Ringraziamo i membri attuali e precedenti del laboratorio Rubenstein per fornire un ambiente di ricerca e entusiasta. Ringraziamo Ryan T. Gibson per l&#39;assistenza nella ottimizzazione dei protocolli. Ringraziamo Mark Hochstrasser (Yale University) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) per i ceppi di lievito e plasmidi. Ringraziamo i nostri revisori anonimi per il loro aiuto nel migliorare la chiarezza e l&#39;utilità di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di ricerca del capitolo Ball State University di Sigma Xi a SGW, un National Institutes of Health sovvenzione (R15 GM111713) per EMR, un premio di ricerca Ball State University aspirano ad EMR, e fondi dalla Ball State University Ufficio di Provost e Dipartimento di Biologia.

1. Lievito crescita Assay identificare Mutanti candidati difettosi in Protein Degradation <ol><li> Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante una proteina fusa instabili, in cornice, per un enzima giornalista metabolica. </li><li> Seminare trasformanti in 5 ml di sintetico definito (SD) terreno minimo che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante. </li><li> Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600) di ciascuna coltura durante la notte. NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule in coltura può essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un diametro minimo di 600 di 0,2. Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente. </li><li> Preparare sei diluizioni seriali di cellule di lievito trasformate in una piastra a 96 pozzetti sterili, a cominciare con le cellule diluite in unn OD 600 di 0,2. Posizionare ogni trasformante lievito per essere analizzati in una riga differente nella piastra a 96 pozzetti. <ol><li> Per ciascun trasformante, calcolare il volume di coltura overnight necessaria per diluire le cellule ad una OD 600 di 0,2 in un volume finale di 200 microlitri. Aggiungere questo volume di coltura durante la notte per pozzetto corrispondente nella colonna 1. Aggiungere la quantità appropriata di acqua sterile per portare il volume a 200 ml. </li><li> Per ciascuna fila di lievito, aggiungere 125 ml di acqua sterile ai pozzetti nelle colonne 2, 3, e 4. NOTA: piastre a 96 pozzetti sterili confezionati singolarmente possono essere forniti con coperchi sterili. I coperchi possono essere utilizzati come serbatoi per l&#39;acqua sterile che viene distribuito in questa fase. Questo consente il trasferimento simultaneo di acqua sterile a tutti i pozzetti in una data colonna con una pipetta multicanale. </li><li> Mescolare il contenuto della prima colonna (lievito diluito ad una OD 600 di 0,2) pipettando su e giù con una pipetta multicanale. </li><li> Trasfer 25 ml di lievito dalla colonna 1 alla colonna 2, utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù. Trasferire 25 ml da Colonna 2 a colonna 3, e 25 ml di Colonna 3 Colonna 4 (mescolando bene ad ogni passo). </li></ol></li><li> Mescolare ogni campione con una pipetta multicanale. Procedendo da più diluito per almeno diluire colonne di lievito, pipetta 4 microlitri di ciascun campione su due piastre contenenti il ​​terreno selettivo appropriato. Utilizzare una piastra con mezzo che mantiene selezione plasmide (questo piatto serve come un avvistamento lievito e controllo della crescita). Utilizzare una seconda piastra con mezzo che seleziona per plasmide manutenzione e l&#39;espressione della proteina fusa instabile all&#39;enzima giornalista. Perché lievito risolvere rapidamente, mescolare le cellule pipettando su e giù a intervalli regolari. NOTA: Drier piatti saranno più facilmente assorbire il liquido di piatti preparati al momento e quindi sono consigliati per questi esperimenti. Piatti umidi possono essere essiccati per incubazione a temperatura ambiente in loumidità w per 1 - 2 giorni o incubazione più brevi in ​​una cappa a flusso laminare. Le piastre possono asciugare in modo non uniforme se il flusso d&#39;aria laminare è parallelo al banco. L&#39;uso di un modello rende più facile individuare cellule di lievito a distanze regolari. Due modelli di esempio sono forniti in Figura 1. Questi possono essere stampati, tagliati, e incollate all&#39;interno di un coperchio piatto Petri. </li><li> Lasciare le piastre ad asciugare sul banco. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° C per 2 - 6 giorni. </li><li> Fotografa ogni piatto dopo l&#39;incubazione. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Figura 1. Modelli per individuare le cellule di lievito su 100 mm piastre di agar. Questi modelli possono essere utilizzati per facilitare individuare lievito a distanze regolari con una pipetta multicanale. I modelli possono essere stampati, tagliati, e incollate all&#39;interno di un coperchio piatto Petri. Posizionare piastra Petri con la crescitaCoperchio all&#39;interno media con template apposto. I modelli sono contrassegnati da una tacca per monitorare l&#39;orientamento. Si raccomanda che le piastre utilizzate in saggi di crescita sono parimenti segnalate con una tacca per monitorare l&#39;orientamento. Modelli per individuare quattro (A) o cinque (B) sono previsti diluizioni seriali di cellule di lievito. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione stampabile di questa figura con i modelli da 100 mm.</a> 2. Conferma biochimica di Assay Crescita Lievito <ol><li> La crescita di cellule di lievito e di post-alcalino di estrazione di proteine ​​(modificato da 31) <ol><li> Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante la proteina instabile. </li><li> Seminare trasformanti in 5 ml di terreno SD che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante. </li><li> Misurare la OD 600 di ogni cu nottelture. NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule possono essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un OD 600 che permetterà di diluizione per una OD 600 di 0,2 in 10 ml di terreno selettivo fresco (punto 2.1.4). Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente. </li><li> Diluire le cellule di lievito ad una OD 600 di 0,2 in 10 ml di mezzo fresco selettiva. </li><li> Continuare a incubare cellule a 30 ° C, la rotazione o agitazione, fino a quando le culture raggiungere un diametro esterno di 600 tra 0,8 e 1,2 (cioè sono in crescita mid-logaritmica). NOTA: Se la proteina instabile di interesse sotto il controllo di un promotore regulatable, tempi ottimali per l&#39;induzione dell&#39;espressione della proteina e la raccolta delle cellule può variare secondo studi precedenti o osservazioni empiriche. </li><li> Raccogliere 2,5 OD 600 unità di cultura in 15 ml conicaal tubo mediante centrifugazione a 5000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. NOTA: Un OD 600 unità è definita come la quantità di lievito presente in 1 ml di coltura a OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere 2,5 OD 600 unità (V) può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: V = 2,5 OD 600 unità / OD 600 misurato </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di acqua distillata. Trasferire le cellule in sospensione in una provetta. </li><li> Agglomerare cellule per centrifugazione a 6.500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di acqua distillata pipettando su e giù o vortex, e aggiungere 100 ml 0.2 M NaOH. Mescolare pipettando su e giù. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Cellule pellet (la maggior parte dei quali non hanno ancora rilasciato proteine ​​e sono ancora vitali) per centrifugazione a 18.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. </li><li> Risospendere pellet in 50 - 100 microlitri tampone 1x Laemmli, che la lisi delle cellule, pipettando su e giù o vortex. NOTA: La rimozione del surnatante dopo la centrifugazione alcalina e successiva risospensione delle cellule in tampone campione Laemmli estrae proteine ​​a pH compatibile con sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone Tris-glicina esecuzione e western blotting. </li><li> Per denaturare completamente proteine, lisati incubare a 95 ° C per 5 min. NOTA: proteine ​​di aggregazione-inclini (ad esempio proteine ​​con diversi segmenti transmembrana) possono diventare insolubili quando incubato a 95 ° C. Pertanto, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 min, come determinato empiricamente, per l&#39;analisi di tali proteine. </li><li> Lisati fresco mettendo in ghiaccio per 5 min. </li><li> Lisati centrifugare a 18.000 g per 1 minuto a temperatura ambiente a pellet materiale insolubile. Separare il surnatante (proteina estratta solubilizzato) per SDS-PAGE prima successiva analisi Western Blot (punto 2.2). In alternativa, negozio lisati a -20 ° C. </li></ol></li><li> Rappresentante Protocollo Blotting occidentale <ol><li> Caricare empiricamente determinato volume di lisati in un gel SDS-PAGE. </li><li> Eseguire gel a 200 V fino colorante anteriore ha raggiunto il fondo del gel. </li><li> Trasferire proteine ​​dai gel di fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C. </li><li> Block membrana incubando nel latte scremato 5% in Tris-Buffered Saline (TBS), dondolo, per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Decantare soluzione bloccante. </li><li> Incubare membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse (o epitopo della stessa) in 1% di latte scremato in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) per 1 ora a camera temperature, dondolo. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo. NOTA: Perché fluorofori sono sensibili alla luce, diluizioni di anticorpi fluoroforo coniugati devono essere preparati al buio. Inoltre, l&#39;incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati fluoroforo deve avvenire in contenitori lightproof. Questo può essere realizzato avvolgendo vassoi di incubazione in un foglio di alluminio. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore. </li><li> Dopo l&#39;imaging membrana, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per un caricoing proteina di controllo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La metodologia qui presentata consente la rapida determinazione e la conferma biochimica dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule di lievito. Questi esperimenti sottolineano l&#39;utilità e la potenza di lievito come organismo modello eucariote (diverse ottime recensioni di lievito biologia e compilazioni di protocolli per la gestione, la conservazione e la manipolazione cellule di lievito (ad esempio 41-44) sono disponibili per gli investigatori nuovi per l&#39;...

Degradazione delle proteine ​​selettiva è essenziale per la vita eucariotica, e alterata degradazione delle proteine ​​contribuisce ad una serie di condizioni mediche, tra cui diversi tipi di cancro, malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, e la fibrosi cistica 1-5. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), che catalizza la degradazione delle proteine ​​selettivo, è un obiettivo terapeutico emergente per queste condizioni 6-10. Ubiquitina ligases covalente attribuiscono polimeri dell&#39;acido ubiquitina 76-amino alle proteine ​​11. Le proteine ​​che sono stati marcati con catene polyubiquitin sono riconosciuti e proteolyzed dai ~ 2,5 megadalton proteasoma 26S 12. Gli studi avviati nel organismo modello eucarioti Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono fondamentale nella spiegazione dei meccanismi di degradazione delle proteine ​​nelle cellule eucariotiche. Il primo substrato fisiologico dimostrato dell&#39;UPS era il lievito repressore trascrizionale MATα2 13, 14, e molti componenti altamente conservati dell&#39;UPS stati identificate o caratterizzate dal lievito (es 15-26). Scoperte fatte in questo versatile e geneticamente trattabili organismo modello è probabile che continueranno a fornire importanti informazioni sui meccanismi conservati di degradazione ubiquitina-mediata. Il riconoscimento e la degradazione della maggior parte dei substrati UPS richiedono l&#39;azione concertata di diverse proteine. Pertanto, un obiettivo importante nel caratterizzare il degrado regolamentato di una data proteina instabile è quello di determinare i requisiti genetici per proteolisi. Approcci classici (ad esempio impulso-chase e esperimenti cicloeximide-chase 27) per il monitoraggio degradazione delle proteine ​​in cellule di mammifero o di lievito sono laborioso e richiede molto tempo. Mentre questi tipi di metodi forniscono mezzi altamente sensibili per la rilevazione degradazione delle proteine, non sono adatti per l&#39;analisi rapida di degradazione delle proteine ​​o screeni larga scalang per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​instabili è presentato. Nel metodo basato su crescita del lievito per analizzare degradazione delle proteine, una proteina instabile di interesse (o segnale di degradazione) è fusa, in cornice, per una proteina che è necessario per la crescita del lievito in circostanze specifiche. Il risultato è un substrato artificiale che può servire come un potente strumento per determinare i requisiti genetici di proteine ​​degradazione della proteina instabile di interesse. Convenientemente, ceppi di lievito laboratorio più comunemente utilizzati ospitano un pannello di mutazioni nei geni che codificano enzimi metabolici coinvolti nella biosintesi di particolari amminoacidi o basi azotate (ad es 20,28-30). Questi enzimi sono essenziali per la proliferazione cellulare in assenza di metaboliti esogenamente fornite in cui sintesi enzimi partecipano. Taleenzimi metabolici possono quindi funzionare come reporter di crescita a base per la degradazione delle proteine ​​instabili a cui sono fusi. I requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​possono essere facilmente chiarita, in quanto le mutazioni che impediscono proteolisi permetteranno cellule che ospitano il giornalista degrado di crescere in condizioni selettive. Un vantaggio di crescita è un&#39;indicazione indiretta che una particolare mutazione aumenta l&#39;abbondanza della proteina di interesse. Tuttavia, l&#39;analisi biochimica diretta è necessario per confermare che una mutazione permette di crescita attraverso l&#39;aumento dei livelli di proteine, piuttosto che tramite cause indirette o artefatti. L&#39;effetto di una mutazione della proteina abbondanza può essere confermata da analisi Western Blot dei livelli di proteine ​​steady-state in cellule che fanno e non ospitano la particolare mutazione. Un metodo per l&#39;estrazione rapida ed efficace delle proteine ​​di lievito (incubazione sequenziale di cellule di lievito con idrossido di sodio e tampone) in una forma adattaper l&#39;analisi mediante western blotting è presentato anche il 31. Insieme, questi esperimenti facilitare la rapida identificazione dei regolatori candidati di degradazione delle proteine.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#039;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#039;s laboratory.</td></tr><tr><td>3-amino-1&lt;em&gt;H&lt;/em&gt;-1,2,4-triazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.</td></tr><tr><td>Endoglycosidase H (recombinant form from &lt;em&gt;Streptomyces plicatus&lt;/em&gt;)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.</td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Available from a variety of manufacturers&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.</td></tr><tr><td>Plate imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Regolamentato degradazione delle proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni funzione cellulare. Inizialmente Molto di ciò che è noto circa i meccanismi molecolari e requisiti genetici per eucariotica degradazione delle proteine ​​è stato fondato nel Saccharomyces cerevisiae. Analisi classici di degradazione delle proteine ​​hanno fatto affidamento su metodologie pulse-chase e cicloeximide-chase biochimici. Mentre queste tecniche prevedono mezzi sensibili per osservare la degradazione delle proteine, sono complessi, in termini di tempo, e bassa produttività. Questi approcci non sono suscettibili di screening rapido o su larga scala per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per l&#39;identificazione facile dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​è descritto. In questo saggio, un enzima giornalista necessari per la crescita in condizioni selettive specifiche è fuso ad una proteina instabile. Le cellule privi del giornalista enzima endogeno, ma che esprimono la proteina di fusione può crescere sotto selecondizioni ctive solo quando la proteina di fusione è stabilizzato (cioè quando la degradazione delle proteine ​​è compromessa). Nel saggio di crescita qui descritto, diluizioni seriali di wild-type e le cellule di lievito mutanti che ospitano un plasmide codificante una proteina di fusione sono macchiati su terreno selettivo e non selettivo. Crescita in condizioni selettive è coerente con la degradazione compromissione da una determinata mutazione. Una maggiore abbondanza di proteine ​​deve essere confermata biochimicamente. Un metodo per la rapida estrazione di proteine ​​di lievito in una forma adatta per elettroforesi e western blotting è anche dimostrato. Una lettura di crescita a base per la stabilità proteica, combinato con un semplice protocollo per l&#39;estrazione di proteine ​​per l&#39;analisi biochimica, facilita la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine ​​di breve durata. Nell&#39;esempio presentato, l&#39;enzima HIS3, che è richiesto per la biosintesi istidina, è stata fusaa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 è mirato per la degradazione dopo si innesta aberrante reticolo endoplasmatico translocon. Le cellule che ospitano Deg1 -Sec62-HIS3 sono stati in grado di crescere in condizioni selettive quando la proteina è stato stabilizzato.

Per illustrare questa metodologia, l&#39;enzima HIS3 è stato fuso al carbossi-terminale del modello reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) per creare Deg1 -Sec62-HIS3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 rappresenta uno dei membri fondatori di una nuova classe di substrati ERAD che sono indirizzate a seguito persistente, associazione aberranti con il translocon, il canale principale responsabile per lo spostamento...

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Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Universidad de Cartagena UDEC

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JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.7K Views.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

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Biologia

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

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Biochimica

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Immunologia e infezioni

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in

Riepilogo

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Capitoli in questo video

L'identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine in ripiegamento

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in

Purificazione delle proteine tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine Ndc10 e Ndc80

Diretto Evolution Metodo

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in

Riepilogo

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L'identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Diretto Evolution Metodo

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine in ripiegamento

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione

Purificazione delle proteine tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine Ndc10 e Ndc80

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in