크리스텐슨 등과 비교하여 별표 (*)는 신규 또는 수정 된 단계를 나타냅니다. 1 1. 재질 설정 <ol><li> 세포 배양 과정은 임신하는 인원수로부터 격리 계란 대량을 요구한다. C. 성장한다 계란의 대량 분리하는 박테리아 - 엘레 8P 한천 플레이트에 NA22 (CGC C. elegans의 유전 컨소시엄을 통해 사용 가능)과 시드. 이 판에 사용 펩톤의 양은 일반적으로 NGM 플레이트에 사용되는 8 배의 양입니다. 높은 펩톤 농도 OP50가-두꺼운 층 성장에 반대되는,보다 효율적 NA22 박테리아의 성장을 유지한다. </li></ol> 8P 접시 조리법 : 3g 염화나트륨, 20g 박토 - 펩톤, 30 분간 멸균 및 오토 클레이브의 1 L에 25g의 한천을 녹인다. 55 ° C에서 매체의 열이 식도록 한 후 1 ㎖ 1 MgCl2를 콜레스테롤의 멸균 여과 1 ㎖ (EtOH를 5 ㎎ / ㎖)을 추가,, 망초 1 ㎖ 및 KP 버퍼 (500 ㎖의 재고 : 5g의 K 2 HPO 4, 30g의 KH 2 PO 4, 산도 6.00) 25 ㎖. 10cm 배양 접시 (25 ㎖ / 플레이트)에 액체 한천 배지를 붓는다. <ol start="2"><li> 다음날 NA22 E. 1 ㎖로 농축 각 펩톤 한천 판의 표면 전체에 확산 2XYT 미디어 (16g 트립 톤, 10g의 효모 추출물, 멸균, 산도 7.0의 1 L에 5g의 NaCl) 37 ° C에서의 대장균 밤새 배양 이러한 박테리아는 임신하는 인원수 다량의 성장을지지하는 두꺼운 층을 형성 할 것이다 풍부한 음식 소스를 구성한다. 박테리아의 성장을 할 수 있도록 실온에서 하룻밤 시드 판을 둡니다. 이 과정은 4 ~ 5 시간 동안 37 ° C에서 배양에 의해 가속 될 수있다. </li><li> 시드 8P 접시에 굶주린 동물을 전송합니다. 5-6 M9 버퍼 또는 ㎖의 물을 사용하여 굶주린 NGM 플레이트를 동물을 씻어 각 8P 판에 현탁액의 1-2 ML을 추가합니다. </li><li> 동물의 성장과 증식이 UNT 허용일리노이 플레이트를 임신하는 성인에 의해 합류에 채워집니다. </li><li> C.의 제조에 필요한 달걀을 분리 용해 액의 5-6 ML을 사용하여 임신하는 성인의 배아 세포를, 엘레. </li></ol> 용해 액 레시피 신선한 표백제의 5 ㎖, 10 N NaOH를 1.25 ㎖의 멸균 H 2 O의 18.5 ML 이 혼합물을 사용하기 전에 매번 신선한 준비해야합니다. <ol start="6"><li> 계란 버퍼를 사용하여 임신하는 성인으로부터 격리 계란을 세척 : </li></ol> 계란 버퍼 레시피 118 밀리미터의 NaCl, 48 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘, 2 mM의 MgCl2를, 25 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 삼투압이 340 mOsm. <ol start="7"><li> 키틴으로 처리하여 계란을 둘러싼 껍질을 제거합니다. 키티 나제는 산성 pH 25에서 가장 높은 활성을 가진 효소이다. 2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 달걀 버퍼 pH를 6.5로 키티 나제 (시그마, 카탈로그 없음. C6137)을 녹인다. 키티 나제 주식을 저장멸균 15 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖ 분량 씩 -20 ° C에서 솔루션을 제공합니다. 분취 량은 몇 개월 -20 ° C의 최대 저장할 수 있습니다. </li><li> C. 성장한다 땅콩 렉틴으로 덮여 멸균 커버 슬립 (12mm 직경)에 elegans의 배양 세포. 멸균 (0.5 ㎎ / ㎖)에 땅콩 렉틴을 녹입니다. 땅콩 렉틴 용액을 여과 또는 멸균 할 수 없습니다. 또한 UV 광으로 처리 될 필요가 없다. 최대 6 개월 -20 ° C에서 보관 2 ㎖ 씩 분주. </li><li> 완전한 세포 배양 배지 (500 ml)을 깁코, 50 ㎖ 태아 혈청 (열 불 활성화), 19.5 g의 수 크로스 (45 mOsm), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg 5 ㎖ /부터 500 ㎖ L-15 배지가 포함 ml의 스트렙토 마이신 (2 %). 완전 배지는 다음 0.20 μm의 기공 필터를 사용하여 필터링된다. </li></ol> 계란 버퍼와 배지를 각각 340의 삼투압이 345 mOsm을 가지고 있습니다. 실제로, 포유 동물 세포에 반대, C. 엘레 세포는 비교적 높은 삼투압을 가지고즉, 세포의 세포막과 직접 접촉 할 수있는 솔루션을 준비 할 때 카운트 고려 될 필요가있다. 이러한 시약의 조리법 osmometer 하나를 사용하여 측정 하였다 원하는 삼투압에 도달하도록 조절 하였다. 이들 레시피를 정확히 따르는 손질 이들 시약의 제조에 사용되는 경우 osmometer를 사용할 필요가 없다. 다른 솔루션은 그 조리법 여기에보고되지 않습니다 또는 C를 사용하는 게시의 경우에, 준비해야하는 경우, 하나는 osmoter를 사용한다 배양 된 세포 엘레 간스. 2. 계란 격리 <ol><li> 그것은 (24 - 웰 플레이트에서) 배양 된 세포의 12 우물에 충분한 계란을 수집하기 위해 적어도 네 8P 플레이트로 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 절차를 시작하기 전에 땅콩 렉틴 원액 한 튜브를 해동. 24 웰 플레이트의 우물의 바닥에 멸균 커버 슬립을 놓고 커버 슬립에 땅콩 렉틴의 200 μl를 추가합니다. 1 시간 또는 u 품다그리로 갈때 세포는 도금 될 준비가 된 것입니다. 완전히 땅콩 렉틴을 제거하고 멸균 멸균 물 1 ㎖로 한 우물을 씻어. 커버 슬립의 땅콩 렉틴의 완전한 제거는 세포의 응집을 방지하는 데 필수적이다. </li><li> 멸균 멸균 물을 사용하여 한천 플레이트 떨어져 임신하는 성인을 씻으십시오. 두 멸균 원뿔 50 ML 튜브로 현탁액을 수집합니다. 튜브 (*)의 하단에있는 벌레의 강수량을 할 수 있도록 최대 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 전송 플라스틱 피펫으로 물을 제거하고 신선한 멸균 멸균 물을 교체합니다. 200 XG 10 분 (~ 1,200 RPM) (*)에서 테이블 탑 원심 분리하여 웜 펠렛. 적어도 3이 마지막 단계를 반복합니다. </li><li> 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 웜을 전송하고 200 XG에 10 분 동안 (~ 1,200 RPM) (*)에 그들을 펠렛. 뿐만 아니라 튜브의 하단에있는 박테리아를 수집하지 않도록하기 위해 더 높은 원심 분리 속도를 사용하지 마십시오. 때로는 centrifugations 후 벌레가 완전히 펠렛되지 않습니다. AF터 각 세척 및 제거하기 전에 상층 액을 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓습니다. 식힌 물 웜 튜브 바닥에 침전. </li><li> 물을 제거하고 용해 액의 5 ~ 6 mL를 넣고 (재료가 설정 참조). 5 ~ 10 분 동안 부드럽게 정지 록하고 매 2-3 분 실체 현미경을 이용하여 웜 용해 모니터링을 시작합니다. 현탁액의 방울은 쉽게 검사 용 커버 슬립 상에 배치 될 수있다. 배양 시간은 표백제의 신선도에 따라 달라집니다, 표백제의 작은 병을 구입하고 매월 새로운 병을 엽니 다. </li><li> ~ 웜 70 ~ 80 %의 (배양 시작부터 10 분)를 용해하는 경우, (재료가 설정 참조) 계란 버퍼 산도 7.3의 9 ML을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 10 분 동안 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 현탁액을 원심 분리기. 계란 (*)의 재 오염을 방지하기 위해 벤치에 분젠 버너를 가지고이 시점에서. </li><li> 조심스럽게 멸균 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 제거하고 펠렛 3-4 씻어용액을 명확 X 달걀 완충액까지. 각 세척하는 동안 알 버퍼에 펠릿 잘 혼합해야합니다. </li><li> 계란 30 % 수크로오스 용액을 사용하여 동물 사체로부터 분리된다. 살균 계란 버퍼의 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁 2 ML 60 % 자당 용액 (살균 계란 버퍼의 주식을)를 추가합니다. 잘 섞어 200 XG (~ 1,200 RPM) (*)에서 20 분 동안 원심 분리. </li><li> 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 계란은 솔루션의 상단에 떠있다. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용, 신선한 멸균 15의 ML 원뿔 튜브에 모든 달걀을 전송합니다. </li><li> 10 분 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 튜브와 원심 분리기에 살균 계란 버퍼 10 ML을 추가합니다. 세척 3 X를 반복합니다. 계란이 완전히 각 세척하는 동안 알 완충액되어 있는지 확인하십시오. </li></ol> 3. 배아 세포 해리 층류 후드를 사용하여 멸균 조건 하에서 과정의 다음 단계를 실시한다. 동물은 있지만모든 박테리아하지 않을 경우 대부분 제거해야 세균 플레이트, 세척 및 표백제가 포함 된 용해 용액으로 처리에 가운. 따라서 과정의이 시점에서 층류 후드를 사용하는 달걀 현탁액의 새로운 오염을 방지한다. <ol><li> 2 ㎎ / ㎖ 키티 나제 (계란 버퍼의 pH 6.5 (*) 재고) 1 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 새로운 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 실온에서 10-30 분 동안 튜브를 흔들어. 정확한 배양 시간은 효소와 실내 온도의 신선도에 따라 변화하고, 따라서 각각의 제조에 대해 결정되어야한다. 그것은 배양 10 분 후 반전 된 세포 배양 현미경으로 계란을 모니터링을 시작하는 것이 좋습니다. 참고 : 우리의 경험에서, 낮은 pH는 키티 나제 효소의 활동을 증가시킨다. 이러한 이유로 우리는 키티 나제 (pH를 수산화 나트륨을 사용하여 6.5로 조정 위에서보고 레시피를) 용해 pH가 6.5에 달걀 버퍼를 사용합니다. </li><li> ~ 달걀 껍질의 80 %가 소화 될 때키티 나제 치료 (그림 1 AB)는 900 XG 3 분 (~ 2,500 RPM) (*)에서 원심 분리하여 계란 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거하고 L-15 배지 3 ㎖ (*)를 추가합니다. </li><li> 6cm 직경 플레이트에 달걀을 전송하고 부드럽게 18 G 바늘을 구비 한 10 ㎖ 멸균 주사기를 사용하여 세포를 해리. 신선한 플라스틱 페트리 접시에 현탁액 드롭을 배치하고 현미경으로 보면 해리도를 모니터한다. 손상 세포를 방지하기 위해이 절차를 수행하는 동안 주사기로 공기를 흡인하지 마십시오. 세포의 80 %가 분해됩니다 ~까지 해리를 계속합니다. </li><li> 살균 5 μm의 밀리 포아 필터를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 세포 현탁액은 세포 덩어리, 소화되지 않은 계란과 부화 유충을 제거하기 위해 필터링해야합니다. 모든 세포를 복구하기 위해 필터를 통해 신선한 L-15 미디어의 추가 4 ~ 5 ㎖의 필터. DA을 방지하기 위해 여과 단계에서 과도한 힘을 사용하지 마십시오필터 및 / 또는 세포를 maging. </li></ol> 4. 세포를 배양 <ol><li> 3 분 (*) 900 XG (~ 2,500 RPM)에서 원심 분리하여 해리 세포 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여주의 깊게 뜨는을 제거합니다. 전체 L-15 중간 플레이트 1 ML / 잘 펠렛 세포를 Resuspend. 첨가 매체의 사용량은 8P 플레이트의 개수, 접시에 웜의 합류 및 셀에 대해 수행 될 실험의 유형에 따라 달라진다. 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 측정 할 수있다. ~ 230,000 셀 / ㎠가 최적의 밀도를 도금 패치 클램프 녹음하십시오. </li><li> 배양액의 증발을 방지하기 위해 젖은 종이 타월을 함유 플라스틱 섬유 복합 재질 용기에서 24 웰 플레이트를 유지한다. 20 ° C와 주위 공기에 가습 인큐베이터에서 컨테이너를 저장합니다. </li><li> 세포는 보통 24 시간 이내에 실험을위한 준비가되었을 때 형태 학적 분화와 표현GFP 마커의 이온이 완료됩니다. 세포는 최대 2 주 동안 문화 유지 될 수 있지만, 도금 후 보통 7-9일까지 대부분의 건강. 매체는 건강한 세포를 유지하기 위해 하루에 한 번 교체해야. </li></ol>

C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세...

예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (&gt; 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 </EM&gt; 커뮤니티 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사 <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). 많은 장점에도 불구하고, 몇 가지 실험 방법은 C에 도전 한 엘레. 이러한 조직 또는 세포 유형의 세포 및 아이솔레이션의 원형질막에 액세스를 필요로하는 것들을 포함한다. 실제로 C. 엘레 조직은 쉽게 효소 처리 또는 세제에 의해 소화되지 않는 그 압력 수압 골격 내에 국한된다. 1990 년대 말에 미리 암 굿맨과 자넷 리치먼드 C.의 전기 생리학 녹음하는 방법을 개척 엘레현장 9,10에있는 신경 세포와 근육 세포. 이러한 방법은 우리에게 신경 및 생체 내에서 근육의 기능에 중요한 통찰력을 준 반면, 도전과 낮은 처리량이다. 생체 내에서 세포의 기능을 연구하는 다른 방법은 대부분, 특히 같은 GCamP과 카멜레온 11-13로 유전자 인코딩 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징, 개발했다. 그들이 그대로 살아있는 동물에 적용되기 때문에 이러한 방법은 그러나, 약리학 적 도구의 사용을 허용하지 않는다. 배양 C.의 첫 번째 시도 대규모 체외에서 elegans의 세포는 자신의 박사 학위 논문 (14)의 준비 기간 동안 레어 꽃에 의해 만들어졌다. 불행히도, 어려움이 기판에 세포 접착 불량으로 발생한 불량 세포 분화 및 생존은 강력한 세포 배양 방법으로 초기 프로토콜의 설립을 방지. 1995 년 에드가와 동료 절차를 출판단일 C의 분리 및 배양 세포 분열 형태 형성을 알아보고자 하였다. 엘레 15 배아. 효소 처리 및 수동 해리의 조합으로 달걀 껍질의 소화하여 얻은 배아 세포는 ~ 500 세포를 15까지 생산, 증식을 계속했다. 그 후, 양조위와 동료 장 형태 형성을 연구하는 할구의 작은 숫자를 배양. 그들은 하나의 체외 격리 E의 할구가 혀끝있는 adherens 접속점 (16)를 통해 서로 상호 작용에 의해 장 루멘과 유사한 구조를 만든 편광 장 세포를 생산 것을 보여 주었다. Buechner와 동료는 또한 배양 C에 대한 유사한 방법을보고했다. 관내 17 배아 세포 엘레 간스. 초기 작업을 바탕으로, 크리와 동료 배아 C를 배양하기위한 강력한 프로토콜을 개발했다. 엘레 체외 1 세포. 그들그 고립 C를 보였다. 엘레 세포는 다양한 세포 유형으로 분화 및 세포 특정 마커의 발현을 포함하여 그들은 생체 내에서 소유 기능을 유지할 수있다. 생체 내에서 도전하고 몇 가지 기술, 절연 C.에 적용 할 수 있습니다 배아 세포 엘레 간스. 이러한 전기 생리학 1,18 19, 이미징 및 면역 화학적 방법 (20, 21)뿐만 아니라, 세포의 특정의 cDNA 라이브러리 (22, 23)의 건설 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 특정 세포 유형의 격리 (가) 있습니다. 이러한 RNA 간섭 (RNAi의)와 같은 유전자 녹다운 (knockdown) 기술은 배양 된 C.에 적용 할 수 있습니다 엘레 셀 1 및 당 단백질 발견을위한 도구로서 아지 설탕을 사용한 신규 한 대사 표지 방법은 최근 체외 배양 C. 개발되었다 엘레 세포 24. 결론적으로, 세포 배양 방법은 어레이 O를 앞서C.에 적용 할 수있는 F 기법 살아있는 유기체의 컨텍스트에서 유전자 기능을 해독하기위한 노력의 elegans 모델. 우리는 C.를 배양 여기 프로토콜을 설명 주로 첫 번째 크리스티안와 동료 1에 기술 된 프로토콜을 기반으로 체외에서 배아 세포 엘레 간스.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar Granulated</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium (1x) Liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peanut Lectin</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)Glucose</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis (2-amin&amp;#8211;thylether), N,N,N&#039;,N&#039;- tetraacidic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclaved distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>101-1000 &amp;mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &amp;mu;l) Pipettor with tip ejector</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>Portable Pipet Aid, Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube </td><td>USA Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 18 gauge Needles</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 10 ml Syringes</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &amp;mu;m pore size </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &amp;mu;m versapor Membrane</td><td>VWR International Inc.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid </td><td>Thomas scientific</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- Fine Forceps </td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope with x10 objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambient air humidified Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 ​​초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.

C. 배양 세포가 특정 마커를 차별화하고 표현 세포 엘레 크리스텐슨과 트리 판 블루 염색법을 사용하여 동료는 것을 보여 주었다 배아 C.의&gt; 99 % 엘레 세포는 분리 절차를 생존. 9 일 도금 후 22에서 각각 85 %와 65 %는 여전히 1 살아있다. 고립 된 배아 C. 엘레 세포 분화하기 위하여 기판에 부착한다. 양식 대단히 짧은 시간을 준수하는 데 ...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.5K 조회수.  University of Miami.  우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘?...

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

연구

생화학

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

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Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

신경과학

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

유전학

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

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Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

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생물학

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

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C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

배양<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em &gt; 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

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Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

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