Name: in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System at JoVE.com

This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

הערה: ההליכים הבאים הכרוכים ברקמה מחיות מעבדה עולים בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים 2013 ואושרו מראש על ידי IACUC אוניברסיטת מדינת מישיגן. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים מחקר בתא המכיל isoflurane 2.5% בחמצן או על ידי הצבת 3-5 מיליליטר של נוזל על isoflurane חומר סופג על הרצפה של החדר, על מנת להבטיח כי מכשול פיזי מונע מבעלי חיים מגע ישיר עם isoflurane. מבחן לעומק הרדמה על ידי צובט את השודד. הערה: עומק ההרדמה נחשב מתאים כאשר אין רפלקס נסיגה של הגפיים האחורי. ברגע שהרדים כראוי, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה ולנקות את עור בטן עם אתנול 70%. שימוש במלקחיים לצבוט עור בטן בקו האמצע ולהשתמש במספריים כירורגית כדי להפוך את תקשורת 6 סנטימטרחתך l לאורך alba linea לחשוף איברי עיכול פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בוטים לאתר ולחשוף את המעי בתוך הצפק. חותך את לפדר ileal / מעי גס עם מספריים ולהתחיל לפרום את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאורכו של המעי נפרם כראוי, לחתוך את דיסטלי המעי אל הקיבה והפרוקסימלי לcecum להכנת מעי. להכנת מעי גסה, לחתוך את דיסטלי המעי הגס לcecum והפרוקסימלי לפי הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את קטע המעי ולמקם אותו בכוס עם תקשורת DMEM / F12 בתוספת hydrochloride nicardipine 3 מיקרומטר ו1 מיקרומטר hydrochloride scopolamine (המכונה &quot;תקשורת&quot; להלן) על קרח. התוספת של מעכבים אלו, מסייעת microdissection והדמיה לאחר מכן על ידי משתק את שריר החלק במעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע Cut של עניין (למשל, מעי ריק, מעי, מעי גס דיסטלי או הפרוקסימלי) המבוסס על סמנים אנטומיים הוקמו. בדרך כלל utilizרקמת דואר מהמעי הדיסטלי או המעי הגס דיסטלי. עם זאת, להשתמש באותו ההליך בסיסי לבודד, הנוירונים myenteric עומס ותמונה וגליה בכל האזורים במעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קטע קטן (4-6 סנטימטר) של קטע מעי רצוי ומניחים בצלחת פטרי מצופה Sylgard מלאה תקשורת מצוננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure הפרוקסימלי וקצוות מרוחקים של קטע המעי עם סיכות חרקים ולפתוח את צינור המעיים על ידי ביצוע ישר, חתך לאורכו לאורך גבול mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת פין שטוחה תחת מתח אור עם צד רירית וזהירות לנתח משם שכבה רירית באמצעות מלקחיים עדינים (מס &#39;5 ו# 5/45 עבודה הטובה ביותר) ומספריים באביב יפים מאוד. הערה: הסרת הרירית יכולה להיות די טראומטית עבור ENS אם לא נעשה כראוי. להכנות איכות, דואגים להגביל ההסרה פתאומית של הרירית על ידי קילוף או גירוד. התרגול הטוב ביותר הוא להסיר את הרירית ולחתוך עם מספריים מתחת קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרקמה לתוך הכנה קטנהs (כ 0.5 סנטימטר 2) וסיכה לתוך מנות הדמיה (4 פינות עם שכבת שריר מעגלית כלפי מעלה) הניחה על קרח עם תקשורת טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את שריר מעגלי על ידי מתגרה בנפרד עם פינצטה בסדר לחשוף את מקלעת myenteric. הימנע ממתיחה מוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת הדמיה חזרה על פתרון קרח ושינוי עם תקשורת טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מיליליטר של תערובת אנזים לכל צלחת [Dispase 1 U / ml (4.48 מ&quot;ג / 8 מיליליטר), Collagenase סוג II 150 U / ml (5.45 מ&quot;ג / 8 מיליליטר) בתקשורת]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מנות מהקרח ולהוסיף את תערובת האנזים מהצעד 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מנות ב RT למשך 15 דקות עם 5% CO 2/95% אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנות רקמות לשטוף עם תקשורת 3 פעמים ובפינות מחדש פינים. </li></ol> 2. טוען Fluo-4 Dye הערה: הימנע photobleaching ידי עבודה עם אור מוגבל בזמן טיפול צבעי ניאון ורקמה עמוס צבעי מחוון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 פתרון טעינת Fluo-4 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.5 מיליליטר תקשורת ו -1.2 μl של מניית probenecid 250 מ&quot;מ לaliquot 1.5 μl של 4 מ&quot;מ מניית Fluo-4. 4 מ&quot;מ מניית Fluo-4 הוא הוכן על ידי הוספת 11.4 μl של F-127 pluronic (20% בDMSO; בתוספת 0.25% cremaphor-EL) 50 מיקרוגרם של Fluo-4, בבוקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה preps בפתרון טעינת Fluo-4 במשך 45 דקות בחממה כהה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מן החממה ולשטוף הכנות עם תקשורת 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת תמורת מדיה המכילה 200 מיקרומטר probenecid דגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה. הערה: probenecid הוא תרופה מעכבת מובילי התנגדות multidrug בתאי עצב. תוספת של תרופה זו מעכבת את היכולת של תאי עצב כדי למתוח צבעים ומשפרת תיוג עצבי. תפזורת-טעינה של Ca 2 + צבעי מחוון בהעדר probenecid מייצרת טעינת תא בעיקר גליה. התוספת של probenecid מאפשרת הדמיה של תגובות עצביות וגליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השתנה Kreמאגר BS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חיץ קרבס שונה כך שהריכוזים הסופיים (מ&quot;מ) של הרכיבים הם אחריו כמו: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, pyruvic 1 חומצה ו -8 גלוקוז (pH מותאם ל7.4 עם NaOH). הוסף 3 nicardipine מיקרומטר וscopolamine 1 מיקרומטר לעכב התכווצויות שרירים במהלך Ca 2 + הדמיה וכל הר והניתוחים. </li></ol></li></ol> 3. הדמיה וניתוח הערה: השתמש לפחות מתקן הדמיה בסיסי עם מקור אור ניאון, מיקרוסקופ, מצלמת CCD באיכות ותוכנת רכישה מתאימה. להשתנות בתוספת רכיבים אחרים בהתאם למקור האור ויישום ספציפי. גלגל לסנן ותריס יש להשתמש במקור אור קשת קסנון מסורתי. עם זאת, מקורות אור LED ומערכות תאורה לא דורשים רכיבים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את recOrding תא מתחת למיקרוסקופ ובאמצעות מערכת הזרימה זלוף הכבידה עם מאגרי מזרק מחוממים מרובים להקים שיעור זלוף רציף של 2-3 מיליליטר / דקה 37 ° C חיץ קרבס. ודא כדי למנוע היווצרות בועת אוויר בשתי שורת הקלט והיניקה מחוברת למלכודת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את המקלעת הרצויה אל מוקד תחת תאורה בשדה בהירה. הימנע overexposing רקמה, דבר שעלול להוביל להלבנת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את טעינת Fluo-4 בתוך הגרעינים ובחר הגרעינים בריאים הדמיה. הגרעינים לא בריאים / פגומים יפגינו מורפולוגיה autofluorescence או punctate ולא אמור לשמש להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגנגליון נבחר, להסיט את נתיב אור למצלמה ולקבל תמונת חיה עם תוכנת רכישת תמונה. ודא גנגליון שהוא בזמני מיקוד וקצב רכישת תמונה מוגדר וחשיפה. הערה: שיעורי רכישת תמונה וזמנים משתנים בהתאם לאירועי חוקרים רוצים להקליט. עבור רוב הניסויים, תמונותנרכשים באופן מסורתי ב0.5-1 הרץ לתאי גלייה ועד 2-10 הרץ לנוירונים כי Ca 2 + תגובות גליה אינן מהירות כמו Ca 2 + ארעיים בתאי עצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בניסוי ולהקים פעילות בסיסית למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תרופות מחוממות מראש של עניין, כגון אגוניסטים לקולטן ואת יריבים באמצעות מערכת זלוף זרימת כוח הכבידה בשיעור של 2-3 מיליליטר / דקה. עקוב יישום של אגוניסטים / יריבים על ידי חזרה לזלוף של חיץ רגיל ולאפשר תקופת לשטוף / התאוששות של לפחות 10 דקות. הערה: זמני יישום התרופה ישתנו בהתאם למתחם הפרט ותכנון ניסויים. באופן כללי, יישום 20-30 שניות של אגוניסט מספיק להפעלת הקולטנים בשילוב G-חלבון בתאי עצב ותאי גליה. עם זאת, תעלות יונים מגודרת ליגנד (כגון קולטני אצטילכולין ניקוטינית) דורשות פעמים יישום של לא יותר מ 5-10 שניות. חשיפות משך נוספות תגרום תעלות יונים יגנד מגודרות למהירות את אלהnsitize. יריבים צריכים להיות מיושמים על כ 3-15 דקות כדי להבטיח מצור של מסלולי קולט מלא. עם זאת, מדובר בהכללה גסה וחוקרים תמיד צריכים לייעל את כל תרופה ניסיונית בפרדיגמה המסוימת שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק סרט הזמן לשגות הקלטה ותצוגה של הניסוי. אזורים נבחרים בקפידה של עניין (של ROI) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתוכנה כדי לנרמל ולהשוות עוצמת ניאון ROI נגד ערך ניאון בסיס הראשוני שלה. שינויים בקרינה מנורמלת הם ביחס ישר לשינויים ב[ Ca 2 +]. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשינוי של שיטה שתואר קודם לכן 26 באמצעות ΔF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) רקע, שבו F1 הוא הקרינה בכל רגע נתון נקודה וF0 הוא הקרינה תחילת המחקר, כדי לשפר את דיוק ההערכה. עזרי שינוי זהבהפחתת רעש משינויי הקרינה בהכנות רקמה שמפגינים תנועה של שכבת שריר בסיס מקלעת myenteric. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+of+origin+of+neurons+in+the+murine+enteric+nervous+system:+sequence+in+relation+to+phenotype.">Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).</li><li>Nasser, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+enteric+glia+in+intestinal+physiology:+effects+of+the+gliotoxin+fluorocitrate+on+motor+and+secretory+function.">Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+in+the+gut.">Glial cells in the gut.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 17 (6), 777-790 (2005).</li><li>Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++transients+in+myenteric+glial+cells+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> J. Physiol. 590, 335-350 (2012).</li><li>Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+targets+of+the+sympathetic+innervation+of+the+myenteric+plexus+in+the+guinea+pig+distal+colon.">Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon.</a> J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).</li><li>McClain, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Responses+in+Enteric+Glia+Are+Mediated+by+Connexin-43+Hemichannels+and+Modulate+Colonic+Transit+in+Mice.">Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li><li>Chandrasekharan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motor+dysfunction+in+human+diabetes+is+associated+with+enteric+neuronal+loss+and+increased+oxidative+stress.">Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55, 630-637 (2006).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+P2X7+receptor-pannexin-1+mediates+death+of+enteric+neurons+during+colitis.">Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis.</a> Nat Med. 18, 600-604 (2012).</li><li>Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+activity+in+different+classes+of+myenteric+neurons+underlying+the+migrating+motor+complex+in+the+murine+colon.">Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon.</a> J Physiol. 588, 399-421 (2010).</li><li>Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+transients+in+submucous+neurons+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).</li><li>Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soma+and+neurites+of+primary+afferent+neurons+in+the+guinea-pig+intestine+respond+differentially+to+deformation.">The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation.</a> J Physiol. 526, 375-385 (2000).</li><li>Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+the+gastrointestinal+tract:+mapping+the+human+enteric+nervous+system.">Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system.</a> Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spread+of+pacemaker+activity+in+through+ICC+in+guinea-pig+antrum.">Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum.</a> Neurogastro Motil. 14, 575 (2001).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+organization+of+Ca2++waves+by+enteric+neural+reflexes.">Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes.</a> Nature. 399, 62-66 (1999).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+neural+regulation+of+calcium+waves+in+longitudinal+and+circular+muscle+layers+of+guinea-pig+small+intestine.">Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine.</a> Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).</li><li>Jessen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-like+glia+in+the+peripheral+nervous+system:+an+immunohistochemical+study+of+enteric+glia.">Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia.</a> Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).</li><li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-dependent+paracrine+communication+between+enteric+neurons+and+glia+in+a+primary+cell+culture+derived+from+embryonic+mice.">ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+neuron-to-glia+signaling+in+the+enteric+nervous+system.">Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).</li><li>Ren, J., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+and+synaptic+transmission+in+enteric+neurons.">Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons.</a> Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Dongcheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+regionalisation+for+enteric+nervous+system+formation:+implications+for+Hirschsprung's+disease+and+stem+cell+therapy.">Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy.</a> Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+an+enteric+neuron+there+may+lie+a+glial+cell.">Behind an enteric neuron there may lie a glial cell.</a> J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).</li><li>Boesmans, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuron-glia+interactions+in+the+enteric+nervous+system.">Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

מערכת העצבים enteric (ENS) מאורגנת בשני plexuses ganglionated המוטבע בקיר של מערכת עיכול 1. מעגלים עצביים לשריר אלה, מקלעת myenteric (MP) ומקלעת submucosal (SMP), מורכבים מתאי עצב וגליה enteric (איור 1) 2. MP וSMP להסדיר עיכול פונקציות (GI) כגון תנועתיות מעיים וספיגת אפיתל והפרשה, בהתאמה 3. גליה מעיים נמצאות בסמיכות לתאי עצב בתוך הגרעינים אבל אוכלוסיות של גליה enteric גם קיימות בתוך מקשר קטעי סיבים וחלקים נוספים-ganglionic של קיר בטן 3,4. גליה מעיים האמינו במקור כדי לספק תמיכה תזונתית רק לתאי עצב. עם זאת, מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על כך שנוירון, גליה אינטראקציות חיוניות לENS מתפקד 5,6. לדוגמא, הנתונים מראים כי גליה enteric &quot;להקשיב&quot; לפעילות עצבית 7ולווסת את המעגלים עצביים 6,8, להגן על תאי עצב enteric מלחץ חמצוני 9 והם מסוגלים לייצר תאי עצב חדשים enteric בתגובה לפציעה 10,11. הפרוטוקול המובא בסקירה טכנית זו מספק שיטה פשוטה וחזקה כדי לבחון את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב וגליה enteric באמצעות הדמיה Ca 2 + תאית אתרו. Ca 2 + הוא מולקולת איתות בכל מקום בתאים להתרגש וממלא תפקיד חיוני באירועי איתות הסינפטי במערכת העצבים 12. עירור של תאי עצב או גליה enteric מעורר העלאה בריכוז Ca 2 + cytoplasmic או על ידי זרם דרך Ca 2 + ערוצי -permeable או Ca 2 + שחרור מחנויות סידן תוך תאי. ההדמיה Ca 2 + ארעיים בתאי עצב וגליה עם צבעי ניאון הוא הוקם וטכניקה בשימוש נרחבת כדי ללמוד את הארגון ואת הדינמיקה של תפקודיים13-17 ENS. ההדמיה Ca 2 + הוכח להיות כלי חשוב בלימוד קטעי רקמה במערכת העיכול ללא פגע על מנת להבהיר את ההתפשטות של רגישות באמצעות רשתות ICC קוצב לב 18 ושריר חלק במעי 19,20. זה מאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של פרמטרים פיסיולוגיים ומספק מידע על שתי הפריסה המרחבית שלהם ודינמיקה זמנית. תאים יכולים להיות מוכתמים ביעילות באופן פולשנית ידי שימוש באינדיקטורים ניאון קרום חדיר ופרוטוקולים מכתים מותאמים 21. זה מציע הזדמנות לעקוב אחר מספר גדול של תאי עצב וגליה enteric בהכנות השתמרו תפקודי 14-16,22, כמו גם in vivo 23. הכנות רקמת הר-שלמות הן בתפזורת עמוסה Ca 2 + צבע מחוון גבוהה זיקה כגון Fluo-4, המגבירה הקרינה שלה כאשר חייב Ca 2 +. שינויים בקרינה נרשמים על ידי מצלמת CCD וanaדיגיטלי 6 lyzed. כניסתו של Ca 2 + סיפקה את ההזדמנות כדי לפקח על אינטראקציות תא עצב ותאי גליה, היענות לגירויים שונים, ומעורבותם של סוגי התאים בתהליכי עיכול בזמן אמת. באתר ההדמיה Ca 2 + הניבה תובנה גדולה לתוך מנגנוני האיתות של תאי עצב וגליה enteric ובעל כמה יתרונות ברורים על פני דגמי תרבית תאים 6,24. ראשית, באתר הכנות לשמור על סביבת מטריצת יליד נוירונים וגליה ולהשאיר את חלק הארי של הקשרים שלהם כדי למקד את הרקמה שלמה. שנית, הגנטיקה והמורפולוגיה של גליה enteric בתרבית באופן משמעותי בהשוואה לשינו in vivo 6,24. שלישית, אינטראקציות רבות heterotypic הולכים לאיבוד בתרבית תאים ראשוני וזה מגביל הערכת אינטראקציות תא-תא. למרות שתאים בתרבית מתאימים גם לחקירה של תכונות בסיסיות, usefulness לחקר אינטראקציות מורכבות בין גליה ונוירונים enteric מוגבל. גומלין נוירון, גליה חוקר באמצעות באתר גישה הוא יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמסלולים הסינפטי נותרו על כנן 25. בהשוואה לגישות תרבית תאים, בגישה באתר מציע תנאים משופרים לשיטתיים הבנת האינטראקציות המורכבות בין תאי עצב וגליה enteric. יתר על כן, הארגון מישוריים של מקלעת ganglionated בהכנות כל הר הוא אידיאלי עבור הדמיה ניאון של Ca 2 + ארעיים תאיים וטכניקה זו מספקת גישה פשוטה להערכת פעילות נוירון, גליה בENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Syringe Heater&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-stage microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

שימוש נכון בטכניקה זו מאפשרת לחוקרים למדוד במדויק Ca 2 + i תאית ארעיים [Ca 2 +] בנוירונים enteric וגליה בכל הר הכנות רקמות. דוגמא מייצגת של 2 + תגובות Ca העורר אגוניסט בגליה בתוך הגנגליון myenteric מהמעי גס העכבר מוצגת בוידאו 1. התוצאות הבאות נועדו כדי להמחיש כמה תוצאות נציג השגנו בשיטה זו. ראשית, איור 2 מדגים את התוצאות של ניסוי מדידת גליה enteric [Ca 2 +] i שינויים בתגובה לגירוי על ידי ATP בהכנות שפן ניסיונות הגס מקלעת שריר myenteric אורכית (LMMP). באופן ספציפי, נתון זה מראה את השיטה לניתוח נכון של פרוטוקול הניסוי המפורט לעיל כולל את קווי המתאר של גנגליון myenteric ניתח וכוכביות מציין את המיקום של נוירונים enteric. תוצאות אלו גם illustrate המינון האופטימלי של ה- ATP מאה מייקרו על הגיוס של חזיר ים אני בגליה myenteric [Ca 2 +]. תגובה זו יכולה לשמש כדי לכייל את גירוי גליה enteric ולנרמל את התגובות לגירויים לבדוק. בשלב הבא, איור 3 מבהיר כיצד לבחור כראוי אזורים של העניין (ROIs) המקיף את תאי גליה, מוצג עם סובבי עיגולים צהובים. תוצאות אלו מראות גם הרצויות שינויי הקרינה בתנאים בסיסיים ובתגובה לגירויים תרופתיים. לבסוף, איור 4 מדגים את השיקולים מרחביים לבחירת גליה ונוירונים enteric לi תגובות [2 + Ca] בהכנות כל הר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> איור 1. ארגון של ENS. ENS מכיל שני plexuses ganglionated גדול. מקלעת myenteric ממוקמת בין lשכבות שרירים ongitudinal ומעגליות. מקלעת submucosal ממוקמת בין הרירית ושכבת השריר המעגלית. ENS מורכב אך ורק של תאי עצב וגליה enteric. שטחי סיבי עצב להתחבר הגרעינים. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> איור 2. גליה מעיים במגיבים מקלעת myenteric המעי הגס שפן הניסיונות לATP באתר. Fluo-4 הקרינה בגנגליון myenteric (א) (שתואר על ידי קו מקווקו) בתנאים בסיסיים. חיצים מצביעים על קטעי סיבי interganglionic עבים. (ב) על הגירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה, אבל לא תאי עצב, להגדיל במהירות Fluo-4 הקרינה המצביעה על עלייה ב[ Ca 2 +] <sUB&gt; i. שים לב שתאים מגיבים הם קטנים ומקיפים את הנוירונים גדולים בהרבה (חללים אפלים שסומנו על ידי כוכביות). גליה מעיים (C) להגיב לATP באופן תלוי-מינון עם mmol 1 / L לעורר תגובות מקסימליים 24. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> איור 3. Murine S-100-GFP תאים + במגיב מקלעת myenteric המעי הגס לATP באתר. () S-100-GFP + תאי גליה (ירוקה) בגנגליון myenteric מעי הגס עכבר (שתואר על ידי קו מקווקו). שישה אזורים של עניין (ROIs) המקיף את תאי גליה בתוך הגרעינים מוצגים כעיגולים צהובים. חצים מצביעים על קטעי סיבים עבים המובילים לגנגליון. ד כוכביותמיקום enote של 2 נוירונים enteric. אותו גנגליון מראה Rhod-2 הקרינה בתנאים בסיסיים (B). (ג) בעקבות גירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה להגיב בגדלו [Ca 2 +] i, כפי שמוצגת על ידי Rhod- המוגבר 2 הקרינה. (ד) עקבות המתאימות לכל אחד את ההחזר על ההשקעה שמוצגת ב- C. (E) בממוצע תגובה (ממוצע ± SEM) של ROIs 6 הראתה ב -24 D. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> איור 4. בהדמיה באתרו של תקשורת נוירון לגליה enteric. (א) נציג תמונות (pseudocolored) מניסוי הדמיה Ca 2 + שבו כל הרהכנת מקלעת myenteric אותגרה עם אגוניסט העצבי קולט P2X7 BzATP (100 מיקרומטר, 30 שניות). שים לב שאגוניסט העצבי גורם לעלייה בקרינת Fluo4 בנוירון (א &#39;) לפני התאים המקיפים את מעי גליה (&quot;). (ב) ניתוח השינוי בקרינה לאורך זמן בגליה (הכחול) ותאי עצב (אדום ) לאחר יישום של אגוניסט העצבי, BzATP. (C) העצבית ותגובות גליה לBzATP במאגר רגיל (קווים מוצקים) ובמאגר המכיל Ca 2 + הנמוך וMg 2 + (קווים מקווקווים) להגברת קולטנים עצביים P2X7 13. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> וידאו 1. תגובת Ca 2 + עורר אגוניסט בגליה enteric באתרם. סרט זה מראה גנגליון myenteric מהמעי גס דיסטלי העכבר עמוס צבע המחוון 2 + Ca, Fluo-4. אגוניסט תא גליה, ADP, מתווסף לאמבטיה כאשר הצביעו. ADP מעורר עלייה בCa 2 + תאיים בגליה enteric כפי שנצפה על ידי ההעלאה החולפת בFluo-4 הקרינה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System at JoVE.com

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K Views.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Video: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

In vivo הדמיה של גנגליון trigeminal חולדה עם אינדיקטורים סידן

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

מחבר זרקור: חקר מנגנונים היקפיים של כאב נוירופתי בפגיעה עצבית טריגמינלית 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

בהדמיה ^{2 +} Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli