Name: in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
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This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

NOTA: Le procedure seguenti che coinvolgono il tessuto da animali da laboratorio sono coerenti con le linee guida AVMA per l&#39;eutanasia degli animali 2013 e sono state approvate in anticipo dal Michigan State University IACUC. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Anestetizzare animali ricerca in una camera contenente 2,5% isoflurano in ossigeno o mettendo 3-5 ml di isoflurano liquido su un materiale assorbente sul pavimento della camera, in modo che una barriera fisica impedisce animali dal contatto diretto con l&#39;isoflurano. Test per la profondità dell&#39;anestesia pizzicando la zampa. NOTA: La profondità di anestesia è ritenuto appropriato quando non c&#39;è prelievo riflesso dell&#39;arto posteriore. Una volta adeguatamente anestetizzato, eutanasia il mouse dislocazione cervicale </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina e pulire la pelle addominale con etanolo al 70%. Utilizzare pinze per pizzicare la pelle addominale in linea mediana e usare le forbici chirurgiche per fare un supporto 6 centimetril incisione lungo la linea alba di esporre gli organi digestivi interni. </li><li> Utilizzare pinze smussato per individuare ed esporre l&#39;ileo all&#39;interno del peritoneo. Tagliare il mesentere ileale / colon con le forbici e iniziare a svelare l&#39;intestino. </li><li> Una volta che la lunghezza dell&#39;intestino è adeguatamente dipanato, intercettato distale dell&#39;intestino allo stomaco e prossimale al cieco per una preparazione ileo. Per una grande preparazione intestinale, tagliare il distale colon al cieco e prossimale al retto. </li><li> Rimuovere rapidamente il segmento intestinale e metterlo in un bicchiere con i media DMEM / F12 addizionato con 3 micron nicardipina cloridrato e 1 micron scopolamina cloridrato (di seguito denominato &quot;media&quot;) su ghiaccio. L&#39;aggiunta di questi inibitori facilita microdissezione e immagini successive paralizzando la muscolatura liscia dell&#39;intestino. </li><li> Segmento Taglio di interesse (ad esempio, digiuno, ileo, colon distale o prossimale) sulla base di marcatori anatomici stabiliti. Tipicamente utilize tessuto dal ileo distale o del colon distale. Tuttavia, utilizzare la stessa procedura di base per isolare, di carico e di immagine neuroni e glia mienterici in tutte le regioni intestinali. </li><li> Rimuovere un piccolo segmento (4-6 cm) di un segmento dell&#39;intestino desiderato e posto in una capsula di Petri Sylgard rivestite pieno di mezzi refrigerati. </li><li> Fissare l&#39;estremità prossimale e distale del segmento intestinale con perni di insetti e aprire il tubo intestinale facendo una dritta, longitudinale tagliare lungo il confine mesenterica. </li><li> Tessuto piatto sotto leggera tensione con il lato mucosa e attenzione sezionare via strato mucoso utilizzando una pinza sottile (5 # e # 5/45 di lavoro migliore) e forbici primavera molto fini Pin. NOTA: La rimozione della mucosa può essere molto traumatico per il ENS se non fatto correttamente. Per i preparati di qualità, fare attenzione a limitare brusca eliminazione della mucosa dalla secchezza o raschiamento. La pratica migliore è quello di sollevare la mucosa e tagliare con le forbici sotto pregiati. </li><li> Tagliare il tessuto in preparazione più piccolos (circa 0,5 cm2) e pin in piatti di imaging (4 angoli con strato muscolare circolare verso l&#39;alto) immessi sul ghiaccio con mezzi freschi. </li><li> Sezionare con attenzione via muscolo circolare da prendere in giro a parte con le pinzette sottili per esporre il plesso mioenterico. Evitare eccessivo allungamento. </li><li> Porre piatto di imaging indietro soluzione ghiaccio e il cambiamento con mezzi freschi. </li><li> Preparare 2 ml di miscela enzimatica per piatto [dispasi 1 U / ml (4.48 mg / 8 ml), Collagenase Tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) nei media]. </li><li> Rimuovere piatti da ghiaccio e aggiungere il mix enzima dal punto 1.13. </li><li> Incubare piatti a temperatura ambiente per 15 minuti con 5% di CO 2/95% di aria. </li><li> Preparazioni di tessuto Lavare con i media 3 volte e angoli re-pin. </li></ol> 2. Loading Fluo-4 Dye NOTA: Evitare photobleaching lavorando con la luce limitata durante la manipolazione di coloranti fluorescenti e tessuto carichi di indicatore coloranti. <ol><li> Preparare 4 mM Fluo-4 soluzione di carico. <ol><li> Aggiungere 1,5 ml media e 1,2 ml di una probenecid magazzino 250 mm ad un&#39;aliquota di 1,5 ml di 4 mm Fluo-4 stock. 4 mM Fluo-4 stock viene preparato aggiungendo 11,4 ml di Pluronic F-127 (20% in DMSO; integrato con 0,25% cremaphor-EL) a 50 mg di Fluo-4, AM. </li></ol></li><li> Incubare preparazioni in Fluo-4 soluzione di carico per 45 minuti in un incubatore buio a 37 ° C. </li><li> Togliere dal incubatore e lavare preparazioni di media 3 volte. </li><li> Mezzi di scambio per supporti contenente 200 mM probenecid e incubare 15 min a 37 ° C prima di imaging. NOTA: Probenecid è un farmaco che inibisce trasportatori di resistenza ai farmaci in neuroni. L&#39;aggiunta di questo farmaco inibisce la capacità dei neuroni di estrudere coloranti e migliora etichettatura neuronale. Bulk-caricamento di Ca 2+ indicatori coloranti in assenza di probenecid produce principalmente gliali loading cellule. L&#39;aggiunta di probenecid permette la visualizzazione delle risposte neuronali e gliali. </li><li> Preparare Modified KreBuffer bs. <ol><li> Fare un tampone Krebs modificato tale che le concentrazioni finali (in mM) dei componenti sono come segue: 121 NaCl, KCl 5,9, CaCl 2 2,5, 1,2 MgCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, 1 piruvico acidi e 8 glucosio (pH aggiustato a 7,4 con NaOH). Aggiungere 3 micron nicardipina e 1 micron scopolamina per inibire le contrazioni muscolari durante Ca 2+ imaging e tutto il montaggio dissezioni. </li></ol></li></ol> 3. Imaging e analisi NOTA: utilizzare almeno un impianto di imaging di base con una sorgente di luce fluorescente, microscopio, una camera CCD di qualità e adeguato software di acquisizione. Variare l&#39;aggiunta di altri componenti a seconda della sorgente di luce e l&#39;applicazione specifica. Una ruota del filtro e otturatore devono essere usati con una sorgente di luce allo xeno ad arco tradizionale. Tuttavia, fonti di luce LED e sistemi di illuminazione non richiedono tali componenti. <ol><li> Posizionare il recording camera sotto il microscopio e utilizzando un sistema di perfusione a gravità con più serbatoi siringa riscaldati stabilire un tasso perfusione continua di 2-3 ml / min a 37 ° C tampone Krebs. Assicurati di evitare la formazione di bolle d&#39;aria sia nella linea di ingresso e di aspirazione collegato ad una trappola del vuoto. </li><li> Portare il plesso desiderati a fuoco in condizioni di illuminazione in campo chiaro. Evitare sovraesposizione del tessuto, che può portare a foto sbiancamento. </li><li> Esaminare il Fluo-4 di carico all&#39;interno dei gangli e selezionare gangli sano per l&#39;imaging. Malsano gangli / danneggiati esporranno autofluorescenza o puntata morfologia e non devono essere utilizzati per l&#39;imaging. </li><li> Una volta selezionato ganglio, deviare il percorso della luce per fotocamera e di ottenere immagini dal vivo con il software di acquisizione delle immagini. Assicurarsi che ganglio è a fuoco e impostare l&#39;immagine di tasso di acquisizione e di esposizione volte. NOTA: i tassi di acquisizione delle immagini e tempi variano a seconda degli eventi investigatori vogliono registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immaginisono tradizionalmente acquisita a 0,5-1 Hz per le cellule gliali e fino a 2-10 Hz per i neuroni, perché gliali Ca 2+ risposte non sono così rapidi come Ca 2+ transitori nei neuroni. </li><li> Inizia esperimento e stabilire attività di base per 30 sec. </li><li> Applicare farmaci preriscaldate di interesse come agonisti e antagonisti del recettore utilizzando il sistema di perfusione a gravità ad una velocità di 2-3 ml / min. Seguire applicazione di agonisti / antagonisti ritornando ad una perfusione di tampone normale e consentire un periodo di wash / recupero di almeno 10 min. NOTA: I tempi Drug Application varieranno a seconda del composto individuale e disegno sperimentale. In generale, un&#39;applicazione 20-30 sec di agonista è sufficiente per attivare G-proteine ​​recettori accoppiati in neuroni e cellule gliali. Tuttavia, i canali ionici ligando-dipendenti (come i recettori nicotinici) richiedono tempi di applicazione di non più di 5-10 sec. Ulteriori esposizioni durata causerà canali ionici ligando gated a Dese rapidamentensitize. Antagonisti dovrebbero essere applicate per circa 3-15 minuti per garantire la completa blocco delle vie del recettore. Tuttavia, questa è una generalizzazione lordo e investigatori deve sempre ottimizzare qualsiasi farmaco sperimentale in loro particolare paradigma. </li><li> Interrompere la registrazione e visualizzazione di film time-lapse dell&#39;esperimento. Selezionare con attenzione regioni di interesse (ROI) utilizzando il software di analisi di immagine appropriata. </li><li> Utilizzare software per normalizzare e confrontare l&#39;intensità fluorescenza ROI contro il suo valore di base fluorescente iniziale. Le variazioni nella fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle variazioni [Ca 2+]. <ol><li> Utilizzare una modifica di un metodo descritto in precedenza 26 con Af / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) sfondo, dove F1 è la fluorescenza in un dato point e F0 è la fluorescenza basale, per migliorare la precisione di valutazione. Questo aiuti modificanella riduzione del rumore da variazioni di fluorescenza in preparati tissutali che mostrano il movimento dello strato muscolare sottostante plesso mioenterico. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

Il sistema nervoso enterico (ENS) è organizzata in due plessi ganglionated incorporato all&#39;interno della parete del tubo digerente 1. Questi circuiti neurali intramuscolari, plesso mienterico (MP) e sottomucosa plesso (SMP), sono composti da neuroni e glia enterica (Figura 1) 2. Il deputato e SMP regolano gastrointestinali (GI) funzioni come la motilità intestinale e l&#39;assorbimento epiteliale e la secrezione, rispettivamente, 3. Glia enterica si trovano in prossimità di neuroni all&#39;interno gangli ma le popolazioni di glia enterica esistono anche all&#39;interno di interconnessione tratti di fibre e porzioni extra-gangliari della parete intestinale 3,4. Glia enterici sono stati originariamente credeva di fornire solo il supporto nutritivo per i neuroni. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che le interazioni neuroni-glia sono essenziali per ENS funziona 5,6. Ad esempio, i dati mostrano che glia enterica &quot;ascoltare&quot; per l&#39;attività neuronale 7e modulare circuiti neuronali 6,8, proteggere i neuroni enterici dallo stress ossidativo 9 e sono in grado di generare nuovi neuroni enterici in risposta al danno 10,11. Il protocollo presentato in questa tecnica offre un metodo semplice e robusto per esaminare la complessa interazione tra neuroni e glia enterica utilizzando in situ intracellulare Ca 2+ imaging. Ca 2+ è una molecola di segnalazione ubiquitario nelle cellule eccitabili e svolge un ruolo essenziale in eventi di segnalazione sinaptica nel sistema nervoso 12. Eccitazione dei neuroni o glia enterica suscita un aumento della concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ sia afflusso attraverso Ca 2+ canali -permeable o Ca 2+ rilascio dai depositi intracellulari di calcio. Imaging Ca 2 + transitori in neuroni e glia con coloranti fluorescenti è un fondato e tecnica ampiamente utilizzata per studiare l&#39;organizzazione funzionale e dinamica dell&#39;ENS 13-17. Ca 2+ di imaging ha dimostrato di essere uno strumento importante per studiare i segmenti di tessuto GI intatte per chiarire la diffusione di eccitabilità attraverso ICC reti pacemaker 18 e intestino muscolatura liscia 19,20. Esso consente ai ricercatori di sondare un ampio spettro di parametri fisiologici e fornisce informazioni sia la loro distribuzione spaziale e la dinamica temporale. Le celle possono essere efficacemente colorati in modo minimamente invasivo utilizzando indicatori fluorescenti membrana permeabile e protocolli di colorazione ottimizzati 21. Ciò offre la possibilità di controllare un gran numero di neuroni e glia enterica in preparazioni funzionalmente conservati 14-16,22, così come in vivo 23. -Montaggio interi preparati di tessuto sono di massa caricato con un alta affinità Ca 2+ colorante indicatore come Fluo-4 che ne aumenta la fluorescenza quando si lega a Ca 2+. Le variazioni di fluorescenza sono registrate da una telecamera CCD e anazati digitalmente 6. L&#39;avvento di Ca 2+ ha fornito la possibilità di controllare neuroni e cellule gliali interazioni, risposta a vari stimoli, e il coinvolgimento di questi tipi di cellule nei processi gastrointestinali in tempo reale. In situ Ca 2+ di imaging ha dato grande intuizione dei meccanismi di segnalazione di neuroni enterici e glia e possiede diversi vantaggi rispetto ai modelli di coltura cellulare 6,24. In primo luogo, in situ preparati mantenere l&#39;ambiente di matrice nativa di neuroni e glia e lasciano la maggior parte delle loro connessioni con il tessuto intatto bersaglio. In secondo luogo, la genetica e la morfologia di colta glia enterica sono significativamente modificati rispetto al vivo 6,24. In terzo luogo, molte interazioni eterotipiche si perdono in colture cellulari primarie e questo limite valutazione interazioni cellula-cellula. Anche se le cellule coltivate sono particolarmente adatte per le indagini di proprietà fondamentali, la loro usefulness per studiare le interazioni complesse tra glia e neuroni enterici è limitata. Indagare interazione neuroni-glia utilizzando un approccio in situ è fisiologicamente più rilevante come i percorsi sinaptici rimangono intatti 25. Rispetto agli approcci di coltura cellulare, un approccio in situ offre migliori condizioni per la comprensione sistematica delle interazioni complesse tra i neuroni e glia enterica. Inoltre, l&#39;organizzazione planare del plesso ganglionated nei preparati tutto il montaggio è ideale per l&#39;imaging fluorescente intracellulari di Ca 2+ transitori e questa tecnica offre un approccio diretto per valutare l&#39;attività dei neuroni-glia nella ENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Syringe Heater&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-stage microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

L&#39;uso corretto di questa tecnica permette ai ricercatori di misurare con precisione intracellulare Ca 2+ [Ca 2+] i transitori nei neuroni enterici e glia in tutto il montaggio preparazioni di tessuto. Un esempio rappresentativo di un agonista-evocato Ca 2+ risposte in glia all&#39;interno di un ganglio myenteric dal colon del mouse è mostrato in Video 1. I risultati seguenti hanno lo scopo di illustrare alcuni risultati rappresentativi che abbiamo ottenuto con questo metodo. In primo luogo, la figura 2 illustra i risultati di un esperimento di misurazione gliali enteriche [Ca 2+] i cambiamenti in risposta alla stimolazione con ATP all&#39;interno cavia del colon longitudinale plesso muscolare mienterico (LMMP) preparati. Specificamente, questa figura mostra il metodo per la corretta analisi del protocollo sperimentale sopra elencati compreso il contorno del ganglio myenteric analizzato e asterischi denotano la posizione dei neuroni enterici. Questi risultati anche illustrate la dose ottimale di un centinaio micromolar ATP sulla mobilitazione del [Ca 2+] i nella cavia glia myenteric. Questa risposta può essere utilizzata per calibrare la stimolazione gliale enterica e normalizzare risposte per testare stimoli. Avanti, Figura 3 chiarisce come selezionare correttamente regioni di interesse (ROI) che circonda le cellule gliali, mostrato con circostante cerchi gialli. Questi risultati mostrano anche le variazioni di fluorescenza desiderati in condizioni basali e in risposta a stimoli farmacologici. Infine, la Figura 4 mostra le considerazioni spaziali per la scelta glia enterica e neuroni per [Ca 2+] i risposte in preparati tutto il montaggio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figura 1. Organizzazione della ENS. L&#39;ENS contiene due grandi plessi ganglionated. Il plesso mienterico si trova tra l&#39;lstrati muscolari ongitudinal e circolari. Il plesso sottomucosa si trova tra la mucosa e lo strato muscolare circolare. L&#39;ENS è esclusivamente composto da neuroni e glia enterica. Tratti di fibre del nervo collegano gangli. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figura 2. enterica glia nella cavia del colon plesso mioenterico rispondere alle atp in situ. (A) Fluo-4 fluorescenza in un ganglio mienterici (illustrato a tratteggio) in condizioni basali. Le frecce indicano spessi tratti di fibre interganglionic. (B) Dopo stimolazione con 100 mmol / L ATP, le cellule gliali, ma non i neuroni, aumentano rapidamente Fluo-4 fluorescenza indica un aumento di [Ca 2+] <sub&gt; i. Si noti che le cellule che rispondono sono piccole e circondano i neuroni molto più grandi (spazi bui contrassegnati da un asterisco). (C) glia enterica rispondere alle ATP in modo dose-dipendente con 1 mmol / L suscitare risposte massime 24. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Figura 3. murino S-100-GFP + cellule del colon plesso rispondere mienterico ATP in situ. (A) cellule gliali (verde) in un mouse del colon ganglio mienterico S-100-GFP + (delineati dalla linea tratteggiata). Sei regioni di interesse (ROI) che circonda le cellule gliali all&#39;interno dei gangli sono mostrate come cerchi gialli. Le frecce indicano tratti di fibre spesse portano nel ganglio. Asterischi dposizione enote di 2 neuroni enterici. (B) Stesso ganglio mostrando Rhod-2 fluorescenza in condizioni basali. (C) A seguito di stimolazione con 100 mmol / L ATP, le cellule gliali rispondono con un aumento [Ca 2+] i, come indicato da un aumento Rhod- 2 di fluorescenza. (D) Tracce corrispondente a ciascun ROI mostrato in A-C. (E) la risposta media (media ± SEM) delle 6 ROI mostrati in D 24. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Figura 4. In situ imaging comunicazione enterica neurone-to-glia. (A) Immagini rappresentative (pseudocolored) da un esperimento di imaging Ca 2+ in cui un intero-mountpreparazione del plesso mioenterico è stata impugnata con l&#39;agonista del recettore neuronale P2X7 BzATP (100 micron, 30 sec). Si noti che l&#39;agonista neuronale provoca un aumento della fluorescenza Fluo4 nel neurone (A &#39;) prima che le cellule circostanti enteriche gliali (A &quot;). (B) Analisi della variazione di fluorescenza nel tempo glia (blu) e neuroni (rosso ) in seguito all&#39;applicazione del agonisti neuronale, BzATP. (C) neuronale e risposte gliali a BzATP in tampone normale (linee continue) e in tampone contenente bassa Ca 2+ e Mg 2+ (linee tratteggiate) per potenziare i recettori P2X7 neuronali 13. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Video 1. Agonist-evocato Ca 2+ risposta glia enterica insitu. Questo video mostra un ganglio myenteric dal mouse colon distale caricato con il Ca 2+ colorante indicatore, Fluo-4. L&#39;agonista cellule gliali, ADP, viene aggiunto al bagno quando indicato. ADP suscita un aumento intracellulare Ca 2+ in glia enterica come ha rilevato l&#39;innalzamento transitorio in Fluo-4 fluorescenza. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K Views.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Video: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Ricerca

Biochimica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscienze

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Visualizzazione in vivo del ganglio trigemino di ratto con indicatori di calcio

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

Autore in primo piano: Esplorazione dei meccanismi periferici del dolore neuropatico nella lesione del nervo trigemino 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

In Situ Ca ²⁺ Imaging del sistema nervoso enterico

Riepilogo

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli