Name: assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
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This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

Das folgende Protokoll beschreibt Techniken für die Untersuchung der frühen Endothelzellmigration. Die richtige Pflege der vaskulären Endothelzellen erfordert pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen mit Gelatine, um die ordnungsgemäße Verbreitung und Aufrechterhaltung eines endothelialen Phänotyp zu gewährleisten. 1. Pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen <ol><li> Auflösen Gelatine in 0,1 M PBS auf eine Endkonzentration von 0,1%. </li><li> Autoklavieren Sie die Lösung mit Parametern für flüssige Autoklavieren (Details siehe Anleitung der spezifischen Autoklav). </li><li> Gebe ausreichend Volumen des autoklavierten Gelatinelösung in eine sterile Zellkulturflasche (beispielsweise zumindest 5 ml einer T25 Zellkulturflasche). </li><li> Übertragen Sie die Flaschen in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 nicht erforderlich, aber nicht stört) für mindestens 30 min. </li><li> Entfernen Sie die verbleibende Gelatine-Lösung. Verwenden Sie die vorbeschichtete Kolben anschließend (siehe Zellkultivierung) oder sriß unter sterilen Bedingungen bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Zellkultur der frühen Endothelzellen Hinweis: embryonalen Stammzellen abgeleitet frühen Endothelzellen (EWG) wurden von differenzierten murine embryonale Körper durch magnetische Zellsortierung der PECAM-1-positive Zellfraktion, wie zuvor beschrieben, erhalten 10,11. <ol><li> Kultur EWG Gelatine beschichtete Zellkulturschalen in DMEM, ergänzt mit 15% FCS, 50 U / ml Penicillin, 50 U / ml Streptomycin, 200 &amp; mgr; M L-Glutamin, 100 &amp; mgr; M ß-Mercaptoethanol und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren. Griff Zellen unter sterilen Bedingungen. Kultivieren der Zellen mit 5% CO 2 bei 37 ° C und 95% Feuchtigkeit bis Subkonfluenz (max. 80%). </li><li> Bei Subkonfluenz, teilen Sie die Zellen bei einer 1: 5-Verhältnis. Anmerkung: Ablösung der Endothelzellen ist ein kritischer Schritt. <ol><li> Ernten Sie die Zellen, die mit RT Accutase. Entfernen Sie die Medien, Spülen mit PBS und 1 ml Accutase pro 25 cm <sup&gt; 2. </li><li> Der Kolben wird bei RT inkubieren 2-10 min, bis die Zellen abgelöst. Dispergieren der Zellen und sie auf die gewünschte Anwendung. Anmerkung: Eine chemische Neutralisation des Accutase ist nicht erforderlich, wie es stattfindet, wenn die angesiedelten Zellen werden im Brutschrank bei 37 ° C gelagert. Jedoch kann Accutase Aktivität auch durch Zugabe DMEM FCS verringert werden. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Chamber Hinweis: Boyden-Kammer-Tests werden unter Verwendung von lichtundurchlässigen Polyethylenterephthalat Einsatzsystemen mit 8 &amp; mgr; m Porengröße durchgeführt. <ol><li> Precoat- die Filtereinsätze (dh passen in Zellkulturvertiefungen wodurch eine Boyden-Kammer), die durch Zugabe von 500 ul 0,1% Gelatine in 0,1 M PBS für mindestens 30 min. </li><li> Wenn Zellen mit toxischen Chemikalien ausgesetzt werden sollen, ausgesetzt werden entsprechend der speziellen Versuchsdesign vor der Zellernte. Anmerkung: Die Zellen wurden auf 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM ausgesetzt24 h. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren. </li><li> Ernte EWG und bestimmen die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer. Hinweis: Die automatische Zählgeräte verwendet werden, sollte aber mit Vorsicht verwendet werden: manuelle Zellzählung ist genauer und ist sehr zu empfehlen. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l Zellkulturmedium in die untere Kammer Raum des Boyden Chamber. </li><li> In genau 10 4 EWG in 500 ul Zellkulturmedium pro Filtereinsatz in der oberen Kammer Fach. Beseitigen Sie Luftblasen. </li><li> Inkubieren Sie die Filtereinsätze in den Inkubator für genau 8 Stunden. </li><li> Spülen mit PBS einmal und ersetzen Sie das Medium mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in beiden Fächern für 25 min für die Zellfixierung. Das Filter ausgiebig waschen, aber mindestens 3-mal mit 0,1 M PBS. </li><li> Verbrauchsteuern, die Membranen mit einem Skalpell. </li><li> Montieren Sie die Membran zwischen zwei Glasplättchen mit Eindeckmedium enthält DAPI zur Kern staining. Achten Sie auf die Ausrichtung. Sicherzustellen, dass nur Zellen, die in Richtung der unteren Kammer der Membran gewandert sind, gezählt. </li><li> Zählen von Zellen, die in Richtung der unteren Abteilseite der Membran mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 400-facher Vergrößerung gewandert sind. Nicht zu verwechseln Membranporen mit migrierten Zellen (1A, 1B). Untersuchen Sie eine angemessene Anzahl von biologischen Replikaten (mindestens 3 biologischen Wiederholungen pro Bedingung). </li></ol> 4. Wundheilung Assay <ol><li> In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt. Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden. </li><li> Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging), Bis 80% Zusammenfluss. Wichtig: nicht kultivieren die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen. </li><li> Rubbeln Sie an der Monoschichten mit 10 ul sterile Pipettenspitzen. Schieben Sie die Spitze vorsichtig ohne zu viel Druck auf der Geschirroberfläche und verschieben Sie sie in einer geraden Linie sanft von einer Seite auf die other.Wash die Zellen zweimal mit 0,1 M PBS, um abgelösten Zellen zu entfernen. </li><li> Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Mediums in die Kulturschale. Falls zutreffend, fügen Sie Verbindungen, die untersucht werden sollten. Anmerkung: 1.5 ml Medium, enthaltend 15 ng / ml Alpha-Linolensäure zugegeben. </li><li> Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging. Sicherzustellen, 5% CO 2, 37 ° C und feuchter Atmosphäre. Anmerkung: Die Befeuchtung ist besonders wichtig, mittlere Verdunstung zu vermeiden. </li><li> Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden bei 10 min-Takt. Plan für große Dateigrößen. Hinweis: Eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln ist in der Regel ausreichend; Wir empfehlen jedoch die Verwendung von Bildern von mindestens 1.024 x 1,024. </li><li> Messen Sie die Spaltbreite bei t = 0 h und bei t = 24 h unter Verwendung des Werkzeuglänge der Software mit dem Mikroskop geliefert oder verwenden Sie Open-Source-Software (zB ImageJ). Anmerkung: In der Regel spezifische Bilderfassung und -analyse-Software wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt. Daher ist für technische Details in Bezug auf die Verwendung der Software finden Sie in der Bedienungsanleitung. </li></ol> 5. Zelltracking <ol><li> In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt. Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden. </li><li> Seed 5 × 10 4 EWG in DMEM ergänzt in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (beispielsweise 24-Multiwell-Platte) und pflegen Sie die Zellen mit 5% CO 2 bei 37 ° C und 95% Luftfeuchtigkeit für 1-2 Tage. </li><li> Wenn Zellen wurden bis zu einer 80 gewachsen% Konfluenz, entfernen Sie die Medien und Kultur der Zellen mit neuen Medien in Anwesenheit der jeweiligen Testsubstanzen (zB 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM). Immer auch die Kontrollzellen (mit dem Lösungsmittel, zum Beispiel Ethanol behandelt) bei 37 ° C für eine bestimmte Zeitdauer (24 Stunden, abhängig von der individuellen Assay-System). </li><li> Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit). Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden in vordefinierten Intervallen. Erwerben Sie Bilder in 10-Minuten-Intervallen. </li><li> Führen Sie manuell die Verfolgung der EWG durch den Einsatz der ImageJ Plugin MTrackJ. Wählen Sie 10-Zellen nach dem Zufallsprinzip aus dem Sichtfeld und verfolgen ihre Bewegungen, indem Sie einen Datenpunkt pro Punkt in der Zeit mit dem Befehl von MTrackJ &quot;Hinzufügen&quot;. </li></ol> Hinweis: MTrackJ ist kostenlos abrufbar und ImageJ ist availab [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le bei [Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Ein ausführliches Handbuch über die MTrackJ Plugin auf &quot;http://www.imagescience.org&quot; zur Verfügung. 6. Live Cell Imaging / Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials <ol><li> Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging) bis zu einer 80% Zusammenfluss. Wichtig: kultivieren Sie die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen. </li><li> Falls zutreffend, setzen die Zellen gegenüber Chemikalien. Anmerkung: Die Zellen wurden zu 12,5 &amp; mgr; g / ml Chlorambucil 24 h ausgesetzt. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren. </li><li> Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Tetramethylrhodamin (TMRM) in DMSO. Vor Licht schützen. Hinweis: Die Stammlösung kann bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Von der Stammlösung in Zellkulturmedium zu einer Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 uM (1: 1000 Verdünnung). Vor Licht schützenund die Verwendung als schnell wie möglich. Hinweis: Die Arbeitslösung kann bei Raumtemperatur für einige Zeit (&gt; 1 h) gehalten werden, jedoch Zubereitung eines frischen Arbeitslösung ist sehr zu empfehlen. </li><li> In 2 ul der Arbeitslösung zu 1 ml frisches Zellkulturmedium (Beladungslösung). </li><li> Laden der Zellen durch Austausch des Zellkulturmedium mit der Auftragslösung. Proben für 15 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und befeuchteter Atmosphäre (Brutschrank). Achtung: Fast alle Fluoreszenzindikatoren werden von lebenden Zellen mit der Zeit ausgeführt werden; Daher vermeiden längerer Belastung oder verzögerten Analyse. </li><li> Ohne Waschen, die Schale unter einem geeignet für Live Cell Imaging Mikroskop. Wichtig: Fluoreszenzindikatoren sind sehr lichtempfindlich, daher unnötige Lichtexposition. </li><li> Bilder zu erwerben, ohne die Erfassungsparameter, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Bilder zu gewährleisten. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dermale Exposition gegenüber giftigen Chemikalien führt oft zu schweren Wundheilungsstörung. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der aus verschiedenen Phasen (Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung) besteht. Zellmigration in jeder Phase, wie auch immer, ist es von größter Bedeutung für die Bildung von Granulationsgewebe. Hier werden neue Blutgefäße entweder durch Angio- oder Vaskulogenese gebildet. Be...

Zellmigration ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Entwicklung, verschiedene Krankheiten, und die Wundheilung nach Verletzungen der Haut wichtig. Folgende Hautverletzung, Entzündung beseitigt beschädigte oder nekrotische Gewebe und Granulierung Antriebe vorläufigen Wundverschluß und ermöglicht die Bildung eines Netzwerks von Kapillaren durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (Sprießen von vorhandenen Bläschen) 1-3. Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern Migration von Endothelzellen. Die wachsende Netzwerk von Blutgefäßen ist wichtig, um Sauerstoff und Nährstoffe zu proliferierenden Keratinozyten, die letztlich Verhornung unterziehen zu transportieren, bilden eine neue Epithel und bieten Wundverschluss. Beeinträchtigt Migration von Endothelzellen ist eine zugrunde liegende Ursache der Wundheilungsstörung 4,5. Somit Methoden zur Messung der Migration der frühen Endothelzellen sind erforderlich, um die pathophysiol erforschenlogie der Zellmigration Störungen und neue Strategien für die therapeutische Intervention zu identifizieren. Hautexposition Alkylierungsmittel (beispielsweise Schwefel und Stickstoffsenfgas) verursacht Wundheilungsstörung 6. Solche Verbindungen wurden als chemische Kampfstoffe in mehrere Konflikte im 20. Jahrhundert Grund für große Besorgnis wegen der bestehenden Lagerbestände in politisch instabilen Regionen und die relativ einfache Synthese verwendet werden und zu bleiben. Obwohl Senfgas wurde zum ersten Mal im Jahre 1822 synthetisiert wird die molekularen und klinischen Pathologie der SM Exposition nicht im Detail verstanden und kein Gegenmittel für SM Exposition festgestellt wurde. Es wurden mehrere Studien durchgeführt, um zu verstehen und zu einer Beeinträchtigung der Wundheilung nach SM Expositionsmodell und für potenzielle Kandidatenverbindungen, die die Reservierung diese Wirkung zu testen. Schmidt et al. (2009) untersucht die Wirkung von Chlorambucil, einem alkylierenden Verbindung mit ähnlich SM in mou Eigenschaftense Embryoidkörper Modelle und fand eine dramatische, manchmal mehr als 99% ige Reduktion der Gefäßbildung 7. Dieser nachteilige Effekt war besonders im Stadium der Entwicklung, die unter physiologischen Bedingungen durch die Proliferation und Migration der vaskulären endothelialen Vorläuferzellen dominiert ausgeprägt. Somit wurden diese Zellen identifiziert besonders empfindlich Alkylierungsmittel sein. Steinritz et al. (2010) getestet Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), insbesondere N-Acetylcystein (NAC) und Alpha-Linolensäure (ALA) auf ihre Fähigkeit zur SM-Toxizität in der Maus Embryoidkörper Modelle und insbesondere zu verringern, Wiederherstellung Gefäßbildung 8. Temporäre Schutzwirkungen wurden nicht beobachtet, was darauf hinweist, dass die übermäßige Bildung von ROS wahrscheinlich war, um die negativen Auswirkungen der SM auf die Wundheilung bei. Diese Effekte waren nicht dauerhaft und die zwei Kandidatenverbindungen nicht wiederherstellen kann Gefäßbildung und Wundheilung langfristig 8 sein. However wurden diese Experimente in einem komplexen 3D-Modell, das ermöglicht Untersuchung der Zellmigration haben durchgeführt. So haben wir anschließend getestet NAC und ALA für eine wohltuende Wirkung auf die Zellmigration der EWG, die eine Schlüsselrolle im Prozess der Gefäßbildung 9 haben. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass die Zellpolarität ist für Zellmigration erforderlich. Mitochondriale Dysfunktion, die zu ROS-Bildung wurde gezeigt, dass Zellpolarität beeinträchtigen und somit nachteilig auf die Zellmigration. Daher wurde lebenden Zellen im Hinblick auf die mitochondriale Funktion durchgeführt, und die Wirkungen von ROS-Fänger wurden untersucht. Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeinen Anforderungen für den Anbau von EWG, der Boyden-Kammer-Assay, der Wundheilungsassay einschließlich Zell Tracking-Analyse und den Einsatz von TMRM zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien im Detail. Wichtige Aspekte der Versuchsprotokolle für EWG Anbau und Migration werden hervorgehoben.

<table><tbody><tr><td>Boyden Chamber&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &amp;micro;m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &amp;micro;m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&amp;nbsp; healing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Assessment of mitochondrial potential</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Linolenic acid</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&amp;nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

Die Exposition gegenüber chemischen Stoffen (einschließlich alkylierende chemische Kampfstoffe wie Schwefel und Stickstoffsenf) führen eine Fülle von klinischen Symptomen wie Wundheilungsstörung. Der physiologische Prozess der Wundheilung ist sehr komplex. Die Bildung von Granulationsgewebe ist ein wichtiger Schritt in diesem Prozess, was zu einer vorläufigen Wundverschluss und die Bereitstellung eines Netzes von neuen kapillaren Blutgefäßen - entweder durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (sprießen bestehender Schiffe). Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern funktionale, gerichtete Wanderung von Endothelzellen. Somit ist Untersuchung von frühen Endothelzellen (EWG) Migration wichtig, die Pathophysiologie der chemischen induzierten Wundheilungsstörungen zu verstehen und möglicherweise zu identifizieren neue Strategien für die therapeutische Intervention. Wir beurteilen Wundheilungsstörungen nach Alkylierungsmittel Belichtung und getestet potenziellen Kandidatenverbindungen für treatment. Wir haben eine Reihe von Techniken, die in diesem Protokoll beschrieben. A modifizierten Boyden-Kammer, um quantitativ zu untersuchen Chemokinese der EWG beschrieben. Darüber hinaus wird die Verwendung der Wundheilungs Assay in Verbindung mit Gleis Analyse qualitativ beurteilen Migration dargestellt. Schließlich zeigen wir die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs TMRM zur Erforschung des mitochondrialen Membranpotentials zu Grunde liegenden Mechanismen der gestörten Zellmigration zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt grundlegende Techniken, die für die Untersuchung der EWG adaptiert wurden.

Dermale Exposition Alkylierungsmittel provoziert Rötung, Blasenbildung und Hautgeschwürbildung, die mit einer Wundheilungsstörung assoziiert ist. Wundheilung erfordert Angio- und Vaskulogenese, die auf die Migration von Endothelzellen beruhen. Quantitative Migration kann durch die Verwendung des Boyden-Kammer-Assays bewertet werden. Wie in 1C Belichtung EWG zum eingesetzten Alkylierungsmittel Chlorambucil gezeigt führte zu einer signifikanten Abnahme der Zellmigration 9. Neben der ROS-Sca...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Serie: Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Forschung

Krebsforschung

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

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Biotechnik

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Immunologie und Infektion

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Neurowissenschaften

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biologie

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

Ein kostengünstiger und anpassungsfähiger Scratch-Migrationstest

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues and organs during development, but on the other hand, the same mechanisms are used by tumor cells to move and spread in a process known as cancer metastasis. One of the primary cellular machineries that make cell movement possible is an intracellular network of myosin and actin molecules, together known as &#8220;actomyosin&#8221;, which creates a contractile force to pull a cell in different directions.In this video, JoVE presents a historical overview of the field of cell migration, noting how early work on muscle contraction led to the discovery of the actomyosin apparatus. We then explore some of the questions researchers are still asking about cell motility, and review techniques used to study different aspects of this phenomenon. Finally, we look at how researchers are currently studying cell migration, for example, to better understand metastasis.

Cell Motility and Migration, Cell Invasion and Chemo-attraction

Einführung in die Zellmotilität und -migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...