phenotype, allowing the study of immune cell-BBB interactions. In this protocol, hiPSCs are first differentiated into endothelial progenitor cells (EPCs) by activating Wnt/&#946;-catenin signaling. The resulting culture, which contains smooth muscle-like cells (SMLCs), is then sequentially passaged to increase the purity of endothelial cells (ECs) and to induce BBB-specific properties. Co-culture of EECM-BMECs with these SMLCs or conditioned medium from SMLCs allows for the reproducible, constitutive, and cytokine-regulated expression of EC adhesion molecules. Importantly, EECM-BMEC-like cells establish barrier properties comparable to primary human BMECs, and due to their expression of all EC adhesion molecules, EECM-BMEC-like cells are different from other hiPSC-derived in vitro BBB models. EECM-BMEC-like cells are thus the model of choice for investigating the potential impact of disease processes at the level of the BBB, with an impact on immune cell interaction in a personalized fashion.

Here, we describe a protocol, the extended endothelial cell culture method (EECM), that allows differentiation of pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell (BMEC)-like cells. These cells show endothelial cell adhesion molecule expression and are thus a human blood-brain barrier model suitable to study immune cell interactions in vitro.

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

신경과학

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

생물학

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

의학

Assessing Interneuron Response to Chemoattractive Cues from Periventricular Endothelial Cells

Source: Datta, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60295">Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video shows a method to test interneuron migration in response to chemoattractive cues from periventricular endothelial cells (PVECs). Interneurons are placed in a central compartment, with PVECs and control cells on either side. Increased migration towards PVECs indicates a positive response to their chemoattractive signals.

뇌실주위 내피 세포의 화학매력 신호에 대한 인터뉴런 반응 평가

1. Chemo-attraction Assay

	Place a three-well culture insert in the center of a poly-L-ornithine/laminin-coated 35 mm dish using sterile tweezers.
	Turn ...