Name: in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
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This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

참고 : 실험 동물에서 조직을 포함하는 다음 절차는 동물 2013 년 안락사에 대한 AVMA 가이드 라인과 일치하고 미시간 주립 대학 IACUC의 사전 승인되었다. 1. 조직 준비 <ol><li> 산소 또는 물리적 배리어는 이소 플루 란과의 직접적인 접촉으로부터 동물을 막을 수 있도록, 상기 챔버의 바닥에 흡수성 재료 상에 액체 이소 플루 3-5 mL로 배치하여 2.5 %의 이소 플루 란을 포함하는 챔버에서 연구 동물을 마취. 발바닥을 곤란하게하여 마취의 깊이를 테스트합니다. 주 : 뒷다리의 움츠림 반사가 없을 때 마취 깊이가 적절하다고 인정된다. 적절하게 마취되면, 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사 </li><li> 앙와위에서 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 중간 선에서 복부 피부를 꼬집어 집게를 사용하여 6cm 미디어를 만들기 위해 수술 가위를 사용원격 교육 알바를 따라 L 절개 내부의 소화 기관을 노출. </li><li> 찾아 복막 내부의 회장을 노출 무딘 집게를 사용합니다. 가위로 회장 / 결장 장간막을 잘라 소장을 무너 시작합니다. </li><li> 소장의 길이를 충분히 풀어지면, 회장 제제에서 맹장 위장 근위 및 원위 부위를 잘라. 대장 준비 기간, 직장에 맹장과 근위 대장 원위부를 잘라. </li><li> 신속 장내 세그먼트를 제거하고 3 μM의 카르 디핀 염산염 1 μM 스코 폴 아민 하이드로 클로라이드로 보충 DMEM / F12 미디어를 비커에 배치 얼음 (이하 &quot;용지&quot;라한다). 이러한 억제제의 첨가는 소화관 평활근 마비하여 미세 절제 및 후속 영상화를 용이하게한다. </li><li> 설립 해부학 적 마커를 기반으로 관심의 컷 세그먼트 (예를 들면, 공장, 회장 원위부 또는 근위부 대장). 일반적으로 utiliz말단 회장 원위부 대장의 전자 조직. 그러나 모든 장 지역에서, 부하 및 이미지 myenteric 신경 세포와 아교 세포를 분리하기 위해 동일한 기본 절차를 사용합니다. </li><li> 냉장 미디어 가득 실 가드 코팅 된 배양 접시에 원하는 장 세그먼트과 장소의 작은 부분 (4-6cm)를 제거합니다. </li><li> 근위 및 곤충 핀 장 세그먼트의 말단부를 안전하고 직선을 만들어 장 관을 열고, 길이 장간막 국경을 따라 잘라. </li><li> 미세 집게 (# 5, # 최고의 45분의 5 일)과 아주 좋은 봄 가위를 사용하여 점막 층을 멀리 해부까지 조심스럽게 점막면이 빛 장력 평면 핀 조직. 주 : 제대로 수행하지 않을 경우 점막의 제거는 ENS에 대해 매우 충격적인 일 수있다. 품질 준비를 들어, 박 리나 긁어 점막의 갑작스러운 제거를 제한하기 위해주의를 기울입니다. 가장 좋은 방법은 점막을 들어 올려 미세 가위로 아래 절단하는 것입니다. </li><li> 작은 준비로 조직을 잘라의 영상 요리로 (약 0.5 cm 2) 핀 신선한 미디어와 얼음에 배치 (원형 근육 층이 위를 향 4 코너). </li><li> 조심스럽게 myenteric 신경 얼기를 노출 미세 핀셋으로 떨어져 괴롭 히고 의해 원형 근육을 멀리 해부하다. 과도한 스트레칭을 피하십시오. </li><li> 신선한 미디어와 얼음과 변화 솔루션을 다시 이미징 요리를 놓습니다. </li><li> 접시 당 효소 믹스 2 ㎖를 준비 [스파 아제 (Dispase) 1 U / ㎖ (4.48 ㎎ / 8 ㎖), 콜라게나 제 유형 II 150 U / ㎖ (5.45 ㎎ / 8 ml)에 미디어]. </li><li> 얼음에서 요리를 제거하고 단계 1.13에서 효소 믹스를 추가합니다. </li><li> 5 % CO 95분의 2 % 공기와 함께 실온에서 15 분 동안 인큐베이션을 요리. </li><li> 미디어 3 회 다시 핀 모서리 씻을 조직 준비. </li></ol> 2.로드 FLUO-4 염료 참고 : 표시 염료로드 형광 염료 및 조직을 처리하는 동안 제한된 빛과 협력하여 photobleaching에 피하십시오. <ol><li> 4 μM FLUO-4 로딩 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 4 mM의 FLUO-4 주식의 1.5 μL 나누어지는 1.5 ml의 미디어 및 250 mM의 프로 베네 시드 주식의 1.2 μl를 추가합니다. FLUO-4 AM로 50 μg의 (0.25 % cremaphor-EL 보충 된 DMSO 중 20 %) 4- FLUO-4 mM의 스톡 플루로 닉 F-127 11.4 μl를 첨가하여 제조된다. </li></ol></li><li> 37 ° C에서 어두운 배양기에서 45 분 동안 로딩 FLUO-4 용액 상태로 준비 부화. </li><li> 인큐베이터에서 제거 및 미디어 3 회와 준비를 씻는다. </li><li> 미디어가 200 μM의 프로 베네 시드를 포함 및 이미징 전에 37 ° C에서 15 분을 품어의 환율 미디어. 참고 : 프로 베네 시드가 신경 세포에 약제 내성 수송을 억제하는 약물이다. 이 약물의 첨가는 염색을 돌출 뉴런의 기능을 억제하고 신경 라벨링을 향상시킨다. 프로 베네 시드가없는 상태에서 칼슘 2 + 지표 염료의 대량로드는 주로 아교 세포로드를 생성합니다. 프로 베네 시드의 추가는 신​​경 세포와 신경 교세포의 답변 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 준비 KRE 수정학사 버퍼입니다. <ol><li> 확인 구성 요소 (MM)에 최종 농도는 다음과 같습니다 것을 수정 크렙스 버퍼와 같은 : (121)의 NaCl, 5.9의 KCl, 2.5 CaCl2를, 1.2의 MgCl 2, 1.2의 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2의 NaHCO3, 1 피루브산을 산 (NaOH로 7.4로 조정 산도) 8 포도당. 칼슘 동안 2 + 이미징 근육의 수축을 억제하는 3 μM의 니 카르 디핀 (nicardipine) 및 1 μM 스코 폴라 민을 추가하고 해부를 전체 마운트합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 및 분석 참고 : 형광 광원, 현미경, 품질 CCD 카메라와 적절한 수집 소프트웨어와 함께 적어도 기본 이미징 장비를 사용합니다. 광원과 특정 응용에 따라 다른 구성 요소의 추가를 변화한다. 필터 휠과 셔터가 전통적인 크세논 아크 광원과 함께 사용되어야한다. 그러나, LED 광원 및 조명 시스템은 이러한 구성 요소가 필요하지 않습니다. <ol><li> 녹화를 배치현미경 챔버를 가열 ORDING 복수 주사기 저수지 중력 유동 관류 시스템을 사용하여 37 ° C, 크렙스 완충액 2-3 ml / 분의 속도로 연속 관류를 확립한다. 진공 트랩에 연결된 모두 입력 및 흡입 라인에 공기 방울 형성​​을 방지해야합니다. </li><li> 밝은 필드 조명 아래에서 초점이 원하는 총을 가져와. 사진 표백 될 수 있습니다 조직, 과도한 노출을 피하십시오. </li><li> 신경절 내에서 FLUO-4로드 검사 및 이미징 건강한 신경을 선택합니다. 건강에 해로운 / 손상된 신경은 자기 형광 또는 반점 형태를 전시하고 영상에 사용되어서는 안된다. </li><li> 신경절가 선택되면, 카메라에 빛의 경로를 전환하고 화상 취득 소프트웨어 라이브 화상을 획득. 그 신경절가 포커스와 설정 이미지 수집 속도와 노출 시간에 있는지 확인하십시오. 참고 : 이미지 수집 속도와 시간이 수사 기록 할 이벤트에 따라 달라질 수 있습니다. 대부분의 실험, 이미지아교 칼슘 응답이 칼슘 뉴런에서 2 + 과도만큼 빠른하지 않기 때문에 전통적으로 뉴런 2-10 Hz로 신경 교세포에 대한 0.5 Hz에서까지 취득. </li><li> 실험을 시작하고 30 초 동안 기본 활동을 설정합니다. </li><li> 예컨대 2-3 ml / 분의 속도로 중력 유동 관류 시스템을 이용하여 수용체 작용제 및 길항제로서 관심 예열 약물을 적용한다. 정상 버퍼의 관류에 반환하여 작용제 / 길항제의 응용 프로그램에 따라 적어도 10 분 세척 / 회복 기간을 수 있습니다. 참고 : 약물 응용 프로그램 시간은 개별 화합물 및 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 효능 제의 20 ~ 30 초 애플리케이션은 뉴런 및 아교 세포에서 G 단백질 결합 수용체를 활성화하기에 충분하다. 하지만, (예 : 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체와 같은) 리간드 관문 이온 채널은 더 이상 적용 5-10 초의 시간을 필요로한다. 또한 기간 노출 리간드 게이트 이온 채널이 빠르게 발생할 것이다 DESEnsitize. 길항제는 수용체 경로의 완전한 차단을 보장하기 위해 약 3-15 분 동안 적용되어야한다. 그러나,이 총 일반화와 연구자들은 항상 특정 패러다임에 어떤 실험 약물을 최적화해야한다. </li><li> 실험의 기록 및보기 시간 경과 영화를 중지합니다. 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 엄선 영역 (ROI &#39;S). </li><li> 정상화의 초기 기준 형광 값과 ROI 형광 강도를 비교하는 소프트웨어를 사용합니다. 정규화 된 형광의 변화는 [칼슘]의 변화에 직접적으로 비례한다. <ol><li> ROI - ΔF / F = (F 0) / F 0 (F 1) - 사용하여 이전에 (26)를 설명하는 방법의 변경 사용 ((F 1 - F 0) / F 0) F1은 형광 주어진에있는 배경, 포인트 및 F0는 평가의 정확도를 향상시키기 위해,베이스 라인 형광이다. 이 수정 보조myenteric 신경총 기초가 근육층의 이동을 나타내는 조직의 준비 형광 변화로부터 노이즈를 감소한다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

장 신경계 (ENS)는 소화 기관 (1)의 벽에 내장 된 두 개의 ganglionated 얼기으로 구성되어 있습니다. 이 근육 내 신경 회로는, myenteric 신경 얼기 (MP) 및 점막하 신경총 (SMP)은 신경 세포와 장 아교 세포 (그림 1)이 구성된다. MP와 SMP는 장 운동 및 상피 흡수와 분비, 각각 3과 위장관 (GI)의 기능을 조절한다. 장내 아교 세포가 신경 내의 신경 세포 만 장 아교 세포의 인구 가까이에 위치하고 있습니다 또한 섬유 책자 및 창자 벽 3,4의 추가-신경절 부분을 상호 연결 내에 존재한다. 장내 아교 세포는 원래 신경 세포 만 영양 지원을 제공하기 위해 믿었다. 그러나 최근의 연구는 강하게 ENS는 5,6 기능에 대한 신경 세포 - glia 상호 작용이 필수적하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 데이터는 장 아교 세포가 신경 세포의 활동 7 &quot;수신&quot;보여그리고, 신경 회로 6,8- 변조 산화 스트레스 (9)로부터 장용성 뉴런을 보호하고 10,11 부상에 응답하여 새로운 장용성 뉴런을 생성 할 수있다. 이 기술 검토에 제시된 프로토콜은 현장 세포 내 칼슘 이미징 사용 신경과 장 아교 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 조사하는 간단하고 강력한 방법을 제공한다. 칼슘은 흥분성 세포에서 유비쿼터스 신호 분자와 신경 시스템 (12)에서 시냅스 신호 이벤트에 필수적인 역할을한다. 신경 세포 또는 장내 아교 세포의 여기 어느 유입에 의해 칼슘 -permeable 채널 또는 CA를 통해 세포 내 칼슘 상점에서 2 + 릴리스 세포 내 칼슘 농도의 상승을 이끌어 낸다. 이미징 CA의 형광 염료와 뉴런과 교세포에서 2 + 과도은 설립과 기능 조직과의 역학을 연구하는 널리 사용되는 기술이다ENS 13-17. 칼슘 이미징은 ICC의 심장 박동 네트워크 18 장 평활근 (19, 20)을 통해 흥분의 확산을 명료하게 그대로 GI 조직 세그먼트를 공부하는 중요한 도구가 될 것으로 나타났다. 그것은 생리 학적 매개 변수의 넓은 스펙트럼을 조사하는 연구를 가능하게하고 자신의 공간 분포와 시간적 동력학에 대한 정보를 제공합니다. 세포를 효율적으로 막 투과성 형광 염색 지표와 최적화 프로토콜 (21)을 이용하여 최소 침습 방식으로 염색 할 수있다. 이는 생체 내 23뿐만 아니라 기능적으로 보존 제제 14-16,22에 다수의 뉴런 및 신경교 장용성를 모니터링 할 수있는 기회를 제공한다. 전체 - 마운트 조직 제제는 칼슘 결합하면 그 형광을 증가 FLUO-4로 고친 화성 칼슘 지시 염료 로케이션 벌크있다. 형광의 변화는 CCD 카메라와 아나 기록디지털 6 분석하였으며. 칼슘의 출현은 다양한 자극에 대한 신경 세포 및 글 리아 세포의 상호 작용, 응답을 모니터링 할 수있는 기회 및 실시간 프로세스 위장관에서 이러한 세포 유형의 개입을 제공 하였다. 현장에서 칼슘 이미징은 장 신경 세포와 아교 세포의 신호 전달 메커니즘에 큰 통찰력을 산출하고 세포 배양 모델 6,24에 비해 몇 가지 뚜렷한 장점을 가지고있다. 먼저, 반응계에서 제제는 뉴런 및 신경교의 기본 매트릭스 환경을 그대로 유지하고 조직을 대상으로 그 커넥터의 대부분을 떠난다. 둘째, 유전학 및 배양 장 아교 세포의 형태는 크게 생체 6,24에 비해 변경된다. 셋째, 많은 이형 상호 작용 1 차 세포​​ 배양 손실과 세포 - 세포 상호 작용을 평가하는이 제한됩니다. 배양 된 세포는 잘 기본적인 특성 조사, 그들의 usefulne에 적합하지만장 아교 ​​세포와 신경 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 연구 SS 제한됩니다. 시냅스 경로 (25) 그대로 남아있는 현장에 접근 방법을 사용하여 조사하는 신경 세포 - glia의 상호 작용은 더 생리 학적으로 관련이있다. 세포 배양 방법에 비하여 시츄 접근 체계적 신경원과 신경교 장용성 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기위한 개선 된 조건을 제공한다. 또한, 전체 마운트 준비에 ganglionated 신경총의 평면 조직은 세포 내 칼슘 과도의 형광 이미징에 이상적이며,이 기술은 ENS에서 신경 세포 아교 세포의 활동을 평가하기위한 간단한 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Syringe Heater&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-stage microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

이 기술의 올바른 사용을 위해 조직 준비를 마운트 전체 조사자가 정확하게 세포 내 칼슘 2 + [칼슘 2 +] 나는 장 신경 세포의 과도와의 아교 세포를 측정 할 수 있습니다. 마우스 콜론에서 myenteric 신경절 내에서 아교 세포의 효능-유발 칼슘 반응의 대표적인 예는 비디오 1에 표시됩니다. 다음과 같은 결과가 우리가이 방법을 사용하여 얻은 몇 가지 대표적인 결과를 설명하기위한 것입니다. 첫째, 그림 2 장 폐해를 측정하는 실험의 결과를 보여줍니다 [칼슘] 내가 기니피그 결장 종 myenteric 근육 신경총 (LMMP) 준비 내 ATP에 의한 자극에 대한 반응의 변화. 구체적으로는,이 도면은 분석 myenteric 신경절 뉴런 및 장용성의 위치를​​ 나타내는 별표의 윤곽을 포함하여 상기 열거 실험 프로토콜의 적절한 분석을위한 방법을 도시한다. 또한 이러한 결과 전[칼슘 2 +] 난 기니 돼지 myenteric 아교 세포의 동원에 100 마이크로 몰 ATP의 최적 복용량을 llustrate. 이 응답은 장용성 신경교 자극을 교정 및 테스트 자극에 대한 반응을 정규화하기 위해 사용될 수있다. 다음으로,도 3이 제대로이자 (로아) 신경 교세포 주변 지역을 선택하는 방법 해명, 노란색 동그라미 주변으로 표시. 이러한 결과는 또한 기저 조건 및 약리학 적 자극에 대한 응답에서 원하는 형광 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 그림 4는 전체 마운트 준비에 [칼슘] 내가 응답을 장내 아교 세포와 신경 세포를 선택하기위한 공간 고려 사항을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> ENS 그림 1. 조직. ENS는 두 가지 주요 ganglionated 얼기가 포함되어 있습니다. myenteric 신경 얼기는 L 사이에 위치ongitudinal 원형 근육 층. 점막하 신경총은 점막과 원형 근육 층 사이에 위치하고 있습니다. ENS는 유일하게 신경과 장 아교 ​​세포로 구성되어 있습니다. 신경 섬유 책자가 신경을 연결합니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> 기니피그 결장 myenteric 신경 얼기 응답 그림 2. 장내 글리는 현장에서 ATP합니다. (A) myenteric 신경절 FLUO-4 형광 기저 조건 하에서 (점선으로 윤곽). 화살표는 100 μmol / L의 ATP, 신경 교세포로 자극시 (B). 두꺼운 절간 섬유 책자를 가리 아니라 신경, 빠르게 증가 FLUO-4 [칼슘]의 증가를 나타내는 형광 <sUB&gt; 전. 응답 세포가 작은 것을 참고 (별표로 표시 어두운 공간을) 훨씬 더 큰 신경을 둘러싸고 있습니다. (C) 장내 아교 세포는 1 밀리몰 / L은 최대 응답 (24)를 도출과 용량 의존적으로 ATP에 응답합니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> 현장에서 ATP 할 수있는 대장 myenteric 신경 얼기 응답 그림 3. 설치류 S-100-GFP는 + 세포. (A) S-100-GFP + 마우스 대장 myenteric 신경절의 신경 교세포 (녹색) (점선으로 설명). 이자 (로아) 신경 내의 신경 교세포 주변의 6 개 지역은 노란색 동그라미로 표시됩니다. 화살표는 신경절으로 이어지는 두꺼운 섬유 책자를 나타냅니다. 별표 D2 장 신경 세포의 enote 위치. (B) 기저 상태에서로드와-2 형광을 나타내는 같은 신경절. (C) 100 μmol / L의 ATP 자극에 따라, 신경 교세포는 [칼슘 2 +] 나는이 같은 증가 Rhod-으로 표시 증가로 응답 이 형광. (D)는 A-C에 표시된 각각의 투자 수익 (ROI)에 해당하는 추적합니다. (E) D (24)에 표시된 6 개의 ROI의 응답을 (SEM 평균 ±) &#39;평균. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> 장 신경 세포 간 아교 세포 통신의 현장 영상에서 그림 4. 칼슘 이미징 실험에서 (A) 대표 이미지 (모조) 여기서 전체 마운트myenteric 신경총의 제조 신경 P2X7 수용체 효능 BzATP (100 μM, 30 초)에 도전했다. 신경 작용제 주변 장용성 교세포 (A &quot;) 이전 뉴런 (A &#39;)에서 Fluo4 형광의 증가를 초래 있습니다. (B)을 신경교 (블루)과 뉴런의 경시 형광의 변화를 분석 (적색 ) 정상 버퍼 (실선에 BzATP에 신경 작용제, BzATP. (C) 신경 세포와 신경 교세포의 답변 응용 프로그램 다음) 및 버퍼에 신경 P2X7 수용체 (13)을 강화시키는 낮은 칼슘과 마그네슘 2+ (점선)를 포함. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 장내 아교 세포에서 비디오 1 작용제-유발 칼슘 응답현장.이 비디오는 칼슘 지시 염료, FLUO-4로드 마우스 원위부에서 myenteric 신경절을 보여줍니다. 표시된 경우 신경교 세​​포 작용제, ADP는 욕에 첨가된다. ADP가 FLUO-4 형광의 과도 상승에 의해 관찰 장 아교 세포의 세포 내 칼슘의 증가를 2+ 이끌어 낸다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K 조회수.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

비디오: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

연구

생화학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

신경과학

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

칼슘 지시약을 사용한 Rat Trigeminal Ganglion의 In vivo 시각화

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

저자 스포트라이트: 삼차신경 손상에서 신경병증성 통증의 주변 메커니즘 탐색 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

장용 신경계의 제자리 ^칼슘 이미징에서

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