Name: a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

참고 : 관리와이 문서에있는 모든 쥐의 실험 조작은 코넬 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 수술에 대한 설정 <ol><li> 오토 클레이브 멸균하거나 승인 절차를 사용하여 필요한 모든 도구들을 소독. 최소한, 메스, 가위 바나, 남은 가위, 집게, 보석의 드라이버, 면봉, 견인기 세트, 임플란트 (그림 1A) 및 전달 시스템 (그림 1D, E)를 포함한다. </li><li> 70 % 에탄올 및 / 또는 적절한 소독제로, 어떤 입체경 노브를 포함한 모든 표면을 닦아. </li><li> 사용자 정의 stereotax (그림 1D)를 중첩시키고 멸균 커튼으로 벤치 탑 주변으로 멸균 필드를 만듭니다. 가열 패드 (제어 바람직 피드백) stereotax의 상단에와 멸균 커튼 아래에 배치해야합니다. </li></ol> 2. 준비수술에 대한 마우스 <ol><li> 레이트 호흡하면 약 1 호흡 / 초의 감속까지 유도 챔버 내에 5 % 이소 플루 란 / 산소 하에서 마우스를 마취. </li><li> 이소 플루 란 노출을 계속 코 콘을 사용하여 멸균 필드에서 멀리 준비 영역에 마우스를 전송합니다. 2 %에 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. 각막 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 사지 당 주입 부피의 약 50 %를 제공, 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 - 근육 (29)를 사용하여 뒷다리에 0.05 ㎎ / 100g 마우스에 글리코 (항콜린 성 약물)을 관리합니다. 주 : 글리코는 마우스가 마취 상태에서 폐 유체 축적을 방지하기위한 것이다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여, 2cm 폭 흉부 아치를 중심으로 마우스의 등쪽면, 약 3cm 길이의 부분을 면도. 잘 떨어져 면도 영역에서 어떤 손질 머리를 청소합니다. </li><li> 면도에 피하 및 말초 다음 주사를 관리29 사용하여 패치 - 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 : 1 ㎖ / 100g 마우스 5 % 포도당 생리 식염수에 (수분 공급), 5 ㎎ / ㎏ 마우스 케토 프로 펜 (진통제에 대한 NSAID), 0.2 ㎎ / ㎏ 마우스 덱사메타손 (dexamethasone)을 ( 항 염증 스테로이드)은 염증을 줄일 수 있습니다. </li><li> 면봉 사용, 세척 사이에 1 분을 기다리고, 요오드 및 70 % 에탄올의 세 가지 교류 세척을 수행합니다. </li><li> 절개 부위에 통증을 줄일 30 G 바늘과 면도 패치의 중심에 3/10 공통 주사기 - 피하 사용 29 0.125 %의 부피 바카 인 (말초 신경 블록) 100 ㎕를 관리. </li><li> 사용자 정의 stereotax (그림 1D)로 전송 마우스, 직장 온도계를 삽입하고 bupivicaine을 적용하려면 약 10 분을 기다립니다. </li></ol> 3. 노출 3 인접 흉부 척추의 등 박판을 청소 <ol><li> 메스 블레이드를 사용하여, 관심 (그림 2A)의 척추 위의 작은 (5mm 이하) 절개를 만듭니다. </li><li&gt; 중 집게를 사용하거나 수술 가위의 끝을 삽입하고 핸들을 확산하여, 무딘 절개하여 피부에있는 구멍의 크기를 증가. </li><li> 메스 나 수술 가위를 사용하여 부드럽게 피부와 기본 근육 사이의 결합 근막을 떼어 놓다. </li><li> 가능 (그림 2B)로 큰 작업 영역을 허용, 피부를 다시 개최하기 위해 견인기를 사용합니다. 가슴에 부하를 증가시켜 호흡을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 한 쌍의 집게 그립 상부 근육을 통해 노출 될 입쪽 가장 척추골 사용. 메스를 사용하여 멀리 3 척추 (그림 2C)에서 지느러미 프로세스의 양쪽에 조직을 잘라. </li><li> 메스 블레이드, 면봉, 및 / 또는 뼈 스크레이퍼의 조합을 사용하여, 지느러미 라미 (그림 2D)에서 모든 덮는 조직을 제거합니다. </li><li> 수술 가위를 사용하여 조심스럽게 두 라 테라에 척추에 부착 된 힘줄을 절단척추 (그림 2E)의 L 가장자리. </li><li> 메스를 사용하여 부드럽게 클램핑 깨끗한 표면을 제공하기 위해 가능한 척주의 측면 에지로부터 많은 조직을 제거. </li><li> 조심스럽게 뼈 스크레이퍼 및 / 또는 면봉을 사용하여 남아있는 연부 조직의 척추 시술을 시행. 다른 곳에서 수술 가위 (그림 2 층)을 사용하는 모든 부조리 한 조직을 멀리 트림. 주 : 클램핑과 척추가 완전히 노출되는 등의 후궁 절제를 수행하는 두 필수적이다. cauterizer 이후의 출혈을 조절하는데 유용 할 수있다. </li><li> 피부 (도 2F) 이외에 척주를 둘러싼 조직을 다시 잡아 견인기 시프트. </li><li> 배달 게시물에 접지 단자에 임플란트 측면 막대를 연결합니다 (그림 1E와 동일) 이후 홀더에 이러한로드합니다. </li><li> securel를 보유 할 충분한 압력을 적용, 측면 막대를 사용하여 3 척추 클램프Y (그림 2G, H). 3 척추의 레벨 클램핑을 보장하기 위해 집게를 사용합니다. 몇 번의 시도가 필요할 수도 있습니다. 사이드 바는 레벨과 후궁 절제술을 수행 평행 이전에 모두 있는지 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 면봉을 사용하여 클램핑 척추의 등 표면을 건조. </li></ol> 4. 지느러미 후궁 절제술을 수행 <ol><li> 중간 클램프 척추의 경막 외 공간에 vannas 가위의 끝을 삽입하고 가볍게 핸들을 쥐어 짜기; 뼈가 건조하면 등쪽 박판의 길이를 따라 균열한다. 얇은 판을 해제 반대편에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 신중하게 얇은 판의 주동이의 꼬리 끝에서 모든 결합 조직을 절단하고 그것을 멀리 들어 올려, 집게 등의 프로세스에 의해 느슨한 얇은 판 파지. </li><li> 0.9 %의 식염수 및 / 또는 인공 뇌척수액 (ACSF)를 사용하여, 철저하게 혈액 overlyi을 씻어척수 겨. 초과 액체를 흡수하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 위 vannas으로 조심스럽게 위로 임플란트 사이드 봉에 뼈의 측면 에지 트림. 다시 씻어 ​​내고 면봉 식염수 / ACSF를 사용하여 출혈을 제어 할 수 있습니다. </li><li> 30 G 바늘 - 골막의 일부가 분리 및 척수를 덮는다었을 부드럽게 면봉 및 / 또는 29을 사용하여이 조직을 제거. 절차의이 부분에서 척수를 손상하지 않도록주의하십시오. 단단히 감싸 경막과 느슨한 골막을 혼동하지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 하나 치과 아크릴 및 시아 노 아크릴 레이트 (도 2I) 모두와 뼈의 나머지 노출 된 가장자리를 밀봉. 접착제가 노출 된 척수에 흘러 가지 않도록 특별한주의하십시오. </li></ol> 5. 인감 상공 회의소 <ol><li> 4 슬롯 사이드 봉 (4)에 구멍을 일렬 것을 개구 위에 놓이는 노출 된 스핀 있도록 신중 상판 놓고알 코드 (그림 1B와 2J). </li><li> 보석의 드라이버를 사용하여 조심스럽게 포셉 또 한 쌍으로 드라이버의 샤프트를 안정화, 첫 번째 나사를 시작합니다. 이 단계에서 나사를 조입니다,하지만 처음 몇 스레드가 활성화되도록 삽입하지 마십시오. 다른 나사 3 개에 대해이 과정을 반복합니다. 참고 :이 단계에서 위치를 조절 나사를 돕기 위해 티타늄 또는 다른 비 자화 집게를 사용하는 것이 유용하다. </li><li> 대신에 4 개의 나사, 나사가 단단히 (그림 2K)을 확보 할 때까지 각각의 작은 단위로 같은 양에 의해 교대로 나사를 조입니다. 상판이 과정에서 휘어 것이 특이 아닙니다. 나사 머리가 손상 될 수 있습니다 과도한 하락 압력 클램프을 제거 및 / 또는 척수 부상의 원인이되므로, 너무 많은 나사를 조이 않도록주의하십시오. </li><li> 척수 및 유리 창 사이의 공간을 채우기 위해 실리콘 엘라스토머를 사용한다. 이 미상 때문에경화시 아세트산을 생산하지 S, KwikSil 브랜드 엘라스토머 및 믹싱 팁을 사용합니다. 노출 된 척수에 실리콘의 자유 부분을 적용합니다. 믹싱 팁의 사전 척수 응용 프로그램에 기포가 포함 된 실리콘 없애주의하십시오. </li><li> 신속하게 작업을 조심스럽게 상판의 삽입에 5mm # 0 커버 슬립을 누릅니다. 점차적으로 척수를 둘러싸 액체 엘라스토머를 쥐어 짜기,하지만 척수 압축 (그림 2L)에 포함되지하기에 충분한 압력을 적용합니다. 엘라스토머 시간을 설정하면 너무 커버 슬립이 빠르게 적용되어 있는지 확인, 약 90 초입니다. </li><li> 5.5 - 실패한 밀봉의 경우, 엘라스토머가 설정 될 때까지 부드럽게 집게로 임플란트에서 제거하고 5.4을 반복 기다립니다. </li><li> 치과 아크릴 / 시아 노 아크릴 레이트와 삼출 엘라스토머 에지를 덮고 척수의 표면 위에 어긋남 엘라스토머를 방지하기 위해 가능한 한 많이 둘러싸는 뼈에 부착. </li><li> 견인기를 제거하고 임플란트의 가장자리 주위에 피부를 당기십시오. 시아 노 아크릴 레이트를 사용하면, 임플란트 (도 2 M, N)의 가장자리에 부착 피부. </li><li> 삽입 # 0-80 - 1/4 &quot;상판의 날개 (그림 1C 2 O)에 나사를 설정합니다. </li><li> 치과 아크릴을 사용하여, 상부 판 (도 2P)의 나사 구멍에 틈을 밀봉. </li></ol> 6. 수술 후 케어 <ol><li> 큰 깨끗한 케이지에 마취 및 장소에서 동물을 제거합니다. 케이지는 챔버는 아무것도 걸리지 않습니다 충분히 큰지 확인 케이지에 걸쳐 정상 운동의 과정 동안 (예 : 물병 및 / 또는 식품의 V 모양의 딥 등). 주 : 표준 쥐 케이지가 이상적입니다. </li><li> 동물이 회복하면서 가열 된 표면에 케이지를 놓습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. </li><li> 동물 beha 확인통증이나 고통과 임플란트 무결성의 흔적이 2 시간의 수술 후 - 1 ~ vior. 참고 : 보통 상태에서, 동물이 이동에 적당한 동요와 ambulate 할 수 있어야한다. </li><li> 무게를 측정하고 동작을 모니터링, 처음 72 시간 동안 12 시간 - 동물마다 8 확인을 계속합니다. 동물이 밤 동안 활성 및 이동되어 있는지 확인합니다. 지상의 형태로 젖은 음식은 물이나 영양 젤, 우 펠렛과 혼합 차우, 마시는 물은 바닥 수준에서 제공되어야한다. 피하 또는 intraperiotoneal 주사에 의한 추가 수화 필요에 따라 제공되어야한다. </li><li> 수술 후, 24 및 48 시간의 시점에서 5 ㎎ / ㎏ 마우스 케토 프로 펜과 0.2 ㎎ / ㎏ 마우스 덱사메타손 피하 관리합니다. 또한, 0.005-0.010 ㎎ / 100g 마우스는 72 시간 동안 피하 주사로 매일 8 시간을 투여해야한다. </li></ol> 7. 생체 이미징 <ol><li> 아래 마우스를 마취호흡 속도까지 유도 챔버에서 5 % 이소 플루 란 / 산소 약 1 호흡 / 초의 감속. </li><li> 피드백 제어 가열 패드 사용자 정의 stereotax (그림 1D)에 마우스를 전송하고 직장 온도계를 삽입합니다. 2 %에 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. </li><li> 사지 당 주입 부피의 약 50 %를 제공, 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 - (29)를 사용하여 뒷다리에 글리코 0.05 ㎎ / 100g 마우스 근육을 관리합니다. </li><li> 피하 식염수 1 ㎖ / (수분 공급) 100g 마우스 5 % 포도당 한 번 시간 당을 관리합니다. </li><li> 수술 (그림 1 층)에 사용되는 포스트 홀더에 나사 챔버 홀더를 삽입합니다. 높이를 조정하고 상판에 고정 나사 위에 게시물을 비틀. </li><li> 두 홀더 부착으로 가슴 자유롭게 영감에 따라 확장 할 수있을 때까지, 포스트 홀더의 홀더를 상승. 참고 : 소유자의 회사 부착하고 가슴 significan의 자유로운 확장 모두TLY 호흡에 의한 움직임 아티팩트를 줄일 수 있습니다. </li><li> 원하는대로 이미지를 수행합니다. </li><li> 이미지가 완료되면, 저급 게시물, 챔버 홀더 비틀어 복구 가​​열 된 표면에 직장 온도계 및 도시 마우스를 제거한다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. </li></ol>

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M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

여기에 입증 기술은 반복, 시간 경과를 허용, 몇 주에 밖으로 지느러미 마우스 SC의 생체 내 이미징은 이후 수술 절차가 필요없이 작동 가능 게시합니다. 이 절차를 반복 수술 영상 검사를 통해 또는 휴대 역학에 대한 정보가 손실 portmortem 조직 학적 접근 방법을 통해 상당한 개선을 나타냅니다. 우리는 이전에 (30)는 생체 내에서 SCI 병리학을 공부하는이 기술의 가치를 증명하고있다. 영상의 최대 길이 범위는 SC의 등 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 결정 하였다. 시간이 지남에 따라,이 성장은 이미지 콘트라스트와 해상도의 손실의 결과. 이러한 성장은 다른 수술 준비 (31)에서 볼 수있다. 일화, 우리는주의 깊게의 표면을 밀봉, 혈액 제품을 제거하기 위해 지느러미 SC 표면을 세척하여 이러한 성장이 최소화 될 수 있음을 발견했다시아 노 아크릴 레이트와 잘라 뼈, 실리콘 엘라스토머와 잘 챔버의 가장자리를 밀봉하고, 등쪽 SC과 커버 유리 사이의 격자 공간을 최소화한다. 최근 폴리 카르 보 네이트를 사용하여 챔버 자체와 유사한 또 다른 방법 (32)을 보여왔다. 우리의 스테인레스 스틸 부품의 경우가 X 선 및 음향 영상 방식과 호환 때문에 폴리 카보네이트의 사용은 유리하다. 그러나, 3 차원 프린터의 현재 유비쿼터스, 챔버 부품은 필요에 맞는 다양한 재료로부터 제조 될 수있다. 우리는 최근에 명확한 포토 폴리머 우리의 모든 부분을 인쇄했습니다. 밀폐 된 챔버의 한 가지 중요한 단점은 약물이나 SC 영상 (34)에 적합한 외생 염료의 반복 투여 량을 관리 할 수 없다는 것입니다. 그러나, 우리의 현재 시스템의 기계적 안정성을 활용하여, 우리는 이미 성공에 우리의 현재 챔버를 사용했다LY 심지어 밀폐 챔버 방식 (출판 서적)에서 여러 시점에서 약물 전달을 허용 피하 주입 주입구에 접속 막내 카테터를, 앵커. 또한, 인해 상판의 모듈 형 특성으로 이러한 준비의 미래 버전 치료제 및 형광 라벨 모두의 반복 응용 프로그램 수 있도록 다시 봉합 할 수있는 챔버를 포함 할 것이다. 이는 약물 전달 용 전극, 광학 삽입하고, 포트를 기록하기위한 설치대 가기 판을 구상 할 수있다. 이러한 추가 가능성 Fenrich 등. (31)의 더 멀 시스템을 사용하여 구현하기가 더 어려울 수있다. 결론적으로, 우리의 챔버는 다양한 실험의 기반이 될 수있는 게이트웨이 플랫폼을 제공합니다.

그대로 생물 생체 현미경 시간 경과는 면역 조직 화학 염색과 같은 기존의 단일 시점 분석에 액세스 할 수없는 복잡한 생물학적 과정의 직접 시각화 할 수 있습니다. 구체적으로, 다중 광자 현미경 (MPM) (1)는 2,3- 최대 4 1mm 초과 촬상이 달성 된 설치류 신피질로, 조직을 산란 이미징을 허용한다. 하나의 절차 개월 주 동안 뇌에 광 액세스 할 수 있습니다 5-7있는 수술 준비와 결합하면, 이러한 현미경 접근 방식이 건강하고 병에 걸린 상태 8-11 뇌의 동적 프로세스를 연구하는 데 사용되었다. 또한, 분석 프로토콜은 행동 동안에 셀룰러 - 해상도 이미징 기능을 허용 웨이크 (즉, 비 마취) 동물에서 생체 내 이미징 제공 12,13 개발되었다. 이러한 프로토콜은 comparis 사용되어왔다신경 활성 상관 (14)의 기능은, 마취 된 동물에서 깨어 15 시그널링 성상 세포는 칼슘, 작업 별 신경 클러스터 (16)의 식별 및 신경 세포의 능력은 휘스커 자극 17에 객체 위치를 판별한다. 질병기구 (18)와 같은 급성 축삭 변성의 식별 (AAD)를 허용 마우스 척수 (SC)에인가 된 건강 및 병리 기전, 생체 내 이미징 경과 해명이 접근법의 전위를 부여. 후속 연구는 후근 신경절 (DRG) 축삭 재생 (19), 축삭 재생 (20)에 혈관의 역할, 부상 (21)에 대응 아교 화성, 실험자가 면역 뇌척수염의 T - 세포 이동 (EAE) (22), 활동에 주변 병변의 효과를 조사 amyotroph에 대한 응답으로 미세 아교 세포의 23, 24 및 성상 세포 (25)IC 측삭 경화증 (ALS), SC 손상 (SCI) 26 후 축삭 발아에서 STAT-3의 역할 및 EAE 27 축삭 손실 및 복구 메커니즘. 이러한 방법의 성공에도 불구하고, 이러한 모든 연구 시점 액세스에게의 수를 제한하는 모든 촬상 시점에서 동물의 수술 개구 반복 필요한 다른 이에 단기 역학 연구를 제한 한 촬상 세션 중 하나에 한정하거나시켰다 혼동 및 실험적 인공물의 가능성을 증가시킨다. 이러한 수술에 대한 프로토콜은 이전에 28,29 발표되었다. 최근에, 우리는 반복 수술이 필요없이 여러 주 동안 마우스 SC에서 시간 경과 MPM 이미징을 활성화 만성 척추 챔버의 주입하는 기술 (30)을 발표했다. 간단히 말해서,이 수술 준비는 낮은 흉부 척추 후궁 절제술 및 네 부분으로 된 챔버의 주입을 수행 포함되어 있습니다. 챔버 포함후궁 절제술을 둘러싼 척추 및 유리 커버 슬립 위에 배치 SC 실리콘 엘라스토머를 클램프로 고정 세 맞춤 스테인리스 가공 부품. 이 기술은 반복 수술이 필요없이 건강하고 부상당한 상태에서 수술 후 이상 오주 밖으로 루틴 이미징 허용. 촬상 시점의 개수는 동물이 마취 유도를 허용 할 수있는 주파수로 제한되었다. 이미징 수명 SC의 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 제한되었다. 또, 외과 용 임플란트가 운동 기능에는 장기적인 효과를 가지고 있다는 것을 확인. 당초 발행 된 이후에, 또한 SC 장기 이미징을 가능 대안 적 방법은 다른 장소 31-33 설명되었다. 이 프로토콜은 우리가 개발 한 척추 실을 주입에 대한 우리의 과정을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>forceps, scissors, scalpel, etc.</td><td>Fine Science Tools</td><td>multiple&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -magnetic fixator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>other retractors may also be used</td></tr><tr><td>retractor kit -elastomer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>feedback controlled heating blanket</td><td>CWE Inc.</td><td>Model: TC-1000 Mouse&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Part No. 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>stereotax</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber holders</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8101</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8501</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastomer</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Mixing Tips</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIKMIX</td><td></td></tr></tbody></table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

전술 한 절차에 따라, 수술의 각 단계는도 2에서 설명한 수술의 각 단계에 대한 결과를 모방한다. 특별한주의가 유리 아래 기포를 제거하는 실리콘 엘라스토머를 도포 할 때 수행되거나 적어도 이들이 있는지 확인해야 관심 영역 (도 2L)의 주변에 위치. 숙련 된 외과 의사의 경우, 수술 중 또는 최초의 24 시간 postsurgery 내에서 하나 안락사를 요구하는 수술 합병증에 작업의 약 20 %를 발생합니다. 이러한 합병증은 가장 자주 과도한 연조직 출혈 또는 안전하게 척추에 실을 부착 실패에 발생한다. 성공적으로 이식 실에서, 창은 일반적으로 여러 주 (그림 3)에 대한 광학적으로 투명 남아있다. 최선의 노력에도 불구하고, 불투명, 섬유, 종양 성장은 종종 부분 obscuri 결과, 몇 일 이내에 형성윈도우의 NG (그림 3C - F, 검은 점선). 형광 구조는 섬유 조직이 밑에 2PEF 현미경을 사용하여 참조하기 어렵다. 우리는 성공적으로 이식 윈도우의 약 50 %가 수술 후 5 개 이상의 주 동안 분명 남은, 결과의 바이 모달 분포를 발견하고, 약 50 %는 1에서 난독 화되는 것을 - 3 주. 2PEF 영상을 방해하지 않습니다 -보기 창의 경험 또는 경질 (F, 녹색 별표 그림 3D) 위의 신생 혈관 만 적당한 수준 내에서 분명, 대부분의 장소로 남아 창하십시오. 우리의 이전 연구 (30)는 두개 창 제제 5에서 본 것과 유사한 가벼운 염증을 나타내는 창에 인접 척추골의 밑에 미세 아교 세포의 증가하지만 성상 세포 밀도를 나타냈다. 후근 gangl의 서브 세트에 옐로우 형광 단백질 (YFP)를 발현하는 트랜스 제닉 마우스에서IA (DRG) 뉴런 (YFPH 라인; 잭슨 연구소), 축삭 명확 수술후 주간 구별되었다 (도 4A 및 B) 및 하나만큼 동물에서 몇 달 같이 (데이터는 미도시). 혈관 (도 4A 및 B)은 혈장에 표지 된 덱스 트란 레트로 공전 주입 텍사스 레드 형광에 의해 가시화 하였다. 미세 아교 세포는 CX3CR1 녹아웃 마우스에 GFP를 발현하는 생쥐에서 가시화되었다 (CX3CR1-GFP, 잭슨 연구소)가 YFPH 라인 (그림 4C)을 건넜다. 대비와 해상도로 인해 이전에 30 설명 섬유질과 성장의 형성에 시간 (그림 4C)을 통해 겸손하게 악화되었다. 우리는 일상적으로 매일 12 시간만큼 자주 사망하지 않고 단일 세션에서 3 시간 동안 몇 군데. 세션 지속 시간 및 주파수는 실험 동물에 통증과 고통을 수반하는 윤리적 고려 사항 마취 유도, 수반에 대한 동물의 허용 오차에 의해 제한된다. &lt;<html> 유지-together.within 페이지를 = &quot;항상&quot;&gt; : FO P 클래스 = &quot;jove_content&quot; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> 그림 1. 커스텀 수술실는 주입 중에 챔버 전달을 용이하게하고 후속 이미징 세션 동안 챔버를 안정화시킨다. 두 사이드 바 천판 (A)는 척추 챔버 (C)에 작은 나사를 사용하여 (B) 조립된다. 연장 포스트 (D)와 수술대 구금 핀을 사용하여 척추 (E)에 사이드 바의 클램핑 전달을 허용한다. 이후 영상 세션 대신 임플란트 (F)의 날개에 고정 나사를 통해 챔버에 연결하기 위해 내부적으로 스레드 게시물을 사용합니다. 이 그림의 패널 B는 자연 출판 그룹의 허가 파라 외., 자연 방법 2012 년 30에서 수정되었습니다.96 / 52196fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> 도 2는 등쪽 후궁 절제술이 수행되고 만성 촬상 챔버 척수 광학 접근을 제공하기 위해 주입된다. 몽타주 절차에 대하여 설명한다. 먼저, 피부 (패널 A는, B, 프로토콜 절 3.1-3.4) 및 근육 (C; 3.5) 세 하부 척추를 노출 시키도록 후퇴된다. 이들 세 개의 척추를 덮는 조직이 제거된다 (D, E, F, 3.6-3.10)가 양면 (; 3.12 G, H)에 고정되기 전에 처리 및 횡 깨끗 긁어. 조심스럽게 척추 중앙의 등쪽 라미 제거하고, 뼈의 가장자리 (I 봉인 </strong&gt;; 4. 6). 상판 (J; 5.1)를 적용하고 나사 위치 (K 5.3)에 고정 실리콘 엘라스토머 및 커버 유리 (; 5.5 L)와 챔버를 밀봉하기 전에 실을 확보. 전달 핀 (M; 5.8)가 제거 된 후, 피부는 챔버의 측면에 접착된다 (M, N 5.8) 및 세트 스크류는 날개 (O 5.9)에 삽입된다. (P, 5.10) 마지막으로, 나사 슬롯이 치과 아크릴로 밀봉된다. 마우스가 복구하는 깨끗한 케이지에 위치 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> 그림 3. 만성 척추 챔버는 광학적으로 투명 오븐을 유지여러 주 어. 몇 분 (A)에서 수술 후 삼주 (F)에 이르기까지 척수의 백색광 이미지. 혈관 랜드 마크는 모든 시점 (노란색 화살표)에서 식별 할 수 있습니다. 작은 변화는 하루 postsurgery (B)에서 볼 수있다. 조밀 한 섬유 자라 (C - 오른쪽 아래에 점선으로 경계 F는) 선물로 초기 세 가지로 일 이미징 영역의 부분 난처 결과입니다. 가벼운 혈관 신생 (D, E, F, 녹색 별표)도 존재하지만. 백색광 또는 2PEF 영상의 원본 혈관을 가리지 않는 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 그림 만성 척추 챔버는 반복 수술이 필요없이 반복 다중 광자 이미징을 허용 4.. 척추의 등 funiculi에서 DRG 축삭 (녹색)의 부분 집합에 YFP을 표현 형질 전환 마우스를 반복 영상 코드 및 혈관 내 주입 염료 (A, B)에 의해 표지 된 혈관 (빨간색). 미세 아교 세포 (자주색)의 활동도 Thy1-YFP / CX3CR1-GFP 형질 전환 마우스 더블 (C)에서 시간 경과를 추적 할 수있다. 축삭과 미세 아교 세포가 계속 볼 수 있지만, 시간이 지남에 따라 적당한 콘트라스트와 해상도 감소 (C). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

14.1K 조회수.  Cornell University.  이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다. 

비디오: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

This is a compact visual description of a combination of surgical technique and device for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. While the technique is demonstrated in the animal, the procedure is FDA-approved and currently being used for stem cell transplantation into the spinal cords of patients with ALS. While the FDA has recognized proof-of-principle data on therapeutic efficacy in highly characterized rodent models, the use of large animals is considered critical for validating the combination of a surgical procedure, a device, and the safety of a final therapy for human use. The size, anatomy, and general vulnerability of the spine and spinal cord of the swine are recognized to better model the human. Moreover, the surgical process of exposing and manipulating the spinal cord as well as closing the wound in the pig is virtually indistinguishable from the human. We believe that the healthy pig model represents a critical first step in the study of procedural safety.

Short visual description of the surgical technique and device used for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. The technique is demonstrated in the animal but is entirely translatable and currently being used for human application.

치료의 척추 배달을위한 수술 기법 : 괴팅겐 Minipigs의 절차의 데모

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

의학

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

리소 레시틴의 초점 주사 실험 탈수 초화 및 설치류 척수의 재유 수화

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

생체공학

In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The purpose of this method is to describe a novel mouse model of spinal implant infection (SII) that was created to provide an inexpensive, rapid, and accurate in vivo tool to test potential therapeutics and treatment strategies for spinal implant infections.
In this method, we present a model of posterior-approach spinal surgery in which a stainless-steel k-wire is transfixed into the L4 spinous process of 12-week old C57BL/6J wild-type mice and inoculated with 1 x 103 CFU of a bioluminescent strain of Staphylococcus aureus Xen36 bacteria. Mice are then longitudinally imaged for bioluminescence in vivo on post-operative days 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28, and 35. Bioluminescence imaging (BLI) signals from a standardized field of view are quantified to measure in vivo bacterial burden.
To quantify bacteria adhering to implants and peri-implant tissue, mice are euthanized and the implant and surrounding soft tissue are harvested. Bacteria are detached from the implant by sonication, cultured overnight and then colony forming units (CFUs) are counted. The results acquired from this method include longitudinal bacterial counts as measured by in vivo S. aureus bioluminescence (mean maximum flux) and CFU counts following euthanasia.
While prior animal models of instrumented spine infection have involved invasive, ex vivo tissue analysis, the mouse model of SII presented in this paper leverages noninvasive, real time in vivo optical imaging of bioluminescent bacteria to replace static tissue study. Applications of the model are broad and may include utilizing alternative bioluminescent bacterial strains, incorporating other types of genetically engineered mice to contemporaneously study host immune response, and evaluating current or investigating new diagnostic and therapeutic modalities such as antibiotics or implant coatings.

The protocol describes a novel in vivo mouse model of spinal implant infection where a stainless-steel k-wire implant is infected with bioluminescent Staphylococcus aureus Xen36. Bacterial burden is monitored longitudinally with bioluminescent imaging and confirmed with colony forming unit counts after euthanasia.

척추 임플란트 감염의 In Vivo 마우스 모델

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The ...

설치류의 척수 수술 및 광학 생크 이식

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the spinal cord remains relatively unexplored. The inherently delicate and mobile spinal cord tissue imposes constraints that make the precise implantation of neural probes challenging. Despite recent advances in neuromodulation devices, particularly flexible bioelectronics, opportunities to expand their use in the spinal cord have been limited by the surgical complexities of device implantation. Here, we provide a series of surgical protocols tailored specifically for the implantation of a custom-made optoelectronic device that interfaces with the spinal cord in rodents. The steps to place and anchor an optical shank on a specific segment of the spinal cord via two different surgical implantation methods are detailed here. These methods are optimized for a diverse range of devices and applications, which may or may not require direct contact with the spinal cord for optical stimulation. To elucidate the methodology, the vertebral anatomy is referenced first to identify prominent landmarks before making a skin incision. The surgical steps to secure an optical shank over the cervical spine in rodents are demonstrated. Procedures are then outlined for securing the optoelectronic device connected to the optical shank in a subcutaneous space away from the spinal cord, minimizing unnecessary direct contact. Behavioral studies comparing animals receiving the implants to those undergoing sham surgeries indicate that the optical shanks did not adversely affect hindlimb or forelimb function seven days post-implantation. The present work broadens the neuromodulation toolkit for use in future studies aimed at investigating various spinal cord interventions.

저자 스포트라이트: 설치류 척수에 신경 프로브를 이식하고 고정하기 위한 혁신적인 방법론

This protocol details a surgical procedure for performing spinal cord surgery and for implanting and securing an optical shank over the spinal cord in rodents.

설치류 척수에 광전자 장치 이식

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차

요약

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