우리의 방법은 연구원이 조직 형태 및 기능에 그들의 개별 혈통 기여의 조사를 위해 다른 세포 모형을 격리하고 조작하는 것을 허용하기 때문에 중요합니다. 이 기술은 세포 유형을 분리하기위한 부드럽고 효율적인 방법이며, 그 결과 세포의 무결성은 3D 배양을 위해 보존됩니다. 이 기술은 또한 잘 특징적인 바이오 마커가 없는 세포를 격리하기 위하여 그밖 시스템에 적용될 수 있습니다.
10주에서 14주 된 암컷 마우스에서 2번, 3번, 4번, 5마리의 유방땀샘을 수확하기 위해 먼저 두 뒷다리 사이의 중간선에서 1센티미터 절개를 합니다. 잘라낸 것을 목까지 확장하고 중간선 절개에서 팔다리쪽으로 작은 측면 컷을 만듭니다. 그런 다음 동물의 양쪽에 핀으로 고정하기 전에 가르친 피부를 스트레칭합니다.
집게를 사용하여 4번 땀샘에서 림프절을 수집합니다. 유방 땀샘을 제거하려면 날카로운 가위를 사용하여 조직의 각 영역 하에서 절단하여 50 밀리리터의 DMEM-F12를 수확할 때 5%의 FBS와 항생제 항mycotic으로 보충합니다. 모든 조직이 수집되면, 조각이 모든 조직이 균등하게 다진 되도록 필요에 따라 접시를 회전 1 밀리리터 파이펫 팁을 통해 쉽게 맞을 수 있을 때까지 땀샘을 잘라.
그런 다음 3 밀리리터의 소화 매체에 조각을 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 14시간 동안 6웰 저접착 접시의 단일 웰로 옮킨다. 다음 아침, 조직을 1밀리리터 마이크로파이프로 10번 부드럽게 피펫하고 조직 조각을 15밀리리터 튜브로 옮킨다. 원심분리에 의해 조직을 수집하고 신선한 DPBS의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.
미리 젖은 70 마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 통해 서스펜션을 걸러내고, 세척당 섭씨 37도의 10 밀리리터로 스트레이너에 튜브를 4번 헹구십시오. 조직 조각을 풀어, 장갑 손가락으로 여조 탭을 잡고 60 밀리미터 조직 문화 접시를 통해 여과기를 반전. 스트레이너의 바닥을 통해 유지 보수 매체의 4 밀리리터 알리쿼트를 전달하고 신속하게 단일 세포에 대한 접시를 검사, 지방 방울, 그리고 반전 현미경에서 조직을 오염.
그런 다음 조직 파편이 접시를 부착하고 이중 층 조각을 생성 할 수 있도록 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 발광 상피 세포에서 심근 세포를 분리하려면, 세포에 신선한 0.5 %의 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가하기 전에 DPBS의 1 밀리리터로 접시를 헹구십시오. 반전된 현미경으로 소화를 주의 깊게 모니터링합니다.
근피성 세포의 외부 층은 3~6분 이내에 분리되기 시작합니다. 근피성 세포가 분리되면, 상체세포를 DPBS에서 10%의 FBS 2밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 상수체를 옮기. 발광 상피 세포를 방해하지 않고, 나머지 세포에 트립신-EDTA의 신선한 밀리리터를 추가하기 전에 DPBS의 두 밀리리터로 접시를 부드럽게 헹구십시오.
7-15 분 후, PBS에서 10 %의 FBS의 두 밀리리터와 효소 반응을 담금질하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 세포를 전송합니다. 차동 트립시화 중에 세포를 면밀히 모니터링하고 세포를 과도하게 소화하지 않는 것이 중요합니다. 두 분획이 모두 수집되면, 세포를 원심분리하여 잔류 해리약을 제거하고 튜브당 유지 보수 배지의 250 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다.
계산 후, 각 세포 집단을 신선한 유지 보수 배지에서 웰 농도당 4개의 세포로 1.2배 10배 희석한다. 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 페놀 레드없이 DMEM-F12에 50 % 세포 외 매트릭스의 90 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 우물이 코팅되면 세포 배양 인큐베이터의 기본 층을 30 분 동안 고화시하십시오.
이 중합화 동안, 원심분리에 의해 세포 분획을 수집하고 잘 당 90% 성장 배지에서 10%의 세포외 매트릭스의 100 마이크로리터에서 각 인구를 재중단한다. 다음으로, 각 셀 현탁액의 100 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 공동 배양이 세포 배양 인큐베이터에서 20 분 동안 정착 할 수 있도록합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 챔버 벽의 측면 아래로 성장 배지의 100 마이크로 리터를 신중하게 추가하고 세포 배양 인큐베이터로 슬라이드를 반환합니다.
24시간마다 세포를 이미지하여 성장을 추적하고 2~3일마다 성장 배지를 부드럽게 갱신합니다. 면역 스테인링을 위한 오르가노이드를 고치려면 적절한 실험 시점에서 각 슬라이드에서 매질을 조심스럽게 흡면하여 각 슬라이드에서 매질을 이미지화하고 잘 200 마이크로리터의 DPBS로 잘 헹구십시오. 실온에서 10분간 섭씨 4도의 200마이크로리터로 오르가노이드를 고정한 후 실온에서 30분 동안 DPBS당 0.2%의 글리신 200마이크로리터로 오가노이드를 치료합니다.
인큐베이션의 끝에서, 실온에서 10분 동안 DPBS에서 0.25%트리톤 X-100으로 오르가노이드를 투약한 다음, 5%당나귀 혈청또는 DPBS의 이차 항체종과 일치하는 적절한 혈청을 5%로 차단한다. 그런 다음 DPBS에서 하룻밤 사이에 1%당나귀 혈청에 관심 있는 125-200 마이크로리터로 세포를 4°C에서 흔들기로 라벨을 붙입니다. 다음 날 아침, DPBS 플러스 트리톤 X-100의 200 마이크로리터와 함께 각각 두 번 씻은 후, 오르가노이드를 적절한 형광으로 표시하기 전에 실온에서 45분 동안 이차 항체를 빛으로부터 보호합니다.
그런 다음 신선한 DPBS 플러스 트리톤 X-100으로 각각 두 번 씻고 표준 프로토콜에 따라 형광 현미경으로 오르가노이드를 이미지화합니다. 24시간 의 배양 후, 정제된 상피 파편은 발광 상피 세포의 내부 층을 둘러싸고 있는 심근세포의 외부 층으로 평평한 팬케이크와 같은 구조를 형성하는 배양 접시의 바닥에 부착되었다. 트립신 치료는 근상체 세포가 먼저 분리되고 남아있는 입체 발광 상피 세포의 코어를 둘러싸고 밝은 둥근 세포로 나타나는 세포를 분화시합니다.
두 세포 구획의 전반적인 순도는 두 집단 내에서 케라틴-14 및 E-cadherin 발현에 의해 평가된 약 90%이다. 입증된 바와 같이 50% 세포외 매트릭스 베이스에서 10%의 세포외 매트릭스에서 10일간의 배양 후, 근피피발상피 세포 오르가노이드는 잘 발달된 루멘을 가진 큰 분기 구조를 형성하였다. 폐포 발생 배지에 첨가된 5일째에 분화하면 더 크고 분지된 우유 함유 오르가노이드의 형성을 유도한다.
기질 오염 물질이 없는지 확인하기 위해 상피를 수집할 때 스트레이너를 조심스럽게 씻는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 유전자 발현의 변화를 쿼리하기 위해 연구자들은 복구 용액을 사용하여 세포외 매트릭스에서 RNA를 방출하여 유기체로부터 RNA를 수집할 수 있습니다. Paraformaldehyde는 위험한 것으로 간주되며 연구원은 개인 보호 장비를 사용하고이 시약을 사용할 때 연기 후드 내부에서 작동해야합니다.
