This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. 돌연변이 라이브러리 생성 <ol><li> 선택 영역은 가능한 결정 구조 또는 상 동성 모델 (18)에 기초하여 계산 알고리즘의 도움으로 모핑을하여야한다. <ol><li> 여기에, 임의의 돌연변이와 재조합 (메트로 [α1] -Val109, Phe392 - Gln566), 고성능 PCR에 의한 유전자 (844 bp의)의 나머지를 증폭하는 동안 (그림 1)에 대한 새송이에서 AAO의 두 지역을 대상으로. 참고 : 여러 세그먼트가 독립 또는 결합 방식으로 16 모핑으로 공부하실 수 있습니다. </li></ol></li><li> 돌연변이 유발 PCR에 의해 대상 영역을 증폭. 정의 된 영역의 PCR 반응을 중첩하여 세그먼트 사이의 영역 (~ 50 bp의 각)를 중복 작성합니다. <ol><li> DNA 템플릿을 포함하는 50 μL (0.92 NG / μL), 90 나노 올리고 감각 (세그먼트 MI 세그먼트 M-II에 대한 AAO-BP에 대한 RMLN)의 최종 볼륨에서 대상 세그먼트의 돌연변이 PCR을 준비, 90 nM의 a를ntisense 프라이머 (세그먼트 M-II에 대한 세그먼트 MI 및 RMLC에 대한 AAO-92C), 0.3 밀리미터의 dNTPs (0.075 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 0.05 mM의 MnCl 2, 0.05 이 U / μL의 Taq DNA 폴리머 라제. 프라이머 서열은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 사용하여 2 분 (1주기) 95 ° C를; 45 초, 45 초 동안 50 ° C, 45 초 동안 74 ° C (28 회) 95 ° C; 10 분 (1주기) 74 ° C. </li></ol></li><li> 초고 충실도 중합 효소와 비 돌연변이 영역을 증폭 및 돌연변이 세그먼트 및 / 또는 선형화 벡터 오버행 중복 해당 지역을 포함한다. <ol><li> 포함 된 50 μL의 최종 부피에 반응 혼합물을 준비 : DNA 템플릿 (0.2 NG / μL), 250 nM의 올리고 의미 HFF, 250 nm의 올리고 안티센스 HFR, 0.8 밀리미터의 dNTPs (0.2 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 (DMSO)와 DNA 중합 효소 iproof 0.02 U / μL. 프라이머 서열에 자세히 설명되어 &lt;강한&gt; 그림 1. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 사용하여 30 초 (1주기) 98 ° C를; 10 초, 25 초 동안 55 ° C, 45 초 동안 72 ° C (28 회) 98 ° C; 10 분 (1주기) 72 ° C. 참고 : 1.2에 설명 된 조건 (43) BP (플라스미드-M1 영역)의 1.3 중복으로; 46 BP (M1 지역-HF 영역); 47 BP (HF 영역-M2 영역) 61 BP (M2 인 지역 플라스미드) 효모에서 생체 접합에서 선호하는 (그림 1) 설계되었습니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 겔 추출 키트 (돌연변이 및 비 돌연변이) 모든 PCR 단편을 정제 하였다. </li></ol></li><li> 약 50 염기쌍의 영역을 플 랭킹하는 것은 표적 유전자의 5&#39;- 및 3&#39;- 말단에 상동이 생성되도록 상기 벡터 선형화. <ol><li> 2 μg의 DNA, 7.5 U의 BamHI, 7.5 U을 XhoI, 버퍼 바 20 μg의 BSA 2 μl를 함유하는 선형 반응 혼합물을 제조20 μL의 최종 부피 m HI 배. </li><li> 2 시간 40 분 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 그 후, 20 분 동안 80 ℃에서 불 활성화를 진행합니다. </li></ol></li><li> 잔류 원형 플라스미드 (도 2)의 오염을 방지하기 위해, 아가 로스 겔 추출에 의해 선형화 된 벡터를 정제. <ol><li> 잘 기자로 인접에 반응 믹스의뿐만 아니라 나누어지는 (5 μL) : (V 승, 0.75 %) 세미 예비 저 융점 아가로 오스 겔의 메가 우물에 소화 반응 혼합물을로드합니다. </li><li> 실행 DNA 전기 영동 (전극 사이에 5 V / cm, 4 ᵒC)과 메가 웰에 해당하는 아가 로스 겔을 분리하고 1X TAE 4 ᵒC에 저장합니다. </li><li> 분자량 사다리 기자와 차선 얼룩. UV 빛 아래 밴드를 시각화합니다. 닉 위치 선형화 된 벡터 곳. 주 : 정제 선형화 된 벡터의 품질이 criti이므로칼 요인은 효모에서 성공 재조합 및 조립, 반 예비 DNA 전기 영동 젤 염색을 피하십시오. 염료 및 겔 추출 UV 노광의 사용은 생체 내 재조합 효율 저하의 DNA 벡터의 안정성에 영향을 미칠 수있다. 독성 EtBr이 염료에 대한 대안으로, 젤 빨간색과 SYBR 염료는 일반적으로 겔 염색에 사용된다. </li><li> UV 광이없는 경우,이 분리 될 수 있도록 염색 리포터 레인 닉의지도를 사용하여 메가 아니라 단편의 선형 벡터를 식별한다. </li><li> 아가로 오스에서 선형화 된 벡터를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따른 상업 겔 추출 키트를 정화. 참고 : 항생제와 영양 요 마커를 사용하여 높은 복사 에피 솜 셔틀 벡터 : 우리는 효모 GAL1 프로모터의 제어하에, 우라실 독립적 인 암피실린 내성 pJRoC30 벡터를 사용이 예에서. </li></ol></li><li> 같은 몰 마일을 준비PCR을 조각의 xture과 2에서 선형화 된 벡터와 함께 혼합 : 선형화 된 플라스미드없이 100 개 미만 NG로, 1 비율 (몰 라이브러리 / 오픈 벡터의 테스트 다른 비율은 좋은 형질 전환 수율을 달성하기 위해). <ol><li> 그 농도 및 순도를 결정하기 위하여 PCR 단편을 260 nm 내지 280 nm에서 선형화 된 벡터의 흡광도를 측정한다. </li></ol></li><li> 상업적 효모 형질 전환 키트를 사용하여 DNA 혼합물로 효모 세포를 형질 전환 능력 제조업체의 지시에 따라 (공급 표 참조). <ol><li> 종속 S. - 여기서, 결핍 된 단백질 분해 효소와 URA3을 사용 cerevisiae의 변형, BJ5465. (아래 참조) 심사 중 내부 표준으로 부모의 고리 화 벡터와 세포를 변형. 또한, PCR 단편의 부재에서 선형화 된 벡터를 변환함으로써 배경을 확인한다. 주 : 저 초기 분비 수준을 검출하는 경우, S.을 사용BJ5465 같은 cerevisiae의 단백질 분해 효소 결핍 균주 배양 상층 액에서 활성 단백질의 축적을 촉진합니다. 표적 효소를 과당 질화, 글리코 실화가 결핍 된 균주의 사용을 겪는 경우 (예, 오직 작은 만노스 올리고머 부착 할 Δ의 kre2)는 적절한 선택 될 수있다. </li></ol></li><li> 접시 변환 SC 탈락 플레이트상에서 세포 및 3 일 동안 30 ° C에서 그들을 부화. 플레이트 (우라실 보충 SC 드롭 아웃 접시에) URA3 - S. 선별 음성 대조군으로 플라스미드가없는 cerevisiae의 세포 (아래 참조). </li></ol> 분석을 심사 2. 높은 처리량 (그림 3) <ol><li> 피펫 로봇의 도움으로 잘 당 50 μl의 최소한의 매체 (2,000 클론의 라이브러리를 분석하기 위해 23 판) 멸균 96 웰 플레이트의 적절한 수를 입력합니다. </li><li> 판 밖으로 SC-드롭에서 개별 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트로 전송. <ol><li> 각 플레이트에서, 부모의 내부 표준 타입과 잘 URA3와 H1에서와 열 번호 6 접종 - S.을 음성 대조군으로 더 플라스미드 (우라실 보충 SC 매체에서) cerevisiae의 세포. 참고 : 음 H1은 우라실 보충 드롭 아웃 미디어 구체적으로 가득합니다. 세포가없는 웰 빈 함유 배지는 추가로 멸균 대조군으로서 제조 될 수있다. </li></ol></li><li> 자신의 뚜껑 접시를 덮고 파라 필름에서 그들을 포장. 습기 통에서 30 ° C에서 48 시간, 225 rpm으로 80 %의 상대 습도에 대한 번호판을 품어. </li><li> 는 파라 필름을 제거 피펫 로봇의 도움으로 각 웰에 표현 매체의 160 μl를 추가, 번호판을 봉인하고 추가로 24 시간 동안 그들을 품어. 참고 : 19 다른보고 된 최소 배지 표현 매체가 제조된다. 분비 수준 t, 따라서 연구중인 유전자에 따라 달라질 수있다그 시간은 모든 웰에서 세포 성장을 동기화 각 경우에 최적화되어야 인큐베이션. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 2,800 X g에서 판 (마스터 판). </li><li> 이송 로봇 멀티 스테이션 처리 액을 사용하여 레플리카 플레이트 마스터 플레이트 웰로부터 상층 액 20 μL. 참고 : 효소 분비를 선호하는 것이 일반적으로 효모에서 이종 발현 (에 사용되는 신호 펩타이드에 의해 표적 단백질의 기본 신호 펩타이드를 교체하는 것이 좋습니다 예를 들면, α 계수 prepro 리더, S.에서 K 1 킬러 독소의 지도자 세레 비지 또는 둘 펩티드 13)이라도 키메라 버전. 대안 적으로, 천연 신호 펩티드 독점적 효모 분비를 위해 전개 될 수있다. </li><li> 피펫 로봇의 도움으로 100 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 6.0에서 2 mM의 P는 -methoxybenzylalcohol의 20 μl를 추가합니다. 96 우리 짧게 접시를 저어접시 믹서 LL RT에서 30 분 동안이를 부화. </li><li> 피펫 로봇으로, 각 복제 판에 FOX 시약 160 μl를 추가하고 잘 FOX 혼합물의 믹서 (최종 농도 짧게 저어 : 100 μM 크 실레 놀 오렌지, 250 μM 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2 25 mM의 H 2 SO 4). <ol><li> 유기 공동 용매 (DMSO, 에탄올, 메탄올) 또는 소르비톨 (17)의 감도를 향상시키기 위해 시약에 여러 가지 첨가제를 추가합니다. 여기서, 100 밀리미터 (도 4)의 최종 농도 소르비톨을 첨가하여 반응을 증폭한다. </li></ol></li><li> 접시 리더에서 560 nm에서 플레이트 (엔드 포인트 모드, t 0)를 참조하십시오. </li><li> 색상이 개발 될 때까지 RT에서 접시를 품어 다시 (t 1) 흡수를 측정한다. <ol><li> 배양 후 애비 값의 차이에서 상대 활성을 계산하고 초기 측정의는 PARE에 정상화각 플레이트에 대한 ntal 유형 (의 Δt 1 - t 0). </li></ol></li><li> 오탐 (false positive)을 배제하기 위해 두 개의 연속 재 상영에 최적의 돌연변이 안타 대상으로 할 수 없다. 주 : 일반적으로 재 스크리닝 플라스미드 19 신선한 효모 세포를 형질 전환 한 다음, 대장균의 효모, 증폭 및 정제로부터 분리 된 플라스미드를 포함한다. 선택한 각 클론 pentaplicate에서 다시 상영된다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

이 글에서, 우리는 팁과 트릭의 대부분은 S.의 감독 진화에 의해 효소를 엔지니어링하는 우리의 실험실에서 사용 요약 한 세레 비지에 (예를 들어 AAO 사용)들은 단순히 여기에 기술 된 일반적인 방법에 따라 많은 다른 진핵 효소 시스템과 함께 사용하도록 적응 될 수 있도록. 라이브러리 생성의 측면에서, 모핑 소개 (16) 변경되지 않은 단백질의 나머지 영...

감독 분자 진화는 효소 1, 2를 설계 할 수있는 강력하고 빠르고 안정적인 방법입니다. 비 자연에서 새로운 반응에, 새로운 기판에 작용 무작위 돌연변이, 재조합 및 검사, 효소의 개선 된 버전을 생성 할 수의 반복 라운드를 통해 환경, 또는 새로운 대사 3-5 목표를 달성하기 위해 셀을 지원한다. 직접 진화에 사용 된 호스트 사이에서, 맥주의 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 원핵 생물의 대응 6,7에서, 그렇지 않으면 사용할 수없는 복잡한 진핵 세포 단백질의 기능 발현을위한 솔루션의 레퍼토리를 제공합니다. 세포 생물학 연구에 철저 사용,이 작은 진핵 모델은 직접 진화 (8)에 의해 효소를 엔지니어링하는 중요한 특성입니다 모두 번역 후 변형, 조작 및 변환 효율의 용이성 측면에서 많은 장점을 가지고있다. 또한, 고주파S.에서 상동 DNA 재조합의 효율적인 증명 판독 장치에 연결 cerevisiae의 복잡한 인공 경로 9-12에 하나의 효소는 다른 시스템의 진화를 촉진, 생체 내에서 라이브러리 생성 및 유전자 조립을위한 가능성의 다양한 열립니다. 우리 연구소는 효모에서 다른 ligninases의 분자 진화 (천연 나무 붕괴시 리그닌의 분해에 관여하는 산화 환원 효소) 13 ~ 14를위한 도구와 전략을 설계 지난 십을 보냈다. 이 통신에서 우리는 준비 S.에서 화면 돌연변이 라이브러리에 대한 자세한 프로토콜을 제시 모델 flavooxidase, 아릴 알코올 산화 효소 세레 비지에 (AAO 15) -, 즉 쉽게 많은 다른 효소로 번역 할 수있다. 효모 전지 장치 (16), 도움을 (상동 생체 그룹화에 의한 돌연변이 유발 조직 된 재조합 과정 모핑) 프로토콜은 초점 지시 진화 방법을 포함한다배양액 (17) 내로 분비 AAO 활성을 검출하기 위해 펜톤 반응을 이용한 다 민감 스크리닝 분석법.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&amp;ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&amp;ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&amp;ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&amp;ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&amp;ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. PCR Reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM each</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&amp;ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>For error prone PCR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Plasmid linearization&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>For staining DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. FOX assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&amp;ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&amp;ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standard curve</td></tr><tr><td>Xylenol Orange disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&amp;ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. Agarose gel stuff&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&amp;ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA analysis dye</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting temperature agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&amp;ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. Kits and cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease deficient strain with genotype: MAT&amp;alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competent cells</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>For plasmid purification and amplification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA gel extraction</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr><td>Yeast Transformation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmid extraction from yeast</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;7. Plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr><tr><td>96-well plate lid</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr></tbody></table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

생체 내 고주파 DNA 상동 재조합에 결합 구성, 복제 및 돌연변이 라이브러리의 발현을 수반하는 처리를위한 응용 바이오 효소를 설계 할 때 사카 cerevisiae를 향하고 진화 매력적인 많은 장점을 제공한다. 여기서는 총 활성을 향상시키는 진균 아릴 알코올 산화 효소 (AAO)의 예에 기초하여 효모 및 화면 변이체 라이브러리를 제작하는 프로토콜을 제시한다. 두 단백질 세그먼트는 무작위 돌연변이에 의해 생체 내 DNA 재조합에 초점을 맞춘 지시 진화 하였다. 각 세그먼트의 측면에 50 ~ BP의 오버행 전체 자율적으로 복제하는 플라스미드에 초래하는 선형화 된 벡터에 AAO 융합 유전자의 정확한 재결합을 허용했다. 기능 AAO 변형 풍부 돌연변이 라이브러리는 S.에서 상영되었다 펜톤 반응을 이용한 고감도 높은 처리량으로 분석 cerevisiae의 상층 액. 의 일반적인 과정S.에서 라이브러리 건설 cerevisiae에 여분의 PCR 반응, 시험 관내 재조합 DNA 및 결찰 단계를 피하고, 여기에 설명 쉽게 많은 다른 진핵 유전자 발전에 적용될 수있다.

P.에서 AAO 속 eryngii는 리그닌을 공격 시작 H 2 O 2와 곰팡이 퍼 옥시다아제를 공급하는 세포 외 flavooxidase입니다. AAO의 두 세그먼트는 활성 및 S.에서의 발현을 향상시키기 위해서 모핑에 의해 집광 지향 진화 하였다 cerevisiae의 19. S.에 의해 숨겨 외국 효소에 관계없이 cerevisiae의 효모에서 돌연변이 라이브러리?...

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Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K 조회수.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

비디오: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

연구

유전학

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

생물학

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>효모 표면 디스플레이 기법을 통한 단백질 기능 최적화

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

생체공학

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

진화 방법에 감독

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효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

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화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별