트레이시 C. Grikscheit, 에릭 R. Barthel, 그리고 글쓴이 G. 살라은 캘리포니아 재생 의료 연구소 (CIRM), 교부금 번호 RN2 - 00946-1 (TCG)과 TG2-01168 (ERB, FGS)에 의해 지원됩니다. 앨리슨 L. Speer은 대학 외과 전문의 Ethicon 학자의 사회입니다. Yashuhiro Torashima는 어린이 병원 로스 앤젤레스 Saban 연구소 연구 경력 개발 친목으로 운용되고 있습니다.

1. Organoid 단위 준비 <ol><li> 마우스 해부 (가위와 집게)에 적합한 악기 압력솥의 소독을해야합니다. </li><li> 편안하게 지역 IACUC 프로토콜에 따라 기증자 마우스를 안락사시켜야. 동물이하기 전에 죽은 있는지 확인합니다. </li><li> 복막 캐비티에 액세스 할 수있는 중간 선 절개를합니다. 노출을 개선하기 위해 필요에 따라 피부 플랩이 반영 될 수 있습니다. </li><li> 작은 창자를 창자를 빼내다와 Treitz의 인대에 단지 말초을 나눕니다. 샤프하고 부드러운 무딘 절개를 사용하여 장간막에서 작은 창자를 분리합니다. ileocecal 접합을 파악하고 이에 대한 근위 작은 창자 5mm를 나눕니다. </li><li> 가위를 사용하면 (Invitrogen, 안티 - 안티) 10 ML 4 ° C, 멸균 행크스 &#39;버퍼 생리 (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X 항생제 - 항 곰팡이를 배양 접시에있는 antimesenteric 국경을 따라 길이 솔루션을 장을 엽니 다. 로 연 장에서 대변을 해제합니다부드러운 교반 한 다음 10 4의 ML ° C, 멸균 HBSS / 1X 안티 - 안티을 15ml 원심 분리기 튜브로 열린 장을 전송하기 만하면됩니다. </li><li> 4 10 ML에 열려있는 장을 세 번 씻어 ° C, 테스트 튜브에 안티 - 안티 살균 HBSS / 1X. 각 세척은 30 초에 15 ML 튜브의 약한 흔들림을 수행 할 수 있습니다. 진동 후, 장 조직은 관의 바닥에 가라. 중간 엽 파편이 부동 물질을 폐기하십시오. pipet을주의 깊게 세척 솔루션을 제거합니다. </li><li> 4 10 ML과 배양 접시에있는 세탁 장을 이기다 ° C, 멸균 HBSS / 가위를 사용하여보다 1mm 제곱 조각에 1X 안티 - 안티. 자동 pipet으로 다진 자료를 수집하고 테스트 튜브에 넣습니다. </li><li> 8 분 500 rpm으로 튜브를 원심 분리기. 뚱뚱하고 mesenchyme 포함되어있는 표면에 뜨는을 폐기하십시오. </li><li> 멸균 HBSS / 1X 안티 - 안티 플러스 0.125 MG / ML dispase (Invitrogen) 및 800 단위 / m의 10 ML과 다진, 씻은 자료를 소화리터 collagenase 타입 1 (워싱턴, 레이크 우드 NJ). 소화 솔루션의 40 ML를 준비하려면 dispase, collagenase의 142 밀리그램의 5 밀리그램을 무게, 40 ML의 볼륨으로 살균 HBSS를 추가 할 수 있습니다. 갓 때마다 organoid 단위 준비가되어이 솔루션을 준비하고, 사용하기 4에 ° C까지 준비해 놓아요. 단계 1.8에서 직접 펠릿으로 소화 솔루션을 추가합니다. </li><li> 20 분에 37 ° C에서 소화 솔루션과 다진, 씻은 재료를 포함하는 테스트 튜브를 품다. </li><li> 테스트 튜브를 검색하여 추가로 10 ML의 pipet으로 분쇄하여 소화 조직을 중단. 균일 한 모양을 얻을 때까지 20-50 시간 사이에 반복합니다. </li><li> 800 rpm으로 5 분 동안 테스트 튜브를 원심 분리기. 하나의 셀을 포함하는 표면에 뜨는을 폐기하십시오. </li><li> 4 ° C, 멸균 Dulbecco의 수정 된 이글 중간 (DMEM, Invitrogen) 플러스 10% 브이 / v 열 inactivated 태아 소 혈청 (HI-FBS, Invitrogen)의 10 ML과 소화 반응을 중지합니다. pelle을 Resuspendt와 튜브를 흔들. </li><li> 800 rpm으로 5 분 동안 테스트 튜브를 원심 분리기. 마지막 몇 방울까지 자동 pipet으로 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 resuspending 방지하기 위해 지난 몇 방울을위한 일회용 플라스틱 pipet을 사용합니다. </li></ol> 2. Polyglycolic 산성 발판으로로드 <ol><li> 로 참조에 설명, nonwoven polyglycolic 산 (다공성&gt; 95 %, Concordia는 섬유, 코번 트리의 RI 2 mm 시트의 두께, 60 MG cm-3 벌크 밀도)에서 양식 2 mm 길이 5 mm 외경 원통 공사장 공중 발판. 4. </li><li> 증류수에 70 % 에탄올로 만든 가위로 팁을 일회용 1000 마이크로 리터의 pipet의 말초 2mm를 잘라. </li><li> 4 잘 문화 판에 비계를 놓으십시오. 처음 루멘으로하고 바깥 쪽 표면에, 1000 마이크로 리터의 pipet으로 발판 위에 organoid 단위를로드합니다. 루멘의 코팅을 보장하기 위해 집게를 사용하십시오. 중단 또는 폴리머의 원통형 모양을 깨뜨하지 마십시오. </리&gt; </ol> 3. 호스트 마우스에 주입 <ol><li> 기증자 가능한 경우와 같은 배경 syngeneic 호스트 마우스를 사용합니다. 그렇지 않으면, 면역 저하 nonobese의 당뇨병 환자 (잭슨 연구소, 새크라멘토 CA) 동물 / 심한 결합 immunodeficient 또는 NOD / SCID를 사용합니다. </li><li> isoflurane과 전신 마취를 유도. , 사립를 면도하고 마우스의 복부를 내리면 t. </li><li> 복막 캐비티에 입학을 얻기 위해 5mm 중간 선 절개를합니다. 확인하고 조심스럽게 큰 omentum을 골자를 빼 버리다. omentum로로드 된 폴리머를 배치하고 조직과 함께 포장. omentum을 찢어하지 마십시오. </li><li> 5-0 monocryl의 봉합과 함께 omentum에 폴리머를 고정합니다. 부드럽게의 해부학 위치로 포장 폴리머로 omentum를 교체하십시오. </li><li> 4-0 vicryl 봉합을 사용하여 레이어의 복부 절개를 닫습니다. 근육 폐쇄를 실행하고 절개 아래 복부 내장을 손상하지 돌. 피부 중단 봉합을 사용하여. </li><li> 절개에 인접 피하 wheal으로 멸균 물에 2 밀리그램 / kg 케토 프로 펜 (Ketofen, 포트 닷지 동물 건강)와 수술 후 진통제를 관리 할 수​​ 있습니다. 동물은 매일 평가해야하고 동물이 통증이나 고통의 흔적을 보여주는 경우 케토 프로 펜의 추가 투여는 수술 후 2 일에 실시 될 수 있습니다. 세 번째 수술 일까지, 동물 완전히 통증이나 고통의 증거도없이 복구 할 수 있어야합니다. 통증이나 고통이 포스트 수술 일 3 지속되면, 이것은 비정상적인 것으로 간주되고 IACUC과 동물 보호 시설 프로토콜에 따라 해결해야합니다. </li><li> 회복 할 수있는 마우스와 조직 - 엔지니어링 소장은 4 주 동안 성장 할 수 있습니다. 쥐 수유 (랩 다이어트 5001, PMI 영양, 세인트 루이스 MO) 5 ML (하이테크 Pharmacal, Amityville NY)에 1:100 희석 당 Septra 200 밀리그램 / 40 MG와 물 동물 광고 libitum 액세스를 제공합니다. </li></ol> 4. 수확 <ol><li> Humanely 사주 주입 한 후 호스트 동물을 안락사시켜야. </li><li> 원래 절개을 열고 피부를 반영는 복막 캐비티에 대한 액세스를 용이하게 cephalad. </li><li> 근육 레이어를 열고 조직의 세계로 조직 - 엔지니어링 구조를 확인합니다. </li><li> 날카로운 해부를 사용하여 intraabdominal 내장의 구조에 adhesions을보십시오. </li><li> 설치하기 파라핀을위한 포르말린에 구조를 수정, 또는 실시간 PCR 또는 단백질 분리와 같은 생화학 assays에 대한 새로운 조직을 사용합니다. </li></ol>

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	<li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).</li><li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+bowel+syndrome:+epidemiology+and+etiology.">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).</li><li>Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. 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Int. 23, 379-390 (2007).</li><li>Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+corrective+pullthrough+surgery+in+a+mouse+model+of+Hirschsprung's+disease.">A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease.</a> J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).</li><li>Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+regarding+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis.">Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).</li><li>Shew, S. 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U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+short+bowel+syndrome:+the+cost+of+comprehensive+care.">Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care.</a> Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).</li><li>Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+and+multivisceral+transplantation+in+children.">Intestinal and multivisceral transplantation in children.</a> Ann. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 organoid 단위 온 발판 접근 방식을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기위한 프로토콜을 제시한다. 가장 중요한 단계는 organoid 단위의 준비가 일반적입니다. 주의 적절하게 청소하고 기계적으로 조직을 처리하는 이동해야하지만 소화를 수행 한 후에 동일한주의 (단계 1.11) organoid 단위를 overdigest 또는 overtriturate하지 않도록해야합니다. 이 작업을 수행하는 경우, organoid 단위...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 114170-112 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Gibco </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase의 타입 1 </td><td> 워싱턴 </td><td> LS004194 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM 높은 포도당 1X </td><td> Gibco </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 열 inactivated FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td></td></tr><tr><td> Biofelt 백퍼센트 PGA </td><td> Concordia는 의료 </td><td> FELT01-1005 </td><td> 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오.4 </td></tr><tr><td> 폴리-L-락트산 </td><td> Durect </td><td> B6002-1 </td><td> 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오. 4 </td></tr><tr><td> I 콜라겐, 쥐 꼬리 입력 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3867-1VL </td><td> 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오. 4 </td></tr><tr><td> 케토 프로 펜 100 MG / ML </td><td> 요새 닷지 동물 건강 </td><td> 71 - KETOI - 100-50 </td><td></td></tr><tr><td> LabDiet 5,001 쥐 급식 </td><td> LabDiet </td><td> 5001 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML, USP 당 Septra 200 밀리그램 / 40 밀리그램 </td><td> 하이테크 Pharmacal </td><td> 50383-824-16 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane, USP </td><td> 피닉스 제약 </td><td> 57319-507-06 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering of the intestine in a murine model

조직 - 엔지니어링 소장 (TESI)가 성공적으로 40일 이내에 수술 전 근력로 돌아 발생, 거대한 작은 창자 절제술 후 루이스의 쥐를 구출하는 데 사용되었습니다. 인간 1, 대규모 작은 창자 절제술 짧은 창자 증후군, 기능 malabsorptive이 발생할 수 있습니다 중요한 병적 상태, 사망률, 그리고 비경 영양 의존도, 간 장애 및 간경변, 그리고 multivisceral 장기 이식의 필요성 2.이 문서에 포함 의료 비용을 수여 국가는, 우리는 마우스 모델에서 조직 - 엔지니어링 소장을 만들기위한 우리의 프로토콜을 설명하고 문서화 다세포 organoid 단위 온 발판 방식으로. Organoid 단위는 점막과 중간 엽 모두 요소를 포함하는 장에서 파생 다세포 집계, 3 장 줄기 세포 틈새 시장을 유지하는 사이의 관계입니다. 지속적인와 미래의 연구에서 4로 우리 기술의 전환마우스는이 종에서 사용할 수있는 유전자 변형 도구를 이용하여 TESI 형성하는 동안 관련된 프로세스의 조사를 허용합니다. 면역 저하 마우스 종자의 5 가용성도 우리 인간의 장 조직에 기술을 적용하고 같은 인간 TESI의 형성을 최적화 할 수 있도록 허용합니다 인간에의 전환하기 전에 마우스 이종 이식. 우리의 방법은 좋은 제조 연습 (GMP) 시약 및 이미 인간의 환자에 사용하기 위해 승인, 따라서 decellularized 동물의 조직에 의존 접근 방식에 비해 상당한 장점을 제공 한 자료를 사용하고 있습니다. 이 방법의 궁극적 인 목표는 짧은 창자 증후군의 재생 의료 치료 전략으로 인간의 번역입니다.

그림 1은 여기에 설명 된 프로토콜에 대한 전반적인 스키마를 보여줍니다. 이 프로토콜의 최종 결과는 동일한 구조를 표시하는 루멘, 점막, submucosa, 그리고 muscularis. 그림 2A를 둘러싼 것은 시작 폴리머 비계. 그림 2B에 비해 전형적인 세계를 보여줍니다과 조직 - 엔지니어링 손쥐 소장의 세계 또는 구형 구조입니다 급의 루멘을 나타 내기 위해 bivalved. 그?...

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

tissue-engineering-of-the-intestine-in-a-murine-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K 조회수.  Keck School of Medicine of the University of Southern California. 이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.

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Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

연구

발생학

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

생체공학

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

에 대한 쥐의 내시경<em&gt; 생체</em&gt; 발암 및 소장의 평가의 멀티 모달 이미징 상처 치유 및 염증

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

의학

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

창자 허혈 - 재관류 손상의 쥐 모델

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

면역학 및 감염병학

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

생물학

확립된 쥐 대장에 대한 장 염증의 상피 효과

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

저자 스포트라이트: 확립된 쥐 결장체에 대한 장 염증의 체외 상피 효과 연구  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

요약

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확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

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