이 작품은 NIH 보조금 R01 CA107469, R01 CA125577 및 CG KLEER, 미시간의 암 센터 지원 대학에 U01CA154224에 의해 지원되었다.

1. 재료의 준비 및 문화 미디어 <ol><li> 4 ° CO / N.에 (GFR) 리겔 감소 해동 성장 인자 </li><li> 37 ° C.에 필요한 세포주에 대한 완벽한 미디어를 따뜻하게 MCF10A-ATCC는 미디어를 지정; HME-햄 F-12 배지는 5 % 소 태아 혈청, 1 ㎍ / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ㎖의 인슐린, 10 ng의 / ㎖의 표피 성장 인자, 및 100 NG / ㎖ 콜레라 독소로 보충; 5 % FBS, 2 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 5 ㎍ / ml의 인슐린 보충 SUM149 햄의 F-12 미디어; 및 MDA-MB-231-10% FBS-DMEM </li><li> 얼음에 8 잘 챔버 슬라이드를 Precool. </li><li> 조직 문화 후드 및 용품을 준비합니다. </li></ol> 8 잘 회의소 슬라이드 2. 3 차원 문화 <ol><li> 코트 각 GFR 마트 리젤의 40 μL와 8 아니라 슬라이드의 잘. 슬라이드의 중앙에 리겔을 추가 한 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 확산. 거품을 피하고으로 이어질 수있는 overspreading, 가능한 한 균일 확산을 시도메 니스 커스 (meniscus)를 형성. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 슬라이드를 품어. 리겔이 응고하는 동안, 세포를 Trypsinize 수집하고 4 분 동안 조직 문화 원심 분리기 150 XG에 스핀. </li><li> 세포를 계산하고 각각의 세포주의 완전한 미디어에 12,500 세포 / ml로 희석. 2 %에 GFR 마트 리겔을 추가하고 리겔 프리 코트 챔버 슬라이드의 각 웰에 400 μl를 추가합니다. </li><li> CO 2 배양기에서 슬라이드를 품어. 십오일 때까지 매 4 일째 신선한 전체 미디어 변경을 제공합니다. </li><li> GFR 마트 리겔에 세포 성장 동안 억제제의 연구는 3 일마다 억제제 보충 된 신선한 미디어 변화이어서 도금시 완전한 미디어 소분자 억제제를 추가 들어 : 약리학 억제제로 처리. </li><li> 정제 된 단백질과 치료 : <ol><li> 셀 플레이트 다음은 2.1-2.3 단계를 반복합니다. 문화가 혈청 starvati 다음 4 일 동안 성장 할 수 있도록 허용16 시간 동안에. </li><li> 5 일에, FBS는 혈청에 굶주린 세포에 용지를 보충 0.1 %에서 정제 된 단백질의 적절한 농도로 세포를 처리합니다. 이일 후 정제 된 단백질과 신선한 미디어 변화를 준다. </li><li> 10 일째에 완전한 HME 매체와 에어컨 미디어를 교체합니다. 문화가 다른 5 일 동안 성장 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 리겔에 성장 선포 구조의 면역 형광 염색 : <ol><li> 2 % 파라 포름 알데히드, 0.5 % 트리톤 X-100 및 1X PBS, pH 7.4의 100 mM의 글리신을 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민, 0.2 % 트리톤 X-100, 0.05 % 트윈 -20을 함유하는 1X PBS로 구성 면역 버퍼 (버퍼 IF)를 준비한다. </li><li> 주의 깊게 에어컨 미디어를 대기음하는 P200 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 20 분 동안 실온 (RT)에서 2 % 갓 준비 파라 포름 알데히드로 선포 구조를 수정. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 세포를 투과 </li><li> 문화를 씻으의 세 100 mM의 글리신, 각각의 세척을위한 10 ~ 15 분 타임스. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 기본 블록 호출하면 버퍼의 10 % 염소 혈청과 세포를 차단합니다. </li><li> 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (AB &#39;) 30 분 기본 블록 버퍼에있는 조각과 문화를 품다. 이 단계는 매트 리겔에서 면역 마우스 IgG의 종을 차단하는 것이 중요하다. </li><li> 두 번째 차단 솔루션 1 차 항체와 부화 4 ° C에서 (기본 블록 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (ab &#39;) 2 단편) O / N </li><li> 15 분 부드러운 요동과 각 IF 버퍼로 3 회 씻는다. </li><li> 45 분 IF 버퍼에 형광 복합 이차 항체와 부화. </li><li> 10 분 동안 세척 배 부드러운 요동과 IF 버퍼 각. </li><li> 핵을 시각화하기 위해 DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약과 슬라이드를 장착합니다. </li><li> 슬라이드는 실온에서 O / N을 건조하도록 허용합니다. </li><li> 이미지 수집 : 식민지 마일의 공 촛점 이미지 획득리겔의 상단에 성장 세포의 dsection. 자세한 내용은 Z의 적층하여 포상 구조의 전체 길이에 걸쳐 광 부분의 시리즈를 얻기. </li></ol></li></ol> 3. 면역 블롯 2 잘 회의소 슬라이드에서 3 차원 문화 <ol><li> 얼음이 잘 챔버 슬라이드를 Precool. 단계에 따라 2.1-2.4 리겔의 160 μL와 2 - 잘 챔버 슬라이드, 예를 들면 코트 시약을 확장 셀 / 리겔의 1.6 ml의 2 - 웰 슬라이드의 각 웰에 혼합을 추가합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 3D 배양 세포 수확 키트를 사용하여 리겔에서 선포 구조를 수확. </li><li> 배에서 4 ° C.에 precool하는 세포 세척 및 세포 수확 버퍼를 희석 리겔의 세척 및 쫓아 내기 얼음에 수행되어야한다. </li><li> 셀 세척 버퍼를 사용하여 3 배 선포 구조를 씻으십시오. </li><li> 세포 수확 BU를​​ 사용하여 15 ㎖의 원심 분리기 튜브로 선포 세포를 수집ffer 4 ℃에서 로커에 30 분 인큐베이션 1 ㎖ 피펫 잘 현탁액을 섞는다. 이 작은 조각의 리겔을 중단하고 세포 수확 버퍼에있는 세포의 대부분을 해제합니다. </li><li> 문화 원심 분리기 200 XG에서 세포 펠렛. P200 피펫 팁과 펠렛 세포에서 하이드로 겔의 떠있는 레이어를 제거합니다. </li><li> 키트 구비 SDS 샘플 버퍼 용 해물을 재현 탁. RIPA 용해 완충액을 사용할 수도있다. </li></ol> 악성 대 양성 유방 표현형의 4. 정량 <ol><li> 단계 2.1-2.4 다음 각 처리 세트에 대한 삼중의 세포를 성장. </li><li> 5X 또는 슬라이드 시프터 및 컴퓨터에 연결된 위상차 현미경을 이용하여 10 배의 해상도를 각 웰로부터 포상 구조의 위상차 이미지를 가라. 한 프레임에서 다른 프레임으로 슬라이드를 이동하고, 따라서 챔버 슬라이드의 전체를 잘 커버하여 이미지를 가져 가라. </li><li> 포상 구조의 전체 개수를 세어한 라운드 플랫 선포 세포와 multiacinar 구조 나 조직을 부족 우연히 성장 구조의 수와 그것에서 나오는 분기 프로세스와 수. </li><li> 한 라운드 플랫 선포 구조에 대 악성 구조의 비율 및 열 그래프로 플롯을 계산합니다. 학생의 T-테스트에서 중요성을 계산합니다. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 여기에서 재구성 기저막에 유방 상피 세포의 세 가지 차원의 문화와 악성 대 양성 유방 표현형을 구별하는이 시스템의 유용성을 설명했다. 이 시스템은 또한 다른 선의 조직 배양에서 다른 세포 유형에 이용 될 수 있고, 성공적으로 12-14 몇 가지 이름을 배양 전립선 상피 기관지 상피 및 갑상선 상피 세포에 사용 된 것으로보고되었다. 3D 배양의 중요성은 생리 학적으로 관?...

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 (3D)는 복잡한 표현형 정상 유방과 유방암 2,3의 관련 신호를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 유방의 기능 단위는 꽈리에있는 나뭇 가지의 작은 관으로 구성 터미널 덕트 소엽 단위 (TDLU)입니다. 선포 세포는 기저막 (5)에 의해 둘러싸여있다 두 세포층, 상피 및 근 상피 세포로 구성된 매우 조직 구조이다. 일반 선포 세포의 가장 두드러진 특징은 휴대 편광, 기본 기저막에 부착 전문 세포 - 세포 연락처입니다. 이 복잡​​한 조직은 침략 암에 중단됩니다. 세포는 단층으로 재배되는 널리 사용되는 2 차원의 문화, 선포 세포의 형성을 허용하지 않습니다. 따라서, 단층 배양 상피 세포 간의 복잡한 관계를 캡처하는 시스템을 제공 부족정상 유방과 유방암에서의 규제 완화. 유방 세포의 기능 monotypic 상피 문화는 여러 실험실 2,3에서 개발되었다. 3D 배양 Engelbreth-홀름 - 스웜 마우스 육종 세포 유래 가용화 엑기스이며 시판되고 리겔에 유방암 세포의 성장을 포함한다. 콜라겐 같은 다른 3D 하층은 I도 사용된다. 유방 세포는 세포가 매트 리겔이에 매립 배양 3D 임베디드 분석법에 의해 3 차원으로 배양 할 수있다. 또한, 세포는 또한 리겔의 적은 양을 필요로하고, 위상 콘트라스트 이미지에 의해 콜로니 형성의 시간 경과 감시를 용이하게하고 현장 영상 2에 이상적입니다로 비용 효과적인 3D 오버레이 분석,라고, 최고 분석에 3D로 배양 될 수있다 -3. 베스트 분석에 3D는 선포 표현형 및 유전자 발현 프로파일 (7) 사이의 상호 관계를 정의하는 데 사용되었다. 3D 문화 effectiv 할 수 있습니다엘리 침윤 암에서 정상과 양성 세포를 구별하는 데 사용됩니다. 정상 및 양성 유방 세포가 침윤 암 세포가 루멘없이 청소와 다산과 우연히 성장하는 반면 성장이 리겔의 중심에있는 잘 정의 된 루멘 편파 구조를 체포 형성한다. E6/E7은 인간의 유방 상피 세포와 섬유 낭종 성 변화와 36 세 환자에서 분리 된 자발적 불후의 세포주가 성공적으로 3D 3.8에 양성 유방 표현형을 탈환하는 데 사용되었습니다 및 지낸입니다 MCF10A 세포주를, 불후의 여러 분자 8,9의 종양 및 종양 억제 기능을 연구하기위한 모델 시스템. 이러한 양성 세포는 렌티 바이러스 / 레트로 바이러스의 도입으로 그 유전자 (들)을 조작 할 수 있도록 설계 할 수있다. 관심의 유전자 (들)은 종양 억제 경우 그 유전자가 양성 세포의 발암 유전자 과발현 경우, shRNA를 매개 최저는 반면 악성 변화로 이어질 것악성 표현형을 표시해야합니다. 두 경우 모두 3D로 형성된 선포 구조는 악성 변화를 캡처 할 수 있습니다. 3D로 도금 양성 단일 세포는 구형 구조를 증식 원형 형성하기 시작합니다. 일 5-8 셀이 구형 집합체 마트 리겔과 접촉하는 세포의 주변 편광 층 및 마트 리겔과 접촉이없는 적은 편광 세포의 내측 질량으로 분화한다. 다음 10-15 일에서 내부 세포 사멸이 명확한 루멘을 형성하여 죽기 시작합니다. 악성 세포는 우연히 자신의 극성을 잃고 성장할 것입니다. 고도의 악성 세포는 일반적으로 구조를 분기 형성한다. 표현형의 이러한 차이는 시간 경과 위상 콘트라스트 이미지에 의해 현장에서 관련 분자 마커로 면역 염색에 의해 캡처 할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 마커는 증식 마커 포스 포 히스톤 3 apoptot와 ​​조합하여, 알파 -6 - 인테그린, 기저 극성 마커 아르IC 마커는 카스파 제 3을 절단. 후자 꽈리의 중심 정상적인 양성 유방 세포의 기능에 루멘을 형성가 있는지를 결정하는 것이 중요하다. 다른 극성과 세포 - 세포 접촉 마커 GM130, 라미닌, ERM, E-cadherin의 (가) 있습니다. 교대 유방암 세포주 관심 유전자를 조작하기 위하여 설계 될 수있다. 체포 더 성장이 경우 복귀 양성 표현형으로 사용할 수 암 표현형을 구별 할 독출. 3D 문화는 신중 악성 변형 10-11에 관련된 신호 전달 경로를 묘사하는 데 사용할 수 있습니다. 사용하여 위의 읽기 아웃, 약물 억제제, 차단 항체 나 재조합 단백질을 언급하는 것은 악성 변화를 선도하는 분자 신호에 정확하게 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 지속적인 노력으로는 RNA를 분리하고 또한 면역 블롯 및 면역에 해물을 준비하는 차원에서 세포를 추출 할 수noprecipitation. 이러한 전략은 프로토콜 단계적 상세한 방법에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>Avoid repeat freeze thaw&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402</td><td>Precool on ice&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek glass chamber slides 2-well&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td>Precool on ice&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Goat anti mouse F(ab&amp;acute;)&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;fragment</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Please look at molecular probes website</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>3D Culture Cell Harvesting kit</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Apha-6-integrin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MAB1378</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610822</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-222</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td><td>Cell Signaling</td><td>9661s</td><td>1:50 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>1:200 dilution for IF</td></tr></tbody></table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

침윤성 암은 전이에 인접 조직과 성향의 침입을 특징으로 악성 상피 종양의 그룹입니다. 암세포 및 그들의 미시 사이에서 신호의 상호 작용은 유방암의 성장 및 생물학적 행동 하나에 강력한 영향을 미친다. 그러나, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서이 신호의 대부분은 손실되거나 세포가 단층으로 두 가지 차원의 문화 (2D)에서 재배 할 때의 관련성은 understudied 아르됩니다. 최근, 재구성 기저막의 입체 (3D) 문화는 양성 및 악성 유방 세포의 조직 구조를 다시 요약 선택의 방법으로 떠오르고있다. 3D에서 자란 세포는 세포 외 기질에서 중요한 단서를 유지하고 생리학 관련 생체 시스템 2,3을 제공합니다. 참고로, 제 4에 비해 3D로 성장하면 세포가 다르게 행동 것을 제안 성장하는 증거가있다. 3D 문화효과적으로 3 개인 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별하는 수단으로하고 세포 및 분자 시그널링을 뒷받침 위해 사용될 수있다. 양성 상피 세포의 구별되는 특징 중 하나는 꼭대기 세포질은 루멘으로하고 기초 세포질이 기저막에 달려있다 그래서 그들은 편광되는 것입니다. 이 apico - 기초 극성은 세포의 해체와 우연히 주변의 기질에 침투 세관을 anastomosing 및 분기의 형성을 특징으로 침윤성 암에 손실됩니다. 양성 선 및 침윤 암 사이의 이러한 조직 병리학 적 차이는 3D 6,7에서 재현 할 수 있습니다. 다른 분자 및 세포 생물학 기술, 3 차원의 cultur와 함께 세포 증식, 극성 및 세포 사멸에 대한 검증 분자 마커의 발현을 차등 한 라운드 선포 구조의 정량과 같은 적절한 읽기 아웃을하거나 사용전자 나은 악성 변환시와 책임 신호를 서술의 세포 변화를 이해하는 중요한 도구를 제공 할 수 있습니다.

3D 배양 효과적으로 양성 유방에서 인간 유방 상피 세포의 악성 표현형을 구별 할 수있다. 리겔에 도금 단일 양성 세포는 쉽게 위상 콘트라스트 이미지를 사용하여 하나의 평면에 하나의 둥근 플랫 선포 세포로 이미지화 할 수있는 조직 구형 구조로 성장한다. 마트 리겔에 도금 한 악성 세포가 우연히 성장 매우 높은 굴절률을 표시 한 평면에서 이미지 어렵다. 도 1에 도시 된 바와 같?...

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Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

19.8K 조회수.  University of Michigan Comprehensive Cancer Center.  재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다. 

비디오: Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

연구

암 연구학

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

의학

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been provided by studies using these models. Cell lines have provided an understanding of the deregulation of molecular signaling associated with breast tumorigenesis, while rodent models are widely used to study cellular and molecular characteristics of breast cancer in vivo. The establishment of 3D cultures of breast epithelial and cancerous cells aids in bridging the gap between in vivo and in vitro models by mimicking the in vivo conditions in vitro. This model can be used to understand the deregulation of complex molecular signaling events and the cellular characteristics during breast carcinogenesis. Here, a 3D culture system is modified to study a phospholipid mediator-induced (Platelet Activating Factor, PAF) transformation. Immunomodulators and other secreted molecules play a major role in tumor initiation and progression in the breast. In the present study, 3D acinar cultures of breast epithelial cells are exposed to PAF exhibited transformation characteristics such as loss of polarity and altered cellular characteristics. This 3D culture system will assist in shedding light on genetic and/or epigenetic perturbations induced by various small molecule entities in the tumor microenvironment. Additionally, this system will also provide a platform for the identification of novel as well as known genes that may be involved in the process of transformation.

The present protocol describes the setting up of 3D 'on top' cultures of a non-transformed breast epithelial cell line, MCF10A, that has been modified to study Platelet Activating Factor (PAF) induced transformation. Immuno-fluorescence has been used to assess the transformation and is discussed in detail.

인지질 매개체는 3차원 배양에서 형질전환을 유도했습니다.

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

생체공학

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

발생학

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...