This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

以下のプロトコルは、初期の内皮細胞の移動の調査のための手法について説明します。血管内皮細胞の適切な培養は、内皮表現型の適切な増殖および維持を確実にするために、ゼラチンを用いた細胞培養フラスコのプレコーティングを必要とします。 細胞培養フラスコの1プリコート<ol><li> 0.1％の最終濃度になるように0.1 M PBS中のゼラチンを溶かします。 </li><li> （詳細は特定のオートクレーブの手順を参照するための）液体オートクレーブ処理のためのパラメータで溶液をオートクレーブ。 </li><li>無菌の細胞培養フラスコ（T25細胞培養フラスコのため、例えば、少なくとも5 ml）でのオートクレーブ処理ゼラチン溶液の十分な量を加えます。 </li><li>少なくとも30分間、インキュベーター（37℃、5％CO 2を必要としないが、干渉せず）内にフラスコを移し。 </li><li>残りのゼラチン溶液を除去します。その後プレコートフラスコを使用します（参照細胞培養）またはs使用するまで無菌条件下で引き裂きました。 </li></ol>初期の内皮細胞の2細胞培養注：以前に10,11説明したように胚性幹細胞由来の早期内皮細胞（EEC）はPECAM-1陽性細胞分画の磁気活性化細胞選別によって区別マウス胚様体から得ました。 <ol><li> DMEM中でゼラチン被覆細胞培養皿に培養EEC、15％FCS、50 U / mlペニシリン、50 U / mlのストレプトマイシン、200μMのL-グルタミン、100μMのβメルカプトエタノールおよび1％非必須アミノ酸を補充しました。無菌条件下で細胞を処理します。 37℃、5％CO 2で細胞を培養し、95％の湿度サブコンフルエンス（最大80％）になるまで。 </li><li> 5比：サブ合流点に、1でセルを分割します。注：内皮細胞の剥離は重要なステップです。 <ol><li> RTのACCUTASEで細胞を収穫。 、メディアを取り出し、PBSでリンスし、25単位cm ACCUTASEの1ミリリットルを追加します<sup&gt; 2。 </li><li>細胞が分離するまで、2〜10分間室温でフラスコをインキュベートします。細胞を分散し、所望のアプリケーションに転送します。注：播種した細胞は、37℃のインキュベーターに格納されている場合、それが起こるようACCUTASEの化学的中和は必要ありません。しかし、ACCUTASE活性もFCSを含むDMEMを添加することによって低下させることができます。 </li></ol></li></ol> 3.ボイデンチャンバー注：ボイデンチャンバーアッセイは8μmの孔径を有する光不透明なポリエチレンテレフタレートインサートシステムを使用して実行されます。 <ol><li>プレコートフィルターインサート（細胞培養ウェルの内部その適合は、このようにBoydenチャンバーを作成する）、少なくとも30分間、0.1 M PBSに溶解した0.1％ゼラチンを500μlを加えることにより。 </li><li>細胞は有毒化学物質にさらされる場合は、細胞収穫前に、特定の実験計画に応じて露光します。注：細胞を12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEMに曝露しました24時間。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>収穫EEC計数セルチャンバーを用いて細胞数を決定します。注：自動計数装置を使用することができるが、注意して使用する必要があります。マニュアル細胞計数は、より正確であり、強くお勧めします。 </li><li>ボイデンチャンバーの下室区画に500μlの細胞培養培地を追加します。 </li><li>上室区画にフィルタインサートあたり500μlの細胞培養培地中で正確に10 4 EECを追加します。気泡を除去します。 </li><li>正確に8時間、インキュベーターのフィルタインサートをインキュベートします。 </li><li> PBSで一度洗浄し、細胞固定のための25分間両方の区画に0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドを含む培地を交換してください。 0.1 M PBSでフィルターが、少なくとも3回洗浄します。 </li><li>メスで膜を切除。 </li><li>核staininのためにDAPIを含む封入剤を有する2つのガラスカバースリップ間の膜をマウントgです。向きに注意してください。膜の下室側に向かって移動した細胞のみがカウントされていることを確認します。 </li><li> 400Xの倍率で蛍光顕微鏡を用いて、膜の下室側に向かって移動した細胞をカウントします。移動した細胞（ 図1A、1B）との膜孔を混同しないでください。生物学的複製（条件当たり少なくとも3生物学的反復）の合理的な数を調査します。 </li></ol> 4.創傷治癒アッセイ<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置にEECを養う（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）80％コンフルエンスになるまで。重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>滅菌10μlのピペットチップを用いて単層を傷つけ。皿表面上にあまりにも多くの圧力なしそっと先端を押して、分離した細胞を除去するために、0.1 M PBSで二回other.Washに一方の側からスムーズに直線状に移動してください。 </li><li>培養皿に培地の十分な量を追加します。該当する場合は、調査する必要がある化合物を追加します。 注：15 NGを含む1.5 mlの培地/ mlのアルファリノレン酸を添加しました。 </li><li>ライブセルイメージングが可能な顕微鏡下で培養皿をマウントします。 5％CO 2、37℃、加湿雰囲気を確認してください。 注：加湿媒体の蒸発を避けるために特に重要です。 </li><li> 10分間隔で24時間かけてタイムラプス画像を取得します。大きなファイルサイズを計画します。注意：512×512ピクセルの解像度が通常は十分です。しかし、我々は、少なくとも1,024×1,0の画像を使用することをお勧めします24。 </li><li> = 0時間tでのギャップ幅を測定し、tの= 24時間顕微鏡で提供されるソフトウェアの長さツールを使用するか、オープンソースソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。注意：一般に、特定の画像取得及び解析ソフトウェアは、製造業者によって提供されます。そのため、ソフトウェアの使用に関する技術的な詳細については、マニュアルを参照してください。 </li></ol> 5.細胞追跡<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置で補充したDMEM中に5×10 4 EEC種（ 例えば、24マルチウェルプレート）、37℃で1〜2日間、95％湿度、5％CO 2で細胞を養います。 </li><li>細胞は80にまで成長してきた場合には％コンフルエンス、それぞれの試験物質（例えば、12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEM）の存在下で、メディアと文化の新しいメディアで細胞を除去します。常に（個々のアッセイ系に依存して、24時間）一定時間、37℃での対照細胞（溶媒で処理し、 例えば、エタノール）が挙げられます。 </li><li>生細胞イメージング（37℃、5％CO 2及び95％湿度）が可能な顕微鏡下で培養皿をマウント。事前に定義された間隔で、24時間かけてタイムラプス画像を取得します。 10分間隔で画像を取得します。 </li><li> ImageJのプラグインMTrackJを使用して手動でEECの追跡を行います。視野からランダムに10個のセルを選択し、MTrackJのコマンドを「追加」を使用して時間内にポイント当たりのデータポイントを追加することで、その動きを追跡します。 </li></ol>注：MTrackJは[。Meijering、 Mtrackj「http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/」]で無料で利用可能で、ImageJがご利用できますです。ルで[Rasband、 ImageJの。 &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]。MTrackJプラグインについての詳細なマニュアルは、「http://www.imagescience.org」で入手できます。 ミトコンドリア膜電位の6ライブセルイメージング/評価<ol><li> 80％のコンフルエンスまで適切な細胞培養装置（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）にEECの育成。 重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>該当する場合は、化学物質に細胞を公開します。注：細胞は、24時間12.5 / mlのクロラムブシルに曝露しました。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>テトラメチルDMSO中（TMRM）の10mMストック溶液を調製します。光から保護します。注：ストック溶液は-20℃で保存することができます。 </li><li> （：1,000希釈1）10μMの濃度での作業溶液に細胞培養培地中の原液を希釈します。光から保護しますできるだけ早く使用しています。注：作業溶液は、いくつかの時間（&gt; 1時間）室温で維持することができる、しかし、新鮮なワーキング溶液の調製を強くお勧めします。 </li><li> 1ミリリットルの作業溶液の新鮮な細胞培養培地（ローディング溶液）の2μlを添加します。 </li><li>ローディング溶液で細胞培養培地を交換し、細胞をロードします。 37℃、5％CO 2加湿雰囲気（インキュベーター）で15分間インキュベートします。注意：ほとんどすべての蛍光指示薬は、時間をかけて生細胞によってエクスポートされます。したがって、長期のロードまたは遅延解析を避けます。 </li><li>洗浄することなく、生細胞イメージングに適した顕微鏡下で皿を置きます。重要：蛍光指示薬は、したがって、不要な光の露出を避けるため、光に非常に敏感です。 </li><li>異なる画像間の比較可能性を確保するために取得パラメータを変更せずに画像を取得します。 </li></ol>

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	<li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis,+vasculogenesis,+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds.">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li><li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li><li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+1:+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds.">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li><li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+progenitor+cell+mobilization,+and+diabetic+wound+healing.">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li><li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing.">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li><li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering.">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+mustard+(Chlorambucil)+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development.">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation.">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorambucil+(nitrogen+mustard)+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine.">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis.">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li><li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+separations.">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species.">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture.">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

有害化学物質への皮膚暴露は、しばしば深刻な創傷治癒障害をもたらします。根底にあるメカニズムは不明な点が多いです。創傷治癒は、異なる位相（止血、炎症、増殖およびリモデリング）で構成され、複雑なプロセスです。細胞移動は、しかし、それは、肉芽組織の形成のために最も重要であり、すべての段階に関与しています。ここで、新しい血管が脈管の脈管形成またはいずれかに?...

細胞遊走は、皮膚損傷後の開発、様々な疾患、および創傷治癒を含む多くの生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要です。 皮膚損傷に続いて、炎症は、損傷または壊死組織および造粒予備創傷閉鎖を駆動し、脈管（小説形成）または血管新生（既存の小胞の出芽）1-3を介して、新しい毛細血管のネットワークの形成を可能にするが削除されます。 vasculo-と血管新生の両方が内皮細胞の移動を必要とします。血管の成長ネットワークは、最終的には角質化を受けるケラチノサイト増殖に酸素と栄養素を運ぶ新しい上皮を形成し、創傷閉鎖を提供するために不可欠です。 内皮細胞の障害の移行は、障害4,5創傷治癒の根底にある原因です。したがって、初期の内皮細胞の遊走を評価する方法がpathophysiolを探索するために必要とされます細胞遊走障害の術とは、治療的介入のための新規の戦略を特定します。 アルキル化剤（ 例えば、硫黄、窒素マスタード）への皮膚暴露は、障害6創傷治癒を引き起こします。このような化合物が原因政治的に不安定な地域や比較的単純な合成における既存の備蓄に強い懸念の理由を20世紀に、いくつかの紛争で化学兵器として使用され、残ってました。硫黄マスタードは、​​最初1822年に合成されたが、SM暴露の分子および臨床病理学を詳細に理解されておらず、SMの暴露のための解毒剤が同定されていません。 いくつかの研究は、理解し、SM暴露後障害、創傷治癒をモデル化するために、その効果を確保することができる潜在的な候補化合物を試験するために行われています。シュミットら （2009）は、MOUにおけるSMと同様の特性を持つアルキル化化合物をクロラムブシルの効果を試験しましたSE胚様体モデルおよび血管形成7の劇的な、時には99％以上の減少を発見しました。この副作用は、ほとんどの生理的条件下で、血管内皮前駆細胞の増殖および移動によって支配され、開発の段階で顕著でした。したがって、これらの細胞は、アルキル化剤に特に敏感であることが確認されました。 Steinritz ら （2010）に、マウス胚様体モデルにおいて、特にSMの毒性を低減する能力について、特に、N-アセチルシステイン（NAC）およびアルファリノレン酸（ALA）中の反応性酸素種（ROS）の捕捉剤をテスト血管形成8を復元します。一時的な保護効果は、過剰なROS形成は、創傷治癒にSMの副作用に貢献する可能性があったことを示し、観察されました。これらの効果は一時的なものであり、2つの候補化合物は、長期8の血管形成および創傷治癒を回復することが可能ではないかもしれません。 HoweveR、これらの実験は、細胞遊走の研究を可能にしました複雑な3Dモデルで行いました。従って、我々は、その後血管形成9の過程において重要な役割を持っているEECの細胞遊走に有益な効果のためにNACとALAをテストしました。 また、細胞極性、細胞遊走に必要とされるという証拠があります。 ROSの形成をもたらすミトコンドリア機能不全は、細胞極性を損なうことが示されたので、有害な細胞の移動に影響を及ぼし得ます。したがって、ミトコンドリア機能に関して、生細胞イメージングを行い、ROSスカベンジャーの効果を調べました。以下のプロトコルは、EEC、Boydenチャンバーアッセイ、細胞トラッキング解析および詳細におけるミトコンドリア機能の評価のためにTMRMの使用を含む創傷治癒アッセイの栽培のための一般的な要件について説明します。 EEC栽培と移行のための実験プロトコルの重要な側面が強調されています。

<table><tbody><tr><td>Boyden Chamber&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &amp;micro;m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &amp;micro;m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&amp;nbsp; healing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Assessment of mitochondrial potential</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Linolenic acid</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&amp;nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

（硫黄および窒素マスタードのようなアルキル化化学兵器を含む）の化学物質への曝露は、創傷治癒障害を含む臨床症状の過多を引き起こします。創傷治癒の生理学的過程は非常に複雑です。いずれかの脈管を通って（小説の形成）または血管新生（既存の血管の出芽） - 肉芽組織の形成は、予備的な創傷閉鎖をもたらし、新たな毛細血管のネットワークを提供し、このプロセスの重要なステップです。 vasculo-と血管新生の両方は、内皮細胞の遊走を向け機能が必要です。このように、初期の内皮細胞（EEC）移行の調査は治癒障害の化学誘起される傷の病態生理を理解し、潜在的な治療的介入のための新規な戦略を特定することが重要です。 我々は、エージェントの露出をアルキル化した後、創傷治癒の障害を評価し、TRのための潜在的な候補化合物を試験しましたeatment。私たちは、このプロトコルで概説技術のセットを使用していました。定量EECのケモキネシスを調査する改変ボイデンチャンバーを説明します。また、質的移行を評価するための軌道分析と組み合わせた創傷治癒アッセイの使用が示されています。最後に、乱れた細胞遊走の基礎となるメカニズムを識別するために、ミトコンドリア膜電位の調査のための蛍光色素TMRMの使用を示します。以下のプロトコルは、EECの調査のために適応されている基本的な手法について説明します。

アルキル化剤への皮膚暴露は、紅斑、水疱形成および創傷治癒障害に関連する皮膚潰瘍を引き起こします。創傷治癒は、内皮細胞の移動に基づいているリンパ管のおよび脈管が必要です。定量的な移行はボイデンチャンバーアッセイを使用して評価することができます。アルキル化剤クロラムブシルのEECの図1Cの露光に示すように、細胞遊走9の有意な減少をもたらしまし...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K ビュー.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

ビデオ: Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

がん研究

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

生物工学

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

培養された膀胱上皮を越えるヒト好中球の移行の定量的評価

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

免疫・感染学

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

神経科学

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

生物学

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues and organs during development, but on the other hand, the same mechanisms are used by tumor cells to move and spread in a process known as cancer metastasis. One of the primary cellular machineries that make cell movement possible is an intracellular network of myosin and actin molecules, together known as &#8220;actomyosin&#8221;, which creates a contractile force to pull a cell in different directions.In this video, JoVE presents a historical overview of the field of cell migration, noting how early work on muscle contraction led to the discovery of the actomyosin apparatus. We then explore some of the questions researchers are still asking about cell motility, and review techniques used to study different aspects of this phenomenon. Finally, we look at how researchers are currently studying cell migration, for example, to better understand metastasis.

Cell Motility and Migration, Cell Invasion and Chemo-attraction

細胞の運動性と移行の概要

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...