Asterischi (*) indicano passaggi nuovi o modificati rispetto alla Christensen et al. 1 1. Setup materiale <ol><li> La procedura di coltura cellulare richiede grandi quantità di uova isolato dagli adulti gravide. Crescere C. elegans su 8P piastre di agar seminato con NA22 (disponibile attraverso il C. elegans Consorzio genetica - CGC) batteri per isolare grandi quantità di uova. In queste tavole la quantità di peptone usata è 8 volte l&#39;importo che viene normalmente utilizzato per piastre NGM. La concentrazione peptone superiore sostiene la crescita di batteri NA22 più efficiente, che contrariamente a OP50-, crescere in strati spessi. </li></ol> 8P piatti ricetta: Sciogliere 3 g di NaCl, 20 g Bacto-Peptone, 25 g di agar in 1 L di acqua distillata sterile e autoclave per 30 min. Lasciare il mezzo raffreddare a 55 ° C e poi aggiungere filtrata sterile 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in EtOH), 1 ml di 1 MgCl 2, 1 ml di MgSO4 e 25 ml di tampone KP (Stock di 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g di KH 2 PO 4, pH 6,00). Versare agar liquido in 10 centimetri piastre di Petri (25 ml / piastra). <ol start="2"><li> Il giorno successivo sviluppa l&#39;intera superficie di ciascuna piastra di agar peptone arricchito con 1 ml di NA22 E. coli overnight coltivate in mezzi 2xYT (16 g di triptone, estratto di lievito 10 g, 5 g di NaCl in 1 L di acqua sterile, pH 7,0) a 37 ° C. Questi batteri costituiscono una fonte di cibo abbondante che formerà uno strato spesso sostenere la crescita di grandi quantità di adulti gravide. Lasciare le piastre seminate notte a temperatura ambiente per consentire la crescita dei batteri. Il processo può essere accelerato mediante incubazione a 37 ° C per 4-5 ore. </li><li> Di trasferire gli animali affamati per seminate 8P piatti. Lavare gli animali fuori un piatto NGM affamato con 5-6 ml di tampone M9 o acqua e aggiungere 1-2 ml di questa sospensione di ogni piatto 8P. </li><li> Consentire la crescita e la moltiplicazione degli animali untIL le piastre sono popolati a confluenza dagli adulti gravide. </li><li> Isolare le uova necessarie per la preparazione di C. elegans cellule embrionali, dagli adulti gravide con 5-6 ml di soluzione di lisi. </li></ol> Soluzione di lisi ricetta 5 ml di Fresh Bleach, 1,25 ml di NaOH 10 N e 18,5 ml di H 2 O. sterile Questa miscela deve essere preparata fresca prima di ogni utilizzo. <ol start="6"><li> Lavare le uova isolate dagli adulti gravide con tampone uovo: </li></ol> Tampone Egg ricetta 118 mM NaCl, KCl 48 mM, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarità 340 mOsm. <ol start="7"><li> Rimuovere il guscio che circonda le uova per trattamento con chitinasi. Chitinasi è un enzima con attività massima a pH acido 25. Sciogliere chitinasi (Sigma, catalogo n. C6137) in uovo tampone pH 6,5 ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Conservare il chitinasi magazzinosoluzione a -20 ° C in aliquote da 1 ml a 15 ml provette coniche sterili. Aliquote possono essere conservati a -20 ° C fino a pochi mesi. </li><li> Crescere C. cellule in coltura elegans su vetrini in autoclave (diametro 12 mm) rivestiti di arachidi lectina. Sciogliere arachidi lectina in acqua sterile (0,5 mg / ml). Soluzione lectina Peanut non deve essere filtrata o in autoclave. Inoltre non deve essere trattato con luce UV. Negozio 2 ml aliquote a -20 ° C per 6 mesi. </li><li> Mezzo completo di coltura cellulare (500 ml) contiene 500 ml L-15 terreno di coltura da Gibco, 50 ml di siero fetale bovino (inattivato con il calore), 7,7 g di saccarosio (45 mOsm), 5 ml di 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (2%). Il terreno completo viene quindi filtrato usando un filtro pori 0.20 micron. </li></ol> Si noti che il buffer uovo e il mezzo di coltura hanno rispettivamente osmolarità di 340 e 345 mOsm. Infatti, contrariamente a cellule di mammifero, C. cellule elegans hanno una relativamente alta osmolaritàche deve essere preso in conteggio quando la preparazione di soluzioni che entreranno in contatto diretto con la membrana plasmatica delle cellule. Le ricette di questi reagenti sono stati adeguati per raggiungere l&#39;osmolarità desiderato, che è stata misurata utilizzando un osmometer 1. Non è necessario usare un osmometer se queste ricette sono seguite esattamente e cura viene utilizzato nella preparazione di questi reagenti. Tuttavia, si dovrebbe utilizzare un Osmoter se altre soluzioni devono essere preparate, le cui ricette non sono riportati qui o in una delle pubblicazioni che utilizzano C. elegans cellule in coltura. 2. Isolamento Egg <ol><li> Si consiglia di iniziare con almeno quattro 8P piastre per raccogliere abbastanza uova per 12 pozzetti di cellule in coltura (in piastre da 24 pozzetti). </li><li> Prima di iniziare la procedura di scongelare un tubo di arachidi lectina soluzione stock. Posizionare coprioggetti autoclave al fondo dei pozzetti in una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 200 ml di arachidi lectina alle lamelle. Incubare per 1 ora o di uino le cellule sono pronte per essere placcato. Rimuovere completamente i lectina di arachidi e lavare i pozzetti una volta con 1 ml di acqua sterile autoclave. La rimozione completa della lectina arachidi dalle coprioggetti essenziali per evitare aggregazione delle cellule. </li><li> Lavare il numero di adulti gravide al largo delle piastre di agar con acqua autoclave sterile. Raccogliere la sospensione in due sterile conica tubo da 50 ml. Lasciare le provette in ghiaccio per 5 minuti per consentire la precipitazione dei vermi nella parte inferiore dei tubi (*). Rimuovere l&#39;acqua con una pipetta di trasferimento di plastica e sostituirla con acqua fresca autoclave sterile. Pellet worm da tavolo centrifugazione a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 minuti (*). Ripetere quest&#39;ultimo passaggio almeno 3. </li><li> Trasferire vermi in un tubo da 15 ml sterile e pellet a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 min (*). Non utilizzare maggiore velocità di centrifugazione per evitare di raccogliere i batteri nella parte inferiore del tubo pure. A volte, dopo centrifugazioni i vermi non sono completamente pellet. After ogni lavaggio e prima del ritiro il surnatante, posizionare le provette per 5 minuti in ghiaccio. In refrigerata vermi acqua precipitano sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua e aggiungere 5-6 ml di soluzione di lisi (vedi Material istituito). Rock the sospensione delicatamente per 5-10 minuti e poi iniziare il monitoraggio verme lisi con lo stereomicroscopio ogni 2-3 min. Una goccia di sospensione può essere posizionato anche su un vetrino per ispezioni. Il tempo di incubazione varia a seconda della freschezza della candeggina; acquistare piccole bottiglie di candeggina e aprire una nuova bottiglia ogni mese. </li><li> Quando ~ 70-80% di vermi vengono lisate (10 min dall&#39;inizio dell&#39;incubazione), arrestare la reazione di lisi aggiungendo 9 ml di tampone a pH 7.3 uovo (vedi Materiale impostato). Centrifugare la sospensione a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 min. Da questo punto in un becco Bunsen su, sul banco per impedire la contaminazione delle uova (*). </li><li> Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta di trasferimento sterile in plastica e lavare il pellet 3-4x con tampone uovo fino a quando la soluzione è limpida. Assicurarsi di mescolare il bene pellet nel buffer uovo durante ogni lavaggio. </li><li> Le uova sono separate dalle carcasse animali usando la soluzione di saccarosio al 30%. Risospendere il pellet in 2 ml di tampone sterile uovo e aggiungere la soluzione di saccarosio 2 ml di 60% (magazzino in tampone uovo sterile). Mescolare bene e centrifugare per 20 minuti a 200 g (circa 1200 rpm) (*). </li><li> Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga. Le uova sono galleggianti nella parte superiore della soluzione. Usando una pipetta P1000 e punte sterili, trasferire tutte le uova in un tubo conico freschi 15 ml sterili. </li><li> Aggiungere 10 ml di tampone sterile uovo al tubo e centrifugare a 200 xg (~ 1.200 rpm) per 10 min. Ripetere il lavaggio 3 x. Assicurarsi che le uova sono completamente risospese in buffer uovo durante ogni lavaggio. </li></ol> 3. Cellule embrionali Dissociazione Condurre le fasi successive della procedura in condizioni sterili utilizzando una cappa a flusso laminare. Mentre gli animali sonocamice su batteri lastre, i lavaggi e il trattamento con la soluzione di lisi contenente candeggina dovrebbe eliminare la maggior parte se non tutti i batteri. Quindi, usando una cappa laminare a questo punto del procedimento impedisce nuova contaminazione della sospensione uovo. <ol><li> Risospendere uova pellet in 1 ml di 2 mg / ml chitinasi (magazzino in uovo tampone a pH 6.5 (*)) e trasferirli in un nuovo tubo da 15 ml sterile. Muovere la provetta per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Il tempo esatto di incubazione varia a seconda della freschezza dell&#39;enzima e la temperatura della stanza e dovrebbe quindi essere determinata per ogni preparazione. Si raccomanda di iniziare a monitorare le uova sotto un microscopio coltura cellulare invertita dopo 10 min di incubazione. Nota: nella nostra esperienza, basso pH aumenta l&#39;attività enzimatica chitinasi. Per questo motivo utilizziamo tampone di uovo a pH 6,5 per sciogliere chitinasi (ricetta sopra riportato, dove il pH è regolato a 6,5 ​​con NaOH). </li><li> Quando ~ 80% dei gusci d&#39;uovo sono digeriti daltrattamento chitinasi (Figure 1 AB), agglomerare le uova per centrifugazione a 900 xg (~ 2.500 rpm) per 3 minuti (*). Usando una pipetta P1000 e punte sterili, rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 3 ml di L-15 (*). </li><li> Trasferire le uova in un piatto del diametro di 6 cm ed dissociare delicatamente le cellule utilizzando una siringa da 10 ml sterile dotata di un ago G 18. Monitorare il grado di dissociazione mettendo una goccia di sospensione in una piastra di Petri di plastica fresco e visualizzazione al microscopio. Non aspirare aria nella siringa durante questa procedura per evitare di danneggiare le cellule. Continuare la dissociazione fino al ~ 80% delle cellule sono dissociato. </li><li> Filtrare la sospensione con una sterile 5 micron filtro Millipore. Le sospensioni cellulari devono essere filtrati per eliminare grumi di cellule, uova non digeriti e larve schiuse. Filtrare supplementari 4-5 ml di fresco L-15 media attraverso il filtro di recuperare tutte le cellule. Non esercitare una forza eccessiva durante la fase di filtrazione per evitare daMaging del filtro e / o le cellule. </li></ol> 4. Coltura di cellule <ol><li> Agglomerare le cellule dissociate mediante centrifugazione a 900 xg (~ 2.500 rpm) per 3 minuti (*). Usando una pipetta P1000 e punte sterili rimuovere con attenzione tutto il surnatante. Risospendere le cellule in pellet completo L-15 e la piastra 1 ml / pozzetto. La quantità del mezzo aggiunto dipende dal numero di piastre 8P utilizzato, la confluenza dei vermi sulle piastre, e il tipo di esperimenti che verranno eseguiti sulle cellule. La densità delle cellule può essere determinata utilizzando un emocitometro. Per le registrazioni di patch-clamp placcatura densità di circa 230.000 cellule / cm 2 è ottimale. </li><li> Mantenere la piastra 24 pozzetti in un contenitore Tupperware di plastica contenente asciugamani di carta bagnati per evitare l&#39;evaporazione del terreno di coltura. Conservare il contenitore in un incubatore umidificato a 20 ° C e l&#39;aria ambiente. </li><li> Le cellule sono di solito pronti per gli esperimenti entro 24 ore quando la differenziazione morfologica ed espressoione di marcatori GFP sono completi. Le celle possono essere tenuti in coltura per un massimo di 2 settimane, ma di solito sono più sani fino a 7-9 giorni dopo la placcatura. Il mezzo deve essere sostituito una volta al giorno per mantenere le cellule sane. </li></ol>

C. elegans è un potente organismo modello per decifrare i meccanismi genetici coinvolti nello sviluppo, il comportamento e l&#39;invecchiamento. La sua convenienza deriva principalmente dalla facilità con cui può essere geneticamente manipolato e dal suo ciclo di vita breve. Nonostante la sua convenienza, C. elegans ha i suoi limiti. C. elegans cellule sono minuscole e confinato all&#39;interno di una cuticola pressurizzata che limita l&#39;applicazione di metodi che richiedono l&#39;access...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un potente organismo modello per studiare le basi molecolari della funzione cellulare, differenziamento, e il comportamento. Mentre il suo genoma, vie metaboliche e biosintetiche sono simili ai vertebrati &#39;, la sua trattabilità genetica e molecolare sono di gran lunga maggiore 2. Tra i suoi vantaggi sono la sua dimensione e semplice anatomia, il suo rapido ciclo di vita (3 giorni a 25 ° C), di breve durata (2 settimane) e il gran numero di figli (&gt; 200). Grazie alla sua natura ermafrodita e breve ciclo di vita, manipolazioni molecolari e genetici sono semplici in C. elegans, compresa la generazione di animali transgenici 3,4 e l&#39;applicazione di tecniche di gene irrisori come RNA interference 5. C. corpo elegans e guscio d&#39;uovo sono trasparenti. Pertanto cellule possono essere facilmente visualizzati sia l&#39;adulto e l&#39;embrione utilizzando microscopia standard. Negli ultimi 40 anni, il C. elegans </em&gt; comunità ha creato risorse preziose per C. ricerca elegans cui una grande raccolta di mutanti, ko e transgenici, una descrizione dettagliata di anatomia e sviluppo 6,7, compresa la completa ricostruzione del sistema nervoso 8, e un genoma completamente sequenziato che è ben annotato e disponibile per tutta la comunità ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Nonostante i numerosi vantaggi, alcuni approcci sperimentali sono stati difficili in C. elegans. Questi includono quelli che richiedono l&#39;accessibilità alla membrana plasmatica delle cellule e l&#39;isolamento di tessuti o tipi cellulari. Infatti C. tessuti elegans sono confinate all&#39;interno della sua pressione scheletro idrostatico, che non è facilmente digerito dal trattamento enzimatico o detergenti. Alla fine degli anni 1990 Miriam Goodman e Janet Richmond pionieri metodi di registrazioni elettrofisiologiche di C. elegansneuroni e cellule muscolari in situ 9,10. Mentre questi metodi ci ha dato importanti intuizioni neuronale e la funzione muscolare in vivo, sono impegnativi e bassa velocità. Erano stati sviluppati metodi alternativi per studiare la funzione delle cellule in vivo, per lo più in particolare nel calcio di imaging in vivo utilizzando sensori di calcio geneticamente codificato come GCamP e cameleon 11-13. Questi metodi, però, non consentono l&#39;utilizzo di strumenti farmacologici poiché applicati su animali viventi intatti. Il primo tentativo di coltura C. elegans cellule in vitro in grande scala è stata fatta da Laird Bloom durante la preparazione della sua tesi di dottorato di ricerca 14. Purtroppo, le difficoltà incontrate con scarsa adesione delle cellule al substrato, la differenziazione cellulare e la sopravvivenza povero impedito la creazione di questo protocollo presto come metodo di coltura cellulare robusto. Nel 1995 Edgar e colleghi hanno pubblicato una proceduraper indagare la divisione cellulare e la morfogenesi da isolamento e la coltura di una singola C. elegans embrioni 15. Cellule embrionali ottenuti per digestione dei gusci d&#39;uovo con una combinazione di trattamento enzimatico e dissociazione manuale, hanno continuato a proliferare, producendo fino a ~ 500 celle 15. Successivamente, Leung e collaboratori hanno coltivato un piccolo numero di blastomeri di studiare morfogenesi intestinale. Essi hanno dimostrato che uno vitro isolato E blastomere prodotta in cellule intestinali polarizzate che ha creato una struttura analoga a lume intestinale interagendo tra loro attraverso adherens apicali svincoli 16. Buechner e colleghi hanno anche segnalato un metodo simile per la coltura C. elegans cellule embrionali in vitro 17. Sulla base di questo primo lavoro, Christensen e colleghi hanno sviluppato un protocollo robusto per la coltura embrionale C. elegans cellule in vitro 1. Essiha dimostrato che isolato C. elegans cellule possono differenziarsi in vari tipi di cellule e preservare le caratteristiche che possiedono in vivo, compresa l&#39;espressione di marcatori cellula-specifici. Diverse tecniche che sono impegnativi in vivo, possono essere applicati su isolato C. elegans cellule embrionali. Questi includono elettrofisiologico 1,18 19, imaging e tecniche immunochimiche 20,21, così come l&#39;isolamento di specifici tipi cellulari da cellule fluorescenti-Activated (FACS) per la costruzione di librerie di cDNA cellula-specifici 22,23. Gene knockdown tecniche come RNA interference (RNAi) possono essere applicati su coltura C. elegans celle 1 e un metodo di marcatura metabolica romanzo utilizzando Azido zucchero come strumento per la scoperta glicoproteina è stato recentemente sviluppato per C. coltivate in vitro elegans cellule 24. In conclusione, il metodo di coltura cellulare espande la matrice of tecniche che possono essere applicate al C. modello elegans nel tentativo di decifrare funzione genica nel contesto di un organismo vivente. Descriviamo qui il protocollo per la coltura di C. elegans cellule embrionali in vitro, che è in gran parte basata sul protocollo prima descritto da Christiansen e colleghi 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar Granulated</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium (1x) Liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peanut Lectin</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)Glucose</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis (2-amin&amp;#8211;thylether), N,N,N&#039;,N&#039;- tetraacidic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclaved distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>101-1000 &amp;mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &amp;mu;l) Pipettor with tip ejector</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>Portable Pipet Aid, Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube </td><td>USA Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 18 gauge Needles</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 10 ml Syringes</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &amp;mu;m pore size </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &amp;mu;m versapor Membrane</td><td>VWR International Inc.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid </td><td>Thomas scientific</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- Fine Forceps </td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope with x10 objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambient air humidified Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans è un potente sistema modello, in cui le tecniche genetiche e molecolari sono facilmente applicabili. Fino a poco tempo però, tecniche che richiedono l&#39;accesso diretto alle cellule e isolamento di specifici tipi cellulari, potrebbero non essere applicate in C. elegans. Questa limitazione è dovuta al fatto che i tessuti sono confinati all&#39;interno di una cuticola pressurizzato che non è facilmente digeribile mediante trattamento con enzimi e / o detergenti. Basata su lavoro di pioniere da Laird Bloom, Christensen e colleghi 1 sviluppato un metodo affidabile per la coltura di C. elegans cellule embrionali in larga scala. Le uova sono isolati dagli adulti gravide mediante trattamento con candeggina / NaOH e successivamente trattati con chitinase per rimuovere i gusci d&#39;uovo. Le cellule embrionali sono poi dissociate da pipettaggio manuale e piastrati su substrato di vetro ricoperto nei media siero arricchito. Entro 24 ore di celle di isolamento cominciare a differenziare cambiando la morfologia ed esprimendo cellule marke specificars. C. elegans cellule coltivate utilizzando questo metodo sopravvivono superiore 2 settimane in vitro e sono stati utilizzati per elettrofisiologica, immunochimici, imaging analisi così come sono state filtrate e utilizzati per microarray profiling.

C. elegans cellule in coltura e differenziare cellule espresso marcatori specifici Christensen e colleghi utilizzando trypan colorazione blu hanno dimostrato che il&gt; 99% dei embrionale C. cellule elegans sopravvivono alla procedura di isolamento. Al giorno 9 e 22 dopo la placcatura, 85% e 65%, rispettivamente, sono ancora vivi 1. Isolato embrionale C. cellule elegans devono aderire ad un substrato al fine di differenziare. Le cellule ch...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Descriviamo qui un protocollo riveduto per la cultura su larga scala di embrionale C. elegans cellule. Embryonic C. elegans cellule coltivate in vitro utilizzando questo metodo, sembrano differenziare e ricapitolare l&#39;espressione di geni in maniera specifica cella. Tecniche che richiedono l&#39;accesso diretto alle cellule o l&#39;isolamento di specifici tipi cellulari da altri tessuti possono essere applicati su C. elegans cellule in coltura.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.5K Views.  University of Miami.  Descriviamo qui un protocollo riveduto per la cultura su larga scala di embrionale C. elegans cellule. Embryonic C. elegans cellule coltivate in vitro utilizzando questo metodo, sembrano differenziare e ricapitolare l'espressione di geni in maniera specifica cella. Tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule o l'isolamento di specifici tipi cellulari da altri tessuti possono essere applicati su C. elegans cellule...

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Ricerca

Biochimica

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Neuroscienze

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C. elegans Dissezione delle gonadi e crack congelati per immunofluorescenza e colorazione DAPI

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

Genetica

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogenesi

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culturing<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

C. elegans Manutenzione

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

Un metodo per la coltura embrionale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic

C. elegans Dissezione delle gonadi e crack congelati per immunofluorescenza e colorazione DAPI

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

Misurare gli effetti dei batteri su

Culturing

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

C. elegans Manutenzione