クリステンセンらと比較して、アスタリスク（*）は、新規または変更されたステップを示している。1 1。素材のセットアップ<ol><li>細胞培養手順が妊娠成人から単離された卵を大量に必要とする。 Cを育てる卵を大量に分離するために、細菌- エレガンス 8P寒天プレート上NA22（CGC 虫遺伝コンソーシアムを通じて利用可能）を播種。これらのプレートに用いられるペプトンの量は、通常、NGMプレートのために使用される8倍の量である。高いペプトン濃度が厚い層に成長するためにどの反しOP50-、より効率的NA22細菌の成長を支える。 </li></ol> 8Pプレートレシピ： 3グラムのNaCl物、20gバクト - ペプトン、30分間の滅菌蒸留水を、オートクレーブ1L中25gの寒天を溶解する。 MgCl 2を 55℃で培地が冷えて、次にコレステロールの滅菌濾過した1ミリリットル（EtOH中5ミリグラム/ ml）を追加し、1の1ミリリットル、MgSO 4を1mlの緩衝液およびKP（500ミリリットルのストック：5gのK 2 HPO 4、30gのKH 2 PO 4、pHは6.00）を25ml。 10センチメートルペトリ皿（25ミリリットル/プレート）内に液体寒天培地を注ぐ。 <ol start="2"><li>翌日、NA22 E. 1mlの各富化ペプトン寒天プレートの表面全体に広がる2XYTメディア（16グラムトリプトン、10gの酵母エキス、滅菌水、pH7.0の1L中に5グラムのNaCl）、37℃で一晩培養した大腸菌中これらの細菌は妊娠成人の大量増殖を支持する厚い層を形成する豊富な食物源を構成している。細菌の増殖を可能にするために、室温で一晩播種したプレートを残す。プロセスは4-5時間37℃でインキュベートすることによって加速することができる。 </li><li>播種8Pプレートに飢えた動物を転送します。 5-6 M9バッファーまたはmlの水を使用して飢えNGMプレートを動物に洗い落とし、各8Pプレートにこの懸濁液1〜2 mLを加え。 </li><li>動物の成長および増殖をUNT許すILプレートは妊娠大人合流点に移入されます。 </li><li> Cの調製に必要な卵を隔離溶解溶液5-6ミリリットル用い妊娠成人からの胚細胞を、 エレガンス 。 </li></ol>溶解液のレシピ新鮮なブリーチの5ミリリットル、10 N NaOHを1.25ミリリットル及び滅菌H 2 Oの18.5ミリリットルこの混合物は、それぞれを使用する前に新たに調製しなければならない。 <ol start="6"><li>卵の緩衝液を使用して妊娠成人から分離された卵を洗う。 </li></ol>卵バッファレシピ 118のNaCl、48のKCl、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、25mMのHepes、pH7.3の、オスモル濃度340ミリオスモル。 <ol start="7"><li>キチナーゼで処理することにより、卵を取り囲んで卵殻を削除します。キチナーゼは酸性pH 25で最大活性を有する酵素である。 2 mg / mlの最終濃度卵緩衝液pH6.5中キチナーゼ（Sigma社、カタログ番号C6137）を溶解する。キチナーゼの在庫を保管無菌15ミリリットル中に1ミリリットルのアリコートで-20℃円錐管での解。アリコートを数ヶ月まで、-20℃までで保存することができる。 </li><li> Cを育てるピーナッツレクチンで覆われてオートクレーブしたカバーガラス（直径12mm）上の線虫の培養細胞。滅菌水（0.5 mg / ml）を中にピーナッツレクチンを溶かす。ピーナッツレクチン溶液を濾過またはオートクレーブ処理してはならない。また、UV光で処理する必要がない。最長6ヶ月間-20℃で保存2ミリリットルのアリコート。 </li><li>完全な細胞培養培地（500ml）をGibco社50mlのウシ胎児血清（熱不活化）、7.7グラムのスクロース（45ミリオスモル）、100 U / mlのペニシリンおよび100μg/ml5mlの/から500ミリリットルL-15培地を含有するストレプトマイシン（2％）。完全培地を、次いで、0.20μmのポアフィルターを用いて濾過する。 </li></ol>卵液と培養液をそれぞれ340の浸透圧および345 mOsmであることに注意してください。実際に、哺乳動物細胞に反して、C.虫細胞が比較的高い浸透圧を持っているそれは、細胞の原形質膜と直接接触するソリューションを調製する場合、カウントに入れる必要がある。これらの試薬 ​​のレシピは1浸透圧計を用いて測定した所望の容量オスモル濃度に達するように調整した。なお、これらのレシピは正確に従っているとの注意をこれらの試薬を調製する際に使用される場合、浸透圧計を使用する必要はない。他のソリューションは、そのレシピここで報告されていないか、またはCを使用するパブリケーションのいずれかで、準備する必要がある場合は、1がosmoterを使用する必要があります培養細胞エレガンス 。 2。卵の分離<ol><li>これは、（24ウェルプレート）で培養した細胞の12ウェルについて十分な卵を収集するために、少なくとも4 8Pプレートで始めることをお勧めします。 </li><li>手順を開始する前にピーナッツレクチン原液の1のチューブを解凍する。 24ウェルプレートのウェルの底にオートクレーブしたカバーガラスを置き、カバーグラスにピーナツレクチンを200μlを加える。 1時間またはuインキュベート細胞ntilめっきされる準備ができている。完全にピーナッツレクチンを削除し、滅菌オートクレーブ処理水1mlで一度井戸を洗浄します。カバースリップからピーナッツレクチンの完全な除去は、細胞凝集を避けるために不可欠である。 </li><li>無菌オートクレーブ処理水を用いた寒天平板から妊娠成人を洗ってください。 2の滅菌コニカル50ミリリットルチューブにサスペンションを収集します。チューブ（*）の一番下にあるワームの沈殿を可能にするために、最大5分間氷上でチューブを残す。転送プラスチックピペットを用いて水を除去し、新しい滅菌オートクレーブした水と交換してください。 10分（*）のための200 XG（〜1,200 rpm）で卓上型遠心分離によってペレットワーム。少なくとも3この最後の手順を繰り返します。 </li><li>無菌15ミリリットルコニカルチューブにワームを転送し、200×gで10分間（〜1,200 RPM）（*）でそれらをペレット化。だけでなく、チューブの底に菌を収集避けるために、より高い遠心分離速度を使用しないでください。時々、遠心分離後にワームが完全にペレット化されていません。 AFTERは、各洗浄·除去する前に上清を、氷上で5分間チューブを配置します。冷水ワームズチューブの底に沈殿する。 </li><li>水を除去し、溶解液5-6 mLを加え（素材のセットアップを参照してください）​​。 5〜10分間静かにサスペンションロックしてから2〜3分ごとに実体顕微鏡下でワームの溶解の監視を開始。懸濁液を一滴も容易に検査のためにカバースリップ上に配置することができる。インキュベーション時間は、漂白剤の鮮度が異なることもあり、漂白剤の小瓶を購入し、毎月新しいボトルを開きます。 </li><li> 〜ワームの70〜80％が（インキュベーションの開始から10分）を溶解している場合、（素材のセットアップを参照）卵液pH 7.3の9ミリリットルを追加することにより、溶解反応を停止させる。 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で懸濁物を遠心分離する。この時点で、オンから卵（*）の再汚染を防止するためにベンチに、上のブンゼンバーナーを有する。 </li><li>注意深く滅菌プラスチックトランスファーピペットを用いて上清を除去し、ペレットを洗浄3-4卵のバッファーでX溶液が透明になるまで。各洗浄中に卵のバッファにペレットをよく混ぜにしてください。 </li><li>卵を30％ショ糖溶液を用いて動物の死体から分離される。無菌卵液2mlにペレットを再懸濁し、60％ショ糖溶液（無菌卵バッファの株式）の2ミリリットルを追加します。よく混ぜると200 XG（〜1,200 RPM）（*）で20分間遠心する。 </li><li>慎重に遠心機からチューブを取り外します。卵は、溶液の上部に浮遊している。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブにすべての卵を移す。 </li><li> 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で遠心チューブに無菌卵緩衝液10mlを追加します。洗浄を3×を繰り返します。卵は完全に洗浄中に卵の緩衝液に再懸濁していることを確認します。 </li></ol> 3。胚細胞解離層流フードを使用して無菌条件下で手順の次のステップを行っています。動物がいる間細菌プレート上でガウン、漂白剤を含む溶解液で洗浄および治療がないがほとんどすべての細菌を排除する必要があります。したがって手順のこの時点で層流フードを使用して卵懸濁液の新たな汚染を防止する。 <ol><li>再懸濁は、2 mg / mlのキチナーゼ（卵液pH 6.5（*）の株式）の1ミリリットル中に卵をペレット化し、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブに転送。室温で10から30分間、チューブを揺する。正確なインキュベーション時間は、酵素と部屋の温度の鮮度に応じて変化するので、それぞれの調製物について決定されるべきである。これは、インキュベーションの10分後に反転し、細胞培養、顕微鏡下で卵の監視を開始することをお勧めします。注意：我々の経験では、低pHはキチナーゼ酵素活性を増加させる。このような理由から、我々はキチナーゼ（pHはNaOHを用いて6.5​​に調整した上で報告されたレシピを、）を溶解するためにpH6.5で卵のバッファを使用しています。 </li><li> 〜卵の殻の80％はで消化されるとキチナーゼ処理（ 図1-B）は 、900×gで3分間（〜2,500 RPM）（*）で遠心分離して卵をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、慎重に上清を除去し、L-15培地（*）の3ミリリットルを追加します。 </li><li>直径6cmプレートに卵を移し、ゆっくりと18 Gの針を装備した10ミリリットルの無菌注射器を用いて細胞を解離する。新鮮なプラスチック製のシャーレにサスペンションのドロップを配置することにより、顕微鏡下で表示することにより、解離度を監視します。細胞の損傷を防ぐために、この手順の間、注射器内に空気を吸引しないでください。細胞の80％が解離して〜まで解離を継続する。 </li><li>滅菌5μmのミリポアフィルターを用いて懸濁液をろ過する。細胞懸濁液は、細胞凝集塊、未消化の卵と孵化した幼虫を除去するためにフィルタリングされなければならない。すべての細胞を回収するためにフィルタを介して新鮮なL-15メディアのさらに4〜5ミリリットルフィルター。 DAを避けるために、濾過工程の間に無理な力を加えないでください。フィルタおよび/または細胞をmaging。 </li></ol> 4。細胞を培養<ol><li> 3分（*）のために900 XG（〜2,500 rpm）で遠心分離により分離した細胞をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用すると、慎重にすべての上清を除去します。完全なL-15培地とプレート1ミリリットル/ウェルでペレット化した細胞を再懸濁します。添加培地の使用量は、8Pプレートの数、プレート上のワームの合流点、および細胞上で行われる実験の種類に依存する。細胞密度を、血球計数器を用いて決定することができる。 〜23万細胞の密度でプレーティングパッチクランプ記録のために個/ cm 2が最適である。 </li><li>培地の蒸発を回避するために、湿ったペーパータオルを含むプラスチックタッパーウェア容器に24ウェルプレートを保持する。 20℃、周囲の空気の加湿インキュベーターで容器を保管してください。 </li><li>際形態的分化と発現する細胞は、24時間以内に通常の実験のための準備ができているGFPマーカーのイオンが完了している。細胞は、最大2週間培養中に保持することができるが、それらは播種後、通常7〜9日までの最も健康である。媒体は、健康な細胞を維持するために一日一回交換する必要がある。 </li></ol>

線虫は、開発、行動や老化に関与する遺伝的経路を解読するための強力なモデル生物である。その利便性は、主にそれが遺伝子操作することができる容易さから、その短いライフサイクルから生じる。その便利さにもかかわらず、C.虫には限界があります。 で虫細胞は、そのような小さな電気生理学的及び薬理学的技術、またはこのようなマイクロアレイ解析による遺伝...

線虫（Caenorhabditis elegans）（虫 ） は、細胞の機能、分化、および行動の分子基盤を調査するための強力なモデル生物である。そのゲノム、代謝および生合成経路は、脊椎動物&#39;に似ていますが、その遺伝的および分子扱いやすには、2はるかに大きい。その利点の中でも、その大きさと単純な解剖学的構造、その迅速なライフサイクル（25℃で3日間）、短寿命（2週）および子孫の大多数（&gt; 200）である。 、その雌雄同体自然と短いライフサイクルに、分子·遺伝子操作は、C言語で簡単ですトランスジェニック動物3,4、およびそのようなRNA干渉5のような遺伝子ノックダウン技術の適用の生成を含む線虫、C.虫体と卵の殻が透明です。従って細胞は、容易に標準的な顕微鏡を使用して、成体および胚の両方で可視化することができる。過去40年間で、C.虫 </EM&gt;コミュニティは、C.のための非常に貴重なリソースを作成しました突然変異体、ノックアウトおよびトランスジェニックの大規模なコレクション、神経系8の完全復興を含む解剖学と開発6,7の詳細な説明、よく注釈付きやコミュニティ全体で使用可能な完全に配列ゲノム（含む虫研究 <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ）。 多くの利点にもかかわらず、いくつかの実験的アプローチは、C言語で挑戦してきた虫 。これらは、組織または細胞型の細胞および単離の原形質膜へのアクセス可能性を必要とするものが挙げられる。確かにC。虫の組織は簡単に酵素処理または界面活性剤によって消化されない、その加圧された流体静力学的骨格内に閉じ込められる。 1990年代の終わりに、ミリアム·グッドマンとジャネットリッチモンドでの電気生理学的記録のための方法を開拓した虫その場 9,10 の神経細胞や筋肉細胞。これらの方法は、生体内での神経や筋肉の機能に私たちに重要な洞察を与えたが、彼 ​​らは挑戦的で低スループットである。 インビボで細胞機能を研究するための代替方法は、主に、特に、そのようなGCamPとカメレオン11-13として遺伝的にコードされたカルシウムセンサを用いてインビボカルシウムイメージングでは 、開発した。彼らは無傷で生きている動物に適用されるため、これらの方法は、しかし、薬理学的なツールの使用を許可していない。 培養にて最初の試み大規模な生体外での線虫細胞は、彼の博士論文14の調製時レアード·ブルームによって作られた。残念ながら、基板に対する細胞の接着不良で遭遇する困難は、貧弱な細胞分化および生存は、堅牢な細胞培養法として、この初期のプロトコルの確立を防止する。 1995年にエドガーらは手順を公表単一のCの単離および培養することによって細胞分裂と形態形成を調査する。虫は 15胚。酵素処理と手動解離の組み合わせで卵の殻の消化によって得られた胚細胞は、〜500のセル15までの生産、増殖し続けた。その後、レオンらは腸の形態形成を研究する割球数の少ない培養した。彼らは、1 試験管内孤立のE割球は、頂端接着結合16を介して互いに相互作用することにより、腸管腔に類似した構造を作成した偏腸細胞を生成することを示した。ブフナーらはまた、Cを培養するための同様の方法を報告した。試験管 17 内の胚細胞エレガンス 。 この初期の研究に基づいて、クリステンセンらは、胚のCを培養するための堅牢なプロトコルを開発した。試験管 1 で細胞エレガンス 。彼らその孤立したCが示された。虫細胞は、様々な細胞型に分化し、細胞特異的マーカーの発現を含め、それらがインビボで有する機能を維持することができる。 インビボで挑戦しているいくつかの技術は、単離されたC.上に塗布することができる胚細胞エレガンス 。これらは、電気生理学1,18 19、撮像、免疫化学的技法20,21、ならびに細胞特異的cDNAライブラリーの構築のため22,23（FACS）を蛍光活性化セルソーティングにより特定の細胞型の単離を含む。このようなRNA干渉（RNAi）などの遺伝子ノックダウン技術は、培養されたC.上に塗布することができる虫細胞1および糖タンパク質の発見のためのツールとしてアジド糖を用いて新規な代謝標識法は最近、 インビトロで培養C.ために開発されている虫の細胞24。 結論として、細胞培養法は、アレイを展開oをC.に適用することができるfの技法生体の文脈において遺伝子機能を解読するための努力においてエレガンスモデル 。ここではCを培養するためのプロトコルを記述大部分は最初のクリスチャンセンら1によって記述されたプロトコルに基づいており、in vitroで胚細胞を、 虫 。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar Granulated</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium (1x) Liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peanut Lectin</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)Glucose</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis (2-amin&amp;#8211;thylether), N,N,N&#039;,N&#039;- tetraacidic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclaved distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>101-1000 &amp;mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &amp;mu;l) Pipettor with tip ejector</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>Portable Pipet Aid, Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube </td><td>USA Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 18 gauge Needles</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 10 ml Syringes</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &amp;mu;m pore size </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &amp;mu;m versapor Membrane</td><td>VWR International Inc.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid </td><td>Thomas scientific</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- Fine Forceps </td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope with x10 objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambient air humidified Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C.エレガンスは、遺伝的および分子技術を容易に適用可能な、強力なモデル系である。しかし最近まで、細胞及び特定の細胞型の単離に直接アクセスする必要の技術は、C.に適用できなかった虫 。この制限は、組織が容易に酵素及び/又は界面活性剤で処理することによって消化されない加圧されたキューティクル内に閉じ込められるという事実によるものであった。 1は Cを培養するための堅牢な方法を開発したレアードブルーム、クリステンセンらが先駆者の仕事に基づいて大規模に胚細胞エレガンス 。卵は、漂白/ NaOHで処理することによって妊娠成人から単離し、続いて卵の殻を除去するキチナーゼで処理される。胚細胞は、その後、手動ピペッティングにより分離し、血清富化培地中の基質で覆われたガラス上にプレーティングする。アイソレーション·セルの24時間以内に形態を変更することにより、および細胞特異的マルケを発現させることにより、分化し始めるRS。C.エレガンスこの方法を用いて培養した細胞は、 インビトロで 2週間まで生存し、電気生理学的、免疫のために使用されており、それらはソートされ、マイクロアレイプロファイリングのために使用されているような画像は、同様に解析する。

C.は、培養細胞が分化し、細胞特異的マーカーを発現する線虫 トリパンブルー染色を用いてクリステンセンらは、胚での&gt; 99％を示した虫細胞が単離手順を生き残る。 9日目と22めっき後、それぞれ85％と65％は、まだ1生きている。孤立した胚で虫細胞は、区別するために、基板に接着しなければならない。フォーム塊を接着する?...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布することができる培養細胞エレガンス 。

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.5K ビュー.  University of Miami. ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布?...

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

生化学

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

神経科学

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

遺伝学

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

生物学

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

上の細菌の影響を測定する<em&gt; C.エレガンス</em卵保持アッセイを用いて&gt;行動

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

培養<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em &gt;微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

C. elegansの基礎研究のためのメンテナンスについて

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

培養胚のための方法

要約

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この動画の章

カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

シナプス蛍光の自動定量

C.エレガンス免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

上の細菌の影響を測定する

培養

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

C. elegansの基礎研究のためのメンテナンスについて

培養胚のための方法

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カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

シナプス蛍光の自動定量

C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

上の細菌の影響を測定する

培養

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

C. elegansの基礎研究のためのメンテナンスについて

カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

C.エレガンス免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂