자사의 변형된 3D 분석 배양은 암 미세 환경에서 다양한 구성 요소의 역할을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 이는 새로운 바이오마커 및 약물 표적의 식별로 이어집니다. 이 방법을 사용하면 면역 체계와 매우 유사한 세포 표현형 및 분자 신호 전달의 변화를 연구 할 수 있습니다. 또한 연구의 특정 요구 사항을 충족하도록 수정할 수도 있습니다.
이 방법은 유방암의 조기 발견을 도울 수있는 새로운 바이오 마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 분자 통찰력을 활용하여 새로운 약물 표적을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 또는 유전자가 수행하는 역할에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 유전자 또는 유전자의 섭동 후 종양 형성 및 형태 형성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
시작하려면 배지를 흡인하고 2 밀리리터의 PBS로 세척하여 세포를 트립신 화하십시오. 900 마이크로 리터의 0.05 % 트립신 -EDTA를 추가하고 섭씨 37도에서 약 15 분 동안 또는 세포가 완전히 트립신 화 될 때까지 배양합니다. 각 웰을 60 마이크로리터의 lrECM으로 코팅하여 챔버 커버 유리 슬라이드의 8개 웰에 lrECM 베드를 준비한다.
섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 최대 15분 동안 두십시오. 세포 현탁액을 준비하려면 5ml의 재 현탁 배지를 추가하여 트립신 활성을 소멸시키고 섭씨 25도에서 10 분 동안 112 회 g으로 세포를 회전시킵니다. 사용한 배지를 흡인하고 2 밀리리터의 분석 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.
단일 세포 현탁액의 형성을 보장하기 위해 현탁액을 잘 혼합하십시오. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 각 웰에 6, 000 개의 세포를 파종하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하십시오. 필요한 웰의 수에 따라, 세포 현탁액을 오버레이 배지에서 희석한다.
준비된 lrECM 베드에 400마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 추가하여 lrECM 베드를 방해하지 않도록 조심스럽게 확인합니다. 가습 된 37 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 5도에서 배양하십시오. 3시간 후, 200 나노몰의 PAF를 각각의 웰에 첨가한다.
모든 배지 교체 중에 동일한 농도의 PAF를 추가하고 4일마다 새로운 배지로 세포를 보충합니다. 배양 20일 후, 각 웰에서 배지를 조심스럽게 피펫팅하고 400마이크로리터의 예열된 PBS로 웰을 세척합니다. 새로 준비된 4 % 파라 포름 알데히드 400 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 20 분 동안 배양하여 acinar 구조를 고정하십시오.
얼음처럼 차가운 PBS로 웰을 한 번 헹구고 섭씨 4도에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100을 함유 한 PBS로 투과시킵니다. 10분 후 Triton X-100 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 새로 준비한 PBS 글리신 400마이크로리터로 헹굽니다. 면역 형광 완충액에 10 % 염소 혈청을 포함하는 400 마이크로 리터의 1 차 차단 용액을 추가하고 실온에서 60 분 동안 배양합니다.
1차 블로킹 용액을 제거하고 1차 블로킹 용액에서 준비한 2% 2차 블로킹 항체 200마이크로리터를 넣고 실온에서 45-60분 동안 방치합니다. 1차 항체를 1:100 희석액의 2%2차 차단 항체 용액에 준비합니다. 2차 블로킹 용액을 제거하고 새로 준비한 항체를 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
1차 항체 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 400마이크로리터의 면역형광 완충액으로 세 번 세척합니다. 다음으로, 형광단이 접합된 2차 항체를 1차 블로킹 용액에 1:200으로 희석하여 준비하고, 슬라이드를 2차 항체 용액에서 실온에서 40 내지 60분 동안 배양한다. 슬라이드를 400 마이크로리터의 면역형광 완충액으로 20분 동안 헹구고, 이어서 PBS로 각각 10분 동안 2회 세척한다.
핵 염색 밀리리터당 0.5 나노그램을 함유하는 PBS로 핵을 실온에서 5 내지 6분 동안 대조염색한다. 슬라이드를 400마이크로리터의 PBS로 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다. 전체 PBS를 조심스럽게 피펫팅하고 잔류 용액을 제거하십시오.
그런 다음 각 웰에 장착 시약 한 방울을 넣고 실온에서 밤새 방치합니다. 마지막으로 컨포칼 현미경에서 40x 또는 63x 배율로 슬라이드를 이미지화하여 0.6mm 스텝 크기의 광학 Z 섹션을 촬영합니다. 이미지는 핵 염색으로 염색 된 acini의 세포핵을 나타냅니다.
acini의 3D 구성과 20일 동안 lrECM에서 성장한 MCF10A acini의 위상차 이미지가 여기에 표시됩니다. 가장 중앙 섹션은 중공 루멘의 존재를 보여줍니다. PAF는 극성을 방해하고 MCF10A 유방 아시니에서 EMT와 유사한 변화를 유도합니다.
MCF10A 세포는 lrECM에서 탑배양물 상에서 3D로서 성장시켰다. 배양물을 0, 4, 8, 12, 및 16일에 PAF로 처리하였다. 배양물을 20일 동안 유지한 다음, 알파6-인테그린 및 핵 염색, 정점 극성에 대한 마커인 GM130 및 EMT 마커인 비멘틴에 대해 면역염색하였다.
각 acini의 가장 중앙 스택이 여기에 표시되었습니다. 대표적인 데이터는 생물학적으로 독립적 인 3 가지 실험에서 40-50 acini에 대한 것입니다. lrECM 베드는 기포 없이 고르게 퍼지도록 조심스럽게 만들어야 합니다.
또한 세포 현탁액을 고르게 혼합하고 응집을 피하기 위해 천천히 첨가해야 합니다. 3D 배양에서 단백질과 RNA를 얻은 다음 다양한 분자 경로를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
