Name: growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
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우리는지지하고 열정적 인 연구 환경을 제공하기 위해 루벤스 타인 실험실의 현재와 전 회원을 감사드립니다. 우리는 프로토콜 최적화에 도움 라이언 T. 깁슨 감사합니다. 우리는 효모 균주 및 플라스미드에 대한 마크 Hochstrasser (예일 대학)과 디터 늑대 (Universität의 슈투트가르트) 감사합니다. 우리는이 원고의 선명도와 유틸리티 개선에 도움을 준 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 SGW에 시그마 사이의 볼 주립 대학의 장에서 연구 수상에 의해 지원되었다, 볼 주립 대학에서 국민 건강 보조금 연구소 (R15 GM111713) EMR에, EMR에 볼 주립 대학 바램이 연구 상, 자금 사무장의 사무실과 생물학과.

단백질 분해에 결함이있는 후보 돌연변이를 확인하기 위해 1. 효모의 성장 분석 <ol><li> 리포터 대사 효소로, 프레임에서 불안정한 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질. </li><li> 플라스미드 분자를 보유하는 세포 합성을위한 선택적인 정의 (SD) 최소 배지 5ml에 형질 전환 체를 접종한다. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정한다. 참고 : 하룻밤 배양 한 다음은, 문화의 세포 중 하나 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만 최소한의 OD에게 0.2 (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다. </li><li> 세포에 희석을 시작으로 멸균 96 웰 플레이트에서 형질 전환 된 효모 세포의 6 배 희석액을 준비N OD 0.2 600. 96 웰 플레이트에 다른 행에 분석 할 각 효모 형질 전환 체를 놓습니다. <ol><li> 각 형질 전환 체의 경우, 200 μL의 최종 부피는 0.2 OD (600)에 셀을 희석 할 필요 밤새 배양의 체적을 계산한다. 200 μL에 볼륨을 가지고 멸균의 적절한 금액을 추가 열 1에 잘 대응에 하룻밤 문화의이 볼륨을 추가합니다. </li><li> 효모의 각 행에 대해, 열 2, 3 및 4에 웰 멸균 수 125 μL를 추가한다. 참고 : 개별 포장 멸균 96 웰 플레이트 멸균 뚜껑 포장 할 수있다. 뚜껑은이 단계에 분포 멸균 용 탱크로서 사용될 수있다. 이 멀티 채널 피펫으로 주어진 열의 모든 우물에 멸균을 동시에 전송할 수 있습니다. </li><li> 피펫 팅에 의해 멀티 채널 피펫과 아래 첫 번째 열 (OD 0.2 (600)로 희석 효모)의 내용을 섞는다. </li><li> TRANSF멀티 채널 피펫을 사용하여 열 2 열 1에서 효모의 25 μL, 어. 로 pipetting 아래로 섞는다. 전송 열 3 열이 25 μL, 그리고 3 열부터 4 열 25 μL (각 단계에서 잘 혼합). </li></ol></li><li> 멀티 채널 피펫으로 각 샘플을 섞는다. 가장 묽은에서 진행하는 것은 적어도 적절한 선택 배지를 포함하는 두 접시에 효모, 피펫 각 샘플의 4 μl를 열 희석한다. 플라스미드 선택 (이 판은 효모 안보 및 성장 제어 역할을) 유지 매체와 한 판을 사용합니다. 기자 효소에 융합 불안정한 단백질의 플라스미드 유지 보수 및 표현 선택 매체와 제 2 플레이트를 사용합니다. 효모가 빠르게 정착 때문에, 정기적으로 피펫 팅에 의해 아래로 세포를 혼합한다. 참고 : 건조기 판은 더 쉽게 새로 제조 한 판보다 액체 흡수하기 때문에 이러한 실험을 권장합니다. 댐프 플레이트 LO 실온에서 인큐베이션하여 건조 될 수있다층류 후드에 2 일 또는 짧은 배양 - 1 w 습도. 층류 공기 유동은 벤치에 평행 인 경우, 플레이트 불균일하게 건조 할 수있다. 템플릿을 사용하면 쉽게 일반 거리에서 효모 세포를 발견 할 수 있습니다. 두 샘플 템플릿은 그림 1에 나와 있습니다.이, 인쇄 잘라하고, 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착되어 있습니다. </li><li> 플레이트가 벤치 위에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 2-6일 30 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 배양 후 각 판의 사진. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> 100 mm 한천 플레이트에 효모 세포에 얼룩을지게 그림 1. 템플릿. 이러한 템플릿은 멀티 채널 피펫과 정기적으로 거리에서 효모를 파악하고 용이하게 사용할 수있다. 템플릿은, 인쇄 잘라 및 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착 될 수있다. 성장 페트리 접시를 배치템플릿 매체 내부 뚜껑에 부착. 템플릿은 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시됩니다. 그것은 성장 분석에 사용되는 판 마찬가지로 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시하는 것이 좋습니다. 네 (A) 또는 오 (B) 효모 세포의 연속 희석이 제공됩니다 안보를위한 템플릿. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">100-mm 템플릿이 그림의 인쇄 가능한 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 효모의 성장 분석 2. 생화학 확인 <ol><li> 효모 세포 및 사후 알칼리성 단백질 추출의 성장 (31 수정) <ol><li> 불안정한 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질. </li><li> 플라스미드 분자를 보유하는 세포 선택성 SD 배지 5ml에 접종 형질. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 각 하룻밤 CU의 OD 600을 측정lture. 참고 : 하룻밤 배양 한 다음, 셀 중 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만, 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지 (단계 2.1.4)의 OD 600 희석을 허용하는 OD (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다. </li><li> 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지의 OD 600 효모 세포를 희석. </li><li> 문화가 (중간 로그 성장에 IE) 0.8과 1.2 사이의 OD 600에 도달 할 때까지, 회전 또는 떨고, 30 ° C에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다. 참고 : 관심의 불안정한 단백질이 조절 가능한 프로모터의 통제하에있는 경우, 단백질 발현 및 세포 수확의 유도의 최적의 타이밍은 이전의 연구 또는 경험적 관찰에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 15 ml의 원뿔 곡선 (이차 곡선)에 문화의 2.5 OD 600 단위를 수집실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 알루미늄 관. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 주 : 600 부 1.0의 OD 600에서 배양액 1mL 효모 본의 양으로 정의된다 한 OD. V = 2.5 OD 600 단위 / 600 OD 측정 : 2.5 OD 600 단위 (V)을 수확하는 데 필요한 (ML)에서의 배양 부피는 다음 식을 사용하여 결정될 수있다 </li><li> 한 용액에 재현 탁 된 세포를 증류수. 마이크로 원심 튜브에 정지 세포를 전송합니다. </li><li> 실온에서 30 초 동안 6500 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 100 μL에 재현 탁 세포가 다운되거나 와동 피펫 팅에 의해 증류수, 100 ㎕의 0.2 M NaOH를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. 실온에서 5 분간 샘플을 부화. </li><li> 18,000 X에서 원심 분리하여 (아직 단백질을 발표 여전히 가능한 아르하지 않은 대부분의) 펠렛 세포5 분 g. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 로 pipetting 아래로 또는 와동에 의해, 세포를 용해됩니다 100 μL 1X 램 믈리 샘플 버퍼, - 50에 재현 탁 펠렛. 주 : 원심 램 믈리 시료 완충액 세포의 후속 재 부유 다음 알칼리 상등액 제거는 글리신 러닝 버퍼 시스템과 웨스턴 블롯을 사용하여 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)와 호환 pH에서 단백질을 추출한다. </li><li> 완전 단백질 변성, 5 분 동안 95 ° C에서 배양 한 해물. 참고 : 95 ° C에서 배양 할 때 집계가 발생하기 쉬운 단백질 (여러 횡단 세그먼트 예를 들면 단백질) 불용성 될 수 있습니다. 따라서 해물 낮은 온도에서 배양한다 (예를 들면 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 분, 같은 단백질의 경험적 분석, 결정 하였다. </li><li> 5 분 동안 얼음 상에 배치하여 냉각 용 해물. </li><li> 실온에서 1 분 18,000 XG에 원심 분리기 해물을 불용성 물질을 펠렛. 이전 이후의 웨스턴 블롯 분석 (2.2 절)을​​ SDS-PAGE에 의해 상층 액 (용해 추출 된 단백질)를 분리합니다. 또한, -20 ° C에서 저장 용 해물. </li></ol></li><li> 대표 웨스턴 블로 팅 프로토콜 <ol><li> SDS-PAGE 젤에 해물의 경험적으로 결정 볼륨을로드합니다. </li><li> 염료 앞까지 200 V에서 젤을 실행 겔의 바닥에 도달했습니다. </li><li> 4 ℃에서 90 분 - 60 20 V 젖은 송금 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 겔에서 단백질을 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 하룻밤 동안 실온에서 1 시간 동안, 흔들거나, TBS 버퍼 (TBS)에서 5 % 탈지 우유에서 배양함으로써 차단 막. </li><li> 차단 솔루션 가만히 따르다. </li><li> 방 테에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (TBS / T)와 TBS에서 1 % 탈지 우유 (또는 에피토프 태그) 가장 큰 관심의 단백질에 특이적인 항체와 멤브레인을 품어mperature, 락. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션. 참고 : 형광 물질이 빛에 민감한 때문에, 형광 접합 된 항체의 희석이 어둠 속에서 준비를해야합니다. 또한, 형광 - 복합 항체의 존재 막 부화는 차광 용기에 발생한다. 이 알루미늄 포일 인큐베이션 트레이를 배치함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득. </li><li> 멤브레인을 묘화 한 후, 부하에 특이 차 항체와 함께 막을 인큐베이션락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지 우유 단백질을 제어 보내고. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 제시된 방법론은 빠른 결정과 효모 세포에서 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 생화학 적 확인을 할 수 있습니다. 이 실험은 () (예 : 41 ~ 44을, 처리, 저장 및 효모 세포 조작을위한 프로토콜의 효모 생물학의 여러 우수 리뷰 및 컴파일 유기체에 새로운 연구자에 사용할 수있는) 유틸리티 및 전원 효모의 모델 진핵 생물 유기체 등을 강조 표시합니다. 기술은 용이하게 ?...

선택적 단백질 분해 진핵 생명에 필수적이며, 변화된 단백질 분해는 여러 종류의 암, 퇴행성 신경 질환, 심혈관 질환, 낭포 성 섬유증을 포함하는 의료 1-5 조건의 수에 기여한다. 선택적인 단백질 분해를 촉매하는 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)는, 이러한 조건에 대한 6-10 새로운 치료 표적이다. 유비퀴틴 리가 제는 공유 결합 단백질 11 (76) - 아미노산 유비퀴틴의 폴리머를 연결합니다. polyubiquitin 체인으로 표시 한 단백질은 인정 ~ 2.5 megadalton 26S에 의해 12 프로 테아 proteolyzed 있습니다. 모델 진핵 생물 사카로 미세스 세 레비 시아 (신진 효모)에 시작된 연구는 진핵 세포에서 단백질 분해 메커니즘의 해명에 기초가되고있다. UPS의 첫 번째 시연 생리 기판은 MATα2 13 효모 전사 억제 자했다, UPS의 (14), 및 고도로 보존 된 많은 구성 요소가 처음 확인 된 또는 (예 15-26) 효모 특징으로하는 방법. 이 다목적 유전자 다루기 쉬운 모델 생물에서 만든 발견은 유비퀴틴 중재 저하의 보존 메커니즘에 중요한 통찰력을 지속적으로 제공 할 가능성이 높다. 대부분의 UPS 기판의 인식과 저하는 여러 단백질의 공동 작업이 필요합니다. 따라서, 주어진 불안정한 단백질의 조절 된 분해를 특징 짓는 중요한 목적은 단백질 분해에 대한 유전 적 요건을 결정하는 것이다. 효모 또는 포유 동물 세포에서 단백질 분해를 모니터링하기위한 고전 접근법 (예를 들어 펄스 - 체이스 및 사이클로 헥시 - 체이스 실험 27) 힘들고 시간 소모적이다. 이러한 유형의 방법은 단백질 분해를 검출하는 고감도 방법을 제공하지만, 이들은 단백질 분해 또는 대규모 screeni의 신속한 분석에 적합하지 않다단백질 분해를 방지 ng를 돌연변이. 여기에, 불안정한 단백질의 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 신속한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석은 제공됩니다. 단백질 분해,이자 (또는 저하 신호)의 불안정한 단백질을 분석하는 효모의 성장 기반 방법에서는 특정 상황에서 효모의 성장에 필요한 단백질, 프레임, 융합된다. 결과는 관심 불안정한 단백질의 단백질 분해의 유전 적 요구 사항을 결정하는 강력한 도구로서 작용할 수 인공 기판이다. 편리하게는, 가장 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주 특정 아미노산 또는 질소 함유 염기 (예 20,28-30)의 생합성에 관여하는 대사 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 패널 항구. 이 효소는 합성 효소에 참여 외생 제공 대사의 부재하에 세포 증식에​​ 필수적이다. 이러한불안정한 단백질의 분해를위한 성장 기반 기자가 이들이 융합로서 대사 효소에 따라서 기능을 할 수있다. 단백질 분해를 방지 돌연변이가 저하 기자를 숨겨 세포가 선택적 조건에서 성장할 수 있도록하기 때문에 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항을 용이하게 설명 될 수있다. 성장 장점은 특정 돌연변이 관심 단백질 풍부 증가 간접 지표이다. 그러나 직접 생화학 적 분석은 돌연변이가 아니라 간접적 또는 인공적인 원인을 통해보다 증가 된 단백질 수준을 통해 성장을 허용하는지 확인해야합니다. 풍부한 단백질에 돌연변이의 효과는 않으며 특정 돌연변이를 정박하지 않는 세포에서의 정상 상태의 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 적합한 형태 효모 단백질의 신속하고 효율적인 추출 (수산화 나트륨 및 샘플 완충액으로 효모 세포의 연속 배양) 미국 방법웨스턴 블롯 분석을 위해도 (31)를 제시한다. 함께, 이러한 실험은 단백질 분해의 후보 레귤레이터의 신속한 식별을 용이하게한다.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#039;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#039;s laboratory.</td></tr><tr><td>3-amino-1&lt;em&gt;H&lt;/em&gt;-1,2,4-triazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.</td></tr><tr><td>Endoglycosidase H (recombinant form from &lt;em&gt;Streptomyces plicatus&lt;/em&gt;)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.</td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Available from a variety of manufacturers&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.</td></tr><tr><td>Plate imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

규제 단백질 분해는 거의 모든 세포의 기능에 매우 중요합니다. 분자 메커니즘 및 진핵 세포 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항에 대해 알려진 대부분은 처음 사카로 미세스 세 레비 시아 년에 설립되었습니다. 단백질 분해의 고전 분석은 생화학 펄스 추적 및 사이클로 헥 - 추적 방법에 의존했다. 이들 기술은 단백질 분해에 대한 민감성을 관찰하는 수단을 제공하지만, 이들은 힘들고, 시간 소모, 및 낮은 처리량이다. 이러한 접근 방법은 단백질 분해를 방지 또는 돌연변이 신속한 대규모 스크리닝 의무가 없다. 여기에서, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건 용이 한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석법을 설명한다. 이 분석에서, 특정 조건 하에서 선택적 성장에 필요한 리포터 효소 불안정한 단백질에 융합된다. 내생 세포를 리포터 효소가 결여되지만 융합 단백질이 실리 하에서 성장할 수있는 발현융합 단백질 안정화 만 뽑은 상태 (즉, 단백질 분해가 노출되어있는 경우). 여기에 설명 된 성장 분석에서, 야생형 및 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 돌연변이 효모 세포의 연속 희석이 선택적 및 비 선택적 매체에 발견된다. 선택적 성장 조건 하에서 주어진 돌연변이 열화 손상과 일치한다. 증가 된 단백질 풍부 생화학 적으로 확인해야합니다. 전기 영동 및 웨스턴 블 랏팅을위한 적합한 형태로 효모 단백질의 신속한 추출 방법도 설명된다. 생화학 적 분석을위한 단백질 추출을위한 간단한 프로토콜과 결합 단백질 안정성 성장 기반 판독, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건의 신속한 식별을 용이하게한다. 이러한 기술들은 단명 다양한 단백질의 열화를 모니터링하도록 구성 될 수있다. 제시된 예에서, 히스티딘 생합성에 필요한 효소는 HIS3, 융합시켰다이 비정상적으로 소포체의 translocon을 종사 한 후 Deg1에 -Sec62. Deg1 -Sec62은 분해의 대상이된다. Deg1 -Sec62-HIS3 은닉 세포 단백질을 안정화시킨 때 선택적 조건 하에서 성장할 수 있었다.

이 방법을 설명하기 위해, HIS3 효소가 모델 소포체 (ER) -associated 저하의 카르복시 말단에 융합 된 (ERAD) 기판, Deg1 -Sec62 (그림 2A) Deg1 -Sec62-HIS3를 만들 수 있습니다 (그림 3) . Deg1 -Sec62는 translocon와 지속, 비정상적인 관계를 다음 타겟으로 ERAD 기판의 새로운 클래스의 창립 멤버이고, ER 막 32-34에서 단백질을 이동 주로 담당하는 채널입니다. 이러한 ?...

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Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.7K 조회수.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

비디오: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

연구

생물학

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

생화학

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

특이적이고 효율적인 단백질 고갈을 달성하기 위한 튜닝 분해

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

면역학 및 감염병학

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

단백질 분해에서의 사이클로 헥시 미드 체이스 분석<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에

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S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

특이적이고 효율적인 단백질 고갈을 달성하기 위한 튜닝 분해

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

진화 방법에 감독

단백질 분해에서의 사이클로 헥시 미드 체이스 분석

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열