Name: a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#956;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:+Al+2+O+3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#956;m in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier.</a> Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).</li><li>Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo,+Deep+Tissue+Three-Photon+Imaging+at+the+1700-nm+Spectral+Window.">In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window.</a> Biomedical Optics. 7 (3), (2012).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Lichtman, J. W., DENK, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Big+and+the+Small:+Challenges+of+Imaging+the+Brain's+Circuits.">The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits.</a> Science. 334 (6056), 618-623 (2011).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake,+Mobile+Mice.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Imaging+of+Neural+Activity+in+Awake,+Head-Restrained+Mice.+.">Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. .</a> Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).</li><li>Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats).">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats).</a> Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).</li><li>Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clustering+of+Neurons+in+Motor+Cortex+Determined+by+Cellular+Resolution+Imaging+in+Awake+Behaving+Mice.">Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice.</a> Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).</li><li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).</li><li>Ylera, B., Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-Injured+Adult+Sensory+Neurons+Gain+Regenerative+Competence+upon+a+Lesion+of+Their+Peripheral+Axon.">Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon.</a> Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).</li><li>Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+by+in+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+vascular+and+axonal+networks+in+injured+mouse+spinal+cord.">Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).</li><li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS.">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> Plos One. 6 (3), 17910 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nature Communications. 3, 1227 (2012).</li><li>Dibaj, P., Steffens, H., Zsch&#252;ntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+rapid+morphological+reactions+of+astrocytes+towards+focal+lesions+in+an+ALS+mouse+model.">In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model.</a> Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).</li><li>Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

هذه التقنية أثبتت هنا تسمح المتكررة، الوقت الفاصل، في الجسم الحي التصوير من ظهري الماوس SC إلى عدة أسابيع بعد الجراحة دون الحاجة إلى عمليات جراحية لاحقة. يمثل هذا الإجراء تحسنا كبيرا خلال دراسات التصوير تكرار جراحة أو على النهج النسيجية portmortem، حيث يتم فقدان المعلومات عن ديناميات الخلوية. لدينا في السابق 30 أثبتت قيمة هذه التقنية لدراسة SCI علم الأمراض في الجسم الحي. تم تحديد أقصى مدى الطولي للتصوير من خلال نمو لذلك، النسيج الليفي كثيفة على السطح الظهري للSC. مع مرور الوقت، وأدى هذا النمو إلى فقدان النقيض من الصورة والقرار. كما تم رأيت هذا النمو في الأعمال التحضيرية الجراحية البديلة 31. الروايات المتناقلة، لاحظنا أن هذا النمو يمكن التقليل من غسل بعناية السطح الظهري SC لإزالة منتجات الدم، وختم سطحقطع العظام مع cyanoacrylate، وختم حواف من الغرفة جيدا مع السيليكون والمطاط الصناعي، والتقليل من الفضاء الخلالي بين SC الظهرية وغطاء زجاجي. في الآونة الأخيرة، فقد ثبت مقاربة أخرى مماثلة لمنطقتنا باستخدام غرفة البولي 32. استخدام البولي هو مفيد لأنه متوافق مع الأشعة السينية وطرائق التصوير الصوتية، وهي ليست الحال بالنسبة لأجزاء لدينا الفولاذ المقاوم للصدأ. ومع ذلك، مع التكنولوجيا الآن في كل مكان من الطابعات 3D، يمكن أن تكون ملفقة أجزاء الغرفة من مجموعة واسعة من المواد لتتناسب مع احتياجات محددة. لقد طبعت مؤخرا جميع أجزاء لدينا في فوتوبوليمير واضح. عيب واحد رئيسي في غرفة مغلقة هو عدم القدرة على إدارة جرعات متكررة من الأدوية أو الأصباغ الخارجية مناسبة لSC التصوير 34. ومع ذلك، من خلال الاستفادة من الاستقرار الميكانيكي للنظام الحالي دينا، ونحن قد استخدمت بالفعل لدينا غرفة الحالية إلى النجاحلاي ترسيخ قسطرة داخل القراب متصلة تحت الجلد المزروع ميناء حقن، مما سمح لتسليم المخدرات في نقاط زمنية متعددة حتى في نظام الدائرة المغلقة (عمل غير منشورة). وعلاوة على ذلك، نظرا لطبيعة وحدات من الصفيحة العلوية، سوف الإصدارات المستقبلية من هذا المستحضر تشمل غرفة الأغلاق للسماح لتطبيق المتكررة من كل من العوامل العلاجية والعلامات الفلورية. ومن الممكن أيضا أن نتصور العليا لوحات مع تصاعد لتسجيل الأقطاب، وتدرج البصرية، ومنافذ لتوصيل الدواء. ان مثل هذه الإضافات من المرجح أن تكون أكثر تحديا لتنفيذ باستخدام نظام أكثر الحد الأدنى من Fenrich وآخرون. 31. وفي الختام، تقدم غرفة لدينا منصة بوابة التي تقوم عليها ويمكن أن تستند التجارب المتنوعة.

الوقت الفاصل في الجسم الحي المجهري في الكائنات سليمة تمكن رؤية مباشرة من العمليات البيولوجية المعقدة التي لا يمكن الوصول إليها لالتقليدي تحليل نقطة لمرة واحدة، مثل المناعية. على وجه التحديد، المجهري متعدد الفوتون (MPM) 1 يسمح للتصوير في نثر الأنسجة، مثل القشرة المخية الحديثة القوارض، حيث تحقق التصوير تصل إلى 2،3 والتي تزيد من 4 1 مم. عندما جنبا إلى جنب مع الاستعدادات الجراحية 5-7 التي إجراء واحد يسمح بالوصول البصري إلى الدماغ لمدة أسابيع أو شهور، وقد استخدمت هذه الأساليب المجهر لدراسة العمليات الدينامية في الدماغ في الدول السليمة والمريضة 8-11. وبالإضافة إلى ذلك، تم وضع بروتوكولات 12،13 التي توفر للتصوير في الجسم الحي في مستيقظا (أي غير تخدير) الحيوانات، والسماح لالخلوية القرار التصوير وظيفية خلال المقايسات السلوكية. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لcomparisإضافات من مترابطة نشاط الخلايا العصبية 14، نجمية الكالسيوم مما يشير إلى 15 في الحيوانات تخدير ومستيقظا، وتحديد مهمة محددة مجموعات الخلايا العصبية 16، وقدرة الخلايا العصبية لتميز موقع الكائن على الخط الطولي التحفيز 17. ونظرا للإمكانات هذا النهج لتوضيح آليات صحية ومرضية، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي تم تطبيقها على الحبل الشوكي الماوس (SC)، والسماح لتحديد انحطاط محور عصبي حاد (AAD) كآلية المرض 18. التحقيق دراسات لاحقة آثار الآفات المحيطية على العقد الجذرية الظهرية (DRG) محور عصبي تجديد 19، ودور الأوعية الدموية في محور عصبي تجديد 20، الكيميائي الدبقية ردا على إصابة 21، والهجرة T-خلية في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) 22، والنشاط من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية 23،24 25 ردا على amyotrophالتصلب الجانبي جيم (ALS)، ودور STAT-3 في تبرعم محور عصبي بعد SC إصابة (SCI) 26، وآلية من فقدان محور عصبي والانتعاش في EAE 27. وعلى الرغم من نجاح هذه المناهج، وجميع هذه الدراسات تقتصر على إما جلسة التصوير واحدة، مما يحد من الدراسات لديناميكية على المدى القصير، وإلا اللازمة المتكررة الفتحات الجراحية للحيوان في كل نقطة زمنية التصوير، مما يحد من عدد من النقاط الزمنية الوصول إليها ويزيد من احتمال من التحف التجريبية التباس. وقد نشرت البروتوكولات لهذه العمليات الجراحية سابقا 28،29. في الآونة الأخيرة، نشرنا تقنية 30 لغرس غرفة العمود الفقري المزمنة التي مكنت الوقت الفاصل بين التصوير MPM في SC الماوس فوق أسابيع عدة دون الحاجة إلى تكرار عملية جراحية. لفترة وجيزة، وشملت هذه إعداد الجراحية أداء الثقب في العمود الفقري الصدري السفلي وغرس غرفة من أربعة أجزاء. الغرفة شملتثلاثة أجزاء الفولاذ المقاوم للصدأ خصيصا تشكيله التي فرضت فقرات المحيطة الثقب، وساترة الزجاج توضع فوق SC والمضمون مع سيليكون المطاط الصناعي. هذه التقنية سمحت للتصوير روتيني إلى أكثر من 5 أسابيع بعد العمل الجراحي في حالات صحية والجرحى دون الحاجة لتكرار عملية جراحية. عدد نقاط وقت التصوير كان محدود فقط من التردد الذي الحيوان يمكن أن يتسامح مع تحريض التخدير. تم تصوير حياة محدودة بسبب نمو، النسيج الليفي كثيفة على سطح SC. وبالإضافة إلى ذلك، نحن التحقق من أن عملية الزرع الجراحي لم يكن لها تأثير على المدى الطويل على وظيفة الحركة. منذ نشر لدينا الأولي، وقد وصفت النهج البديلة أيضا تمكين التصوير طويل الأجل في أماكن أخرى SC 31-33. يوضح هذا البروتوكول إجراءاتنا لزرع الغرفة العمود الفقري وضعنا.

<table><tbody><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>forceps, scissors, scalpel, etc.</td><td>Fine Science Tools</td><td>multiple&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -magnetic fixator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>other retractors may also be used</td></tr><tr><td>retractor kit -elastomer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>feedback controlled heating blanket</td><td>CWE Inc.</td><td>Model: TC-1000 Mouse&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Part No. 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>stereotax</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber holders</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8101</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8501</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastomer</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Mixing Tips</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIKMIX</td><td></td></tr></tbody></table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

باتباع الإجراء أعلاه، يجب على كل مرحلة من مراحل عملية جراحية تحاكي نتائج كل مرحلة من مراحل عملية جراحية المبين في الشكل 2. يجب توخي الحذر خاصة عند تطبيق المطاط الصناعي السيليكون للقضاء على فقاعات الهواء تحت الزجاج أو على الأقل ضمان أنهم تقع في محيط منطقة الفائدة (الشكل 2L). لجراح ذوي الخبرة، والمضاعفات الجراحية التي تتطلب القتل الرحيم إما أثناء الجراحة أو خلال أول 24 ساعة postsurgery تحدث في حوالي 20٪ من العمليات. تنشأ هذه المضاعفات الأكثر شيوعا من نزيف مفرط الأنسجة اللينة أو عدم إرفاق آمن الغرفة إلى العمود الفقري. في غرف زرعها بنجاح، يبقى نافذة عادة شفافة بصريا لأسابيع متعددة (الشكل 3). وعلى الرغم من أفضل الجهود، يشكل، ليفي، ونمو الأورام مبهمة في كثير من الأحيان في غضون بضعة أيام، مما أدى إلى obscuri جزئينانوغرام من النافذة (الشكل 3C - F، خط متقطع الأسود). الهياكل الفلورسنت من الصعب أن نرى باستخدام 2PEF المجهري تحت هذا النسيج الليفي. نجد التوزيع ذات النسقين النتائج، مع ما يقرب من 50٪ من النوافذ زرعها بنجاح المتبقية واضحة لأكثر من 5 أسابيع بعد العمل الجراحي، وحوالي 50٪ تصبح التعتيم ضمن 1 - 3 أسابيع. للنوافذ التي لا تزال واضحة، ومعظم الأماكن داخل نافذة عرض تجربة فقط على درجة متواضعة من اتساع الأوعية الدموية في أو فوق الجافية (الشكل 3D - F، النجمة الخضراء)، والتي لا تعيق 2PEF التصوير. وأظهرت دراستنا السابقة 30 زيادة في الخلايا الدبقية الصغيرة ولكن ليس كثافة نجمية تحت النافذة وفقرات المجاورة، مشيرا إلى التهاب خفيف مماثل لتلك التي شوهدت في الجمجمة الاستعدادات نافذة 5. في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتين أصفر فلوري (YFP) في مجموعة فرعية من ظهري gangl الجذرIA (DRG) الخلايا العصبية (خط YFPH، جاكسون مختبرات)، وكانت محاور بوضوح مميزة لعدة أسابيع بعد العملية (الشكل 4A و ب) وطالما أربعة أشهر في حيوان واحد (لا تظهر البيانات). وقدمت الأوعية الدموية (4A الشكل وباء) مرئية عن طريق حقن-orbitally الرجعية الفلورسنت تكساس الأحمر المسمى ديكستران في بلازما الدم. تم تصور الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في الفئران معربا عن GFP في CX3CR1 الضربة القاضية في الماوس (CX3CR1-GFP، جاكسون مختبرات) عبروا إلى خط YFPH (الشكل 4C). وعلى النقيض من قرار تدهورت بشكل متواضع على مر الزمن (الشكل 4C) بسبب تشكيل لفرط ليفي وصفه سابقا 30. نحن تصويرها بشكل روتيني لمدة 3 ساعة في جلسة واحدة دون وفيات وبقدر ما كل 12 ساعة. مدة الدورة وتردد محدودة بسبب التسامح من الحيوان لتحريض التخدير، يصاحب ذلك مع الاعتبارات الأخلاقية المصاحبة بالألم والضيق للحيوانات المختبر. &lt;<html> ص الطبقة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Figure1. جناح العمليات الجراحية المخصصة يسهل تسليم الغرفة خلال زرع واستقرار الغرفة خلال جلسات التصوير لاحقة. اثنين من الجانب القضبان والصفيحة العلوية (A) يتم تجميعها (ب) باستخدام مسامير صغيرة في غرفة العمود الفقري (C). يسمح جدول الجراحي على مشاركات قابلة للتمديد (D) لتسليم وتحامل من الجانب القضبان إلى فقرات باستخدام دبابيس عقد (E). جلسات التصوير لاحقة بدلا من استخدام الخيوط المشاركات داخليا لنعلق على غرفة عبر مجموعة مسامير على الأجنحة للزرع (F). لقد تم تعديل لوحة (ب) من هذا الرقم من فارار وآخرون، طرق الطبيعة، 2012 30 بإذن من الطبيعة المجموعة النشر.96 / 52196fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> الشكل 2. يتم تنفيذ الثقب الظهرية ويتم زرع في غرفة التصوير المزمنة لتوفير الوصول البصري إلى الحبل الشوكي. ووصف الإجراء في المونتاج. أولا، والجلد (لوحات A، B، أقسام بروتوكول 3،1-3،4) والعضلات (C؛ 3.5) وتراجع لفضح فقرات الأساسية الثلاث. تتم إزالة الأنسجة المغطي هذه الفقرات الثلاث (D، E، F، 3،6 حتي 3،10) والعمليات الجانبية يتم كشط نظيفة قبل أن يتم فرضت أنها على كلا الجانبين (G، H، 3.12). بعناية، والصفيحة الظهرية للفقرة المركزية تتم إزالة وحواف العظام مختومة (I </stronز&gt;. 4. 6). يتم تطبيق الصفيحة العلوية (J؛ 5.1) ومسامير تثبيتها في مكانها (K، 5.3) لتأمين غرفة قبل ختم الغرفة مع المطاط الصناعي السيليكون والزجاج غطاء (L، 5.5). بعد إزالة المسامير تسليم (M، 5.8)، يتم لصقها على الجلد على جانبي الغرفة (M، N، 5.8) ويتم إدراج مجموعة مسامير في أجنحة (O؛ 5.9). وأخيرا، وأغلقت فتحات المسمار مع الاكريليك الأسنان (P؛ 5.10). ويتم وضع الماوس في قفص نظيفة لاسترداد <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> وما زالت هناك غرفة في العمود الفقري المزمنة الشكل 3. اوف شفافة بصريا<html> إيه أسابيع متعددة. صور الضوء الأبيض من الحبل الشوكي، والتي تتراوح بين عدة دقائق (A) إلى ثلاثة أسابيع بعد العمل الجراحي (F). معالم الأوعية الدموية يمكن تمييزها في جميع نقاط الوقت (الأسهم الصفراء). وينظر تغيير يذكر في postsurgery يوم واحد (B). فرط كثيفة ليفي (C - F، يحدها خط متقطع على أسفل اليمين) هو الحاضر في وقت مبكر من ثلاثة أيام والنتائج في التعتيم الجزئي للمنطقة التصوير. اتساع الأوعية الدموية معتدل (D، E، F، النجمة الخضراء) موجود أيضا، ولكن لا تحجب الأوعية الدموية الأصلي في ضوء أبيض أو 2PEF التصوير. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" />الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; الشكل 4. غرفة في العمود الفقري المزمنة تسمح المتكررة التصوير متعدد الفوتون دون الحاجة لتكرار عملية جراحية. التصوير المتكرر من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن YFP في مجموعة فرعية من المحاور DRG (الأخضر) في حبلات الظهري من العمود الفقري الحبل والأوعية الدموية (أحمر) وصفت من قبل داخل الأوعية الدموية حقن صبغة (A، B). ويمكن أيضا أن يتم تعقب نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة (البنفسجي) على مر الزمن في Thy1-YFP / CX3CR1-GFP الفئران المعدلة وراثيا المزدوج (C). في حين محاور والخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال مرئية، وعلى النقيض من قرار انخفاض طفيف مع مرور الوقت (C). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

في هذا الفيديو، ونحن تصف الإجراء لزرع غرفة التصوير الضوئي مزمنة على الحبل الشوكي الظهري على فأرة الحاسوب الحية. تتم مراجعة الغرفة، إجراء العمليات الجراحية، والتصوير المزمن وأظهر.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

a-procedure-for-implanting-spinal-chamber-for-longitudinal-vivo

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

14.1K Views.  Cornell University.  في هذا الفيديو، ونحن تصف الإجراء لزرع غرفة التصوير الضوئي مزمنة على الحبل الشوكي الظهري على فأرة الحاسوب الحية. تتم مراجعة الغرفة، إجراء العمليات الجراحية، والتصوير المزمن وأظهر. 

Video: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

This is a compact visual description of a combination of surgical technique and device for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. While the technique is demonstrated in the animal, the procedure is FDA-approved and currently being used for stem cell transplantation into the spinal cords of patients with ALS. While the FDA has recognized proof-of-principle data on therapeutic efficacy in highly characterized rodent models, the use of large animals is considered critical for validating the combination of a surgical procedure, a device, and the safety of a final therapy for human use. The size, anatomy, and general vulnerability of the spine and spinal cord of the swine are recognized to better model the human. Moreover, the surgical process of exposing and manipulating the spinal cord as well as closing the wound in the pig is virtually indistinguishable from the human. We believe that the healthy pig model represents a critical first step in the study of procedural safety.

Short visual description of the surgical technique and device used for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. The technique is demonstrated in the animal but is entirely translatable and currently being used for human application.

تقنية جراحية لتسليم الحبل الشوكي من العلاجات: مظاهرة الداخلي في Minipigs جوتنجن

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Medicine

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

زرع النخاع الشوكي زجاج نوافذ في الفئران الكبار مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

التجريبية إزالة الميالين وعودة الميالين من الحبل الشوكي الفئران عن طريق حقن البؤري من ليزوليسيتين

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

في الجسم الحي تصوير الأنسجة البيولوجية مع التألق المشترك ثنائي الفوتون والمجهر المجهري المبعثر رامان المحفز

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Bioengineering

In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The purpose of this method is to describe a novel mouse model of spinal implant infection (SII) that was created to provide an inexpensive, rapid, and accurate in vivo tool to test potential therapeutics and treatment strategies for spinal implant infections.
In this method, we present a model of posterior-approach spinal surgery in which a stainless-steel k-wire is transfixed into the L4 spinous process of 12-week old C57BL/6J wild-type mice and inoculated with 1 x 103 CFU of a bioluminescent strain of Staphylococcus aureus Xen36 bacteria. Mice are then longitudinally imaged for bioluminescence in vivo on post-operative days 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28, and 35. Bioluminescence imaging (BLI) signals from a standardized field of view are quantified to measure in vivo bacterial burden.
To quantify bacteria adhering to implants and peri-implant tissue, mice are euthanized and the implant and surrounding soft tissue are harvested. Bacteria are detached from the implant by sonication, cultured overnight and then colony forming units (CFUs) are counted. The results acquired from this method include longitudinal bacterial counts as measured by in vivo S. aureus bioluminescence (mean maximum flux) and CFU counts following euthanasia.
While prior animal models of instrumented spine infection have involved invasive, ex vivo tissue analysis, the mouse model of SII presented in this paper leverages noninvasive, real time in vivo optical imaging of bioluminescent bacteria to replace static tissue study. Applications of the model are broad and may include utilizing alternative bioluminescent bacterial strains, incorporating other types of genetically engineered mice to contemporaneously study host immune response, and evaluating current or investigating new diagnostic and therapeutic modalities such as antibiotics or implant coatings.

The protocol describes a novel in vivo mouse model of spinal implant infection where a stainless-steel k-wire implant is infected with bioluminescent Staphylococcus aureus Xen36. Bacterial burden is monitored longitudinally with bioluminescent imaging and confirmed with colony forming unit counts after euthanasia.

في الجسم الحي نموذج الماوس من عدوى زرع العمود الفقري

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The ...

جراحة الحبل الشوكي وزرع الساق البصرية في القوارض

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the spinal cord remains relatively unexplored. The inherently delicate and mobile spinal cord tissue imposes constraints that make the precise implantation of neural probes challenging. Despite recent advances in neuromodulation devices, particularly flexible bioelectronics, opportunities to expand their use in the spinal cord have been limited by the surgical complexities of device implantation. Here, we provide a series of surgical protocols tailored specifically for the implantation of a custom-made optoelectronic device that interfaces with the spinal cord in rodents. The steps to place and anchor an optical shank on a specific segment of the spinal cord via two different surgical implantation methods are detailed here. These methods are optimized for a diverse range of devices and applications, which may or may not require direct contact with the spinal cord for optical stimulation. To elucidate the methodology, the vertebral anatomy is referenced first to identify prominent landmarks before making a skin incision. The surgical steps to secure an optical shank over the cervical spine in rodents are demonstrated. Procedures are then outlined for securing the optoelectronic device connected to the optical shank in a subcutaneous space away from the spinal cord, minimizing unnecessary direct contact. Behavioral studies comparing animals receiving the implants to those undergoing sham surgeries indicate that the optical shanks did not adversely affect hindlimb or forelimb function seven days post-implantation. The present work broadens the neuromodulation toolkit for use in future studies aimed at investigating various spinal cord interventions.

تسليط الضوء على المؤلف: منهجية مبتكرة لزرع وتأمين المجسات العصبية في الحبل الشوكي للقوارض

This protocol details a surgical procedure for performing spinal cord surgery and for implanting and securing an optical shank over the spinal cord in rodents.

زرع الأجهزة الإلكترونية الضوئية في الحبل الشوكي للقوارض

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video