Name: mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development at JoVE.com

We gratefully acknowledge Dr. Deborah L. Gumucio as our advisor and for her invaluable support in defining the culture and imaging methods. We also thank Dr. Jim Brodie, Dr. Hong-Xiang Lu, Dr. Charlotte Mistretta, and Dr. Ann Grosse for their contributions to the development of the whole intestine organ culture system. Helpful discussions on imaging provided excellent advice from Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski and Sasha Meshinchi. All imaging was performed in the Microscopy and Image Analysis Laboratory at the University of Michigan. Funding support was provided by NIH R01 DK065850.

참고 : 모든 쥐가 실험 동물 의학 미시간 의과 대학 단위의 대학의 승인을 동물의 사용 및 관리에 대학위원회의 지침에 따라 프로토콜을 사용하여 인도적으로 처리 하였다. 1 전체 장기 문화 시스템 <ol><li> 미디어 및 문화 판의 제조 <ol><li> 조직 배양 후드에서 스톡 병 BGJb 매체 5 mL를 제거하고, 펜 / 스트렙토 5 mL를 추가한다. 5 밀리그램 / (PEN / 스트렙토)와 BGJb 매체의 49 ml의 아스코르브 산 1 ㎖를 첨가하여, 50 ㎖의 원뿔형 튜브에 미디어 콘텐츠의 작업을 준비한다. </li><li> 트랜스 웰 아래의 각각 1 ㎖에 첨가하여 6 웰 배양 플레이트를 준비한다. 참고 : 모든 6 트랜스 웰을 사용하지 않을 경우, 나중에 사용하기 위해 신선한 무균 6 웰 플레이트에 추가 트랜스 웰을 이동합니다. 세 10cm 무균 배양 접시에 각각 BGJb 미디어를 작업의 3 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 해부를위한 준비 <ol><li> 70 % etha에서 해부 도구를 적시와 NOL 작업하는 동안 청소 도구를 보관하십시오. </li><li> 큰 얼음 양동이 해부 영역을 설정하고 6 웰 배양 판과 얼음에 BGJb 미디어와 10cm 배양 접시를 놓습니다. 해부와 문화에 대한 장을 준비하는 동안 가능한 한 많은 얼음에 작업 할 수 있습니다. </li><li> 태아 창자 수확 용 자궁 전위에 의해 이소 플루오 란 (100 μL) 이전 euthanization에 함께 실에서 성인 여성 생쥐를 마취. </li><li> 자신의 어머니로부터 태아를 수확 한 후, 각각의 태아가 신중하게 차트 13을 준비 Theiler에 따라 무대. 정기적으로 하나의 쓰레기 내에서 관찰되는 발달 단계에서 최대 24 시간의 변화에​​ 각 태아의 나이를 결정하는 포스트 성교 일에 의존하지 마십시오. </li></ol></li><li> 태아 내장의 해부 <ol><li> 창자를 제거하기 전에 잘린 태아를 안락사. </li><li> 괞 찮아 후 1 배 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 각 장을 해부BGJb 미디어 작업과 10cm 페트리 접시로 CE. </li><li> 조심스럽게 배에서 비장과 위장과 상부 십이지장에서 췌장을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 소장은 곧게 할 수 있도록 가능한 한만큼의 연결을 분리 한 많이 붙어있는 대망을 떠나 돌보는 대망 구분합니다. 참고 : 부드럽게 내강 내용이 소장을 통과하고 절단 끝에서 추방 할 수 있도록 세 동일한 세그먼트로 장을 분리 장 E14.5보다 나이 또는 사람들은 더 이상 24 시간 이상 배양하고 들어. 그러나, 배양을 위해 E13.5에 앞서, 장막 제대로 소장의 길이에 걸쳐 확장 할 수 있도록 부위의 3 세그먼트를 분리하기 전에 배양 한 후 24 시간까지 기다린 시작했다. </li><li> 문화 판 (1.1.2)의 트랜스 웰에 장 조각을 전송하기 위해 입 피펫을 사용합니다. </li><li> 그들은 transwel에 걸쳐 직선이되도록 필요에 따라 조심스럽게 내장의 위치를리터. 주 : 창자가 튜브를 통해 내강 내용을 이동 시작하면 장에있는 꼬임 장에 백업 및 손상의 원인이됩니다. </li></ol></li><li> 문화 및 치료 <ol><li> , 트랜스 웰 아래에서 용지를 제거 트랜스 웰에서 (추가 재조합 단백질이나 약물 억제제와 미디어 작업) 치료 미디어 700 μl를 추가합니다. </li><li> 내장의 상단에 치료 미디어 적가의 300 μl를 추가하고 트랜스 웰을 흡수 할 수 있습니다. 필요에 따라 내장 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 치료 시약의 반감기에 따라 적어도 하루에 한 번 또는 더 자주 치료 미디어를 변경합니다. </li></ol></li><li> 치료 시약의 지역화 된 소스 단백질 젖 아가 로스 비드의 제조 <ol><li> 스토리지 컨테이너에 아가로 오스 비즈를 재현 탁하고, 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 아가 로스 비드의 100 μl를 전송합니다. </li><li> 멸균 1X pH가 튜브의 남은 볼륨을 채우기osphate 완충 식염수 (PBS)와 그들을 씻어 구슬을 섞는다. 몇 분 구슬이 바닥에 정착 한 후 구슬의 상단에에서 PBS를 피펫 할 수 있도록하는 랙에 미세 원심 분리 튜브를 놓습니다. 멸균 1X PBS와 미세 원심 분리 튜브를 채우고 두 번 더 세척 과정을 반복합니다. </li><li> 두 번 치료를 원하는 농도로 관심의 단백질을 준비합니다. </li><li> 배 단백질 주식의 5 μL로 세척 아가로 오스 비드 5 μl를 혼합하고 부드럽게 단백질 구슬을 선동. 부드럽게 매 10 ~ 15 분을 혼합, 1 시간 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. </li><li> 장내에 구슬을 배치하기 전에 멸균 1X PBS에 잠시 구슬을 씻어. </li></ol></li><li> 아가로 오스 구슬의 배치 <ol><li> 부드럽게 당겨 모세관 바늘 입 피펫을 사용하여 내장의 상단에있는 아가로 오스 비드를 배치합니다. 거친 취급 장에 손상을 부상당한 지역에 융모 발달을 차단하므로 매우주의 구슬을 놓습니다. </li><li> 창자의 연동 운동과 배양 시간이 지남에 따라 내장의 롤 오프한다 배치 된 구슬의 절반 정도를 받아야하기 때문에 분석에 필요한 두 배나 많은 구슬을 놓습니다. </li></ol></li><li> 배양 내장의 고정 <ol><li> 조심스럽게 트랜스 웰 아래에서 치료 용지를 제거하고 3 분 동안 건조한 공기에 내장 할 수 있습니다. </li><li> 다음, 정착 시간의 나머지 정착액 2 ㎖와 소장의 상부 커버, 2 분 동안 트랜스 웰 아래 정착액 1 ㎖를 추가한다. 4 ° C 또는 실온에서 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 O / N으로 수정합니다. </li></ol></li></ol> 고정 창자의 2 이미징 <ol><li> Wholemount 영상 <ol><li> 1X DPBS 100 ㎕와 슬라이드 (내생​​ 형광 포함) 전체 창자를 놓습니다. 부드럽게 장을 마련하기 위해 집게를 사용합니다. </li><li> 조직 개월을주의 깊게 70 % 글리세롤 100 μl를 DPBS를 제거하고 즉시 추가 실험실 조직을 사용하여투명 재 및 이미징의 가능한 깊이를 증가시킨다. NOTE : 소장의 상기 관통 원하는 경우, 대신에 70 % 글리세롤에 실장 부위에, 10 ~ 30 분 동안 초점 클리어 용액 몇 방울의 소장 소크. 초점 클리어 솔루션을 피펫 및 마운트 클리어와 장을 마운트합니다. </li><li> 모델링 점토로 커버 슬립의 네 모서리를 각각 담궈 부위를 평탄화로부터 커버 슬립을 유지하는 슬라이드 및 커버 슬립 사이에 스페이서로서 사용하는 점토를 소량 픽업. </li><li> 면봉으로 적용 녹은 VALAP와 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉합니다. </li><li> 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 내장. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li></ol></li><li> (장 구조의 단면도에 대한) 고정 장의 Vibratome의 절편 <ol><li> 작은 플라스틱 금형 7 % 아가로 오스에 포함 된 장에 (10 × 10 × 15mm) 허용 아가로 오스 블록냉각 및 응고. </li><li> 순간 접착제와 vibratome 수집 단계에 플라스틱 금형 및 접착제 아가로 오스 블록에서 아가로 오스 블록을 제거합니다. </li><li> 얼음 차가운 1X DPBS와 컬렉션 무대를 채 웁니다. </li><li> 100 ~ 150 μm의 사이에 두께 부분을 잘라. 두꺼운 부분은 단면에 깊은 시각화 (2.1.2 참조) 청산 솔루션을 사용하십시오. </li><li> 4 ° C에서 저장을위한 6 웰 플레이트의 우물에 수집 단계부터 vibratome 섹션을 붓는다. </li></ol></li><li> 고정 vibratome 단면 조직의 면역 형광 염색 <ol><li> 1X DPBS와 함께 24 웰 플레이트에 잘 당 5-12 vibratome 섹션을 배치합니다. </li><li> 1X DPBS를 제거하고 잘 당 permeabilization 용액 500 μl를 추가합니다. 부드럽게 실온에서 25 분 동안 샘플을 바위. </li><li> permeabilization 후 1X PBS로 샘플을 3 회 씻는다. </li><li> 차단 솔루션의 500 μL에 적어도 30 분 동안 샘플을 차단합니다. </li><li> 차단, 전자 후차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μL와 차단 솔루션을 체인지와 4 ° CO / N에서 샘플을 유지합니다. 참고 : 냉동 식품 및 파라핀 섹션에서 잘 작동 차 항체 희석은 일반적으로 그러나 일반적으로 프로토콜 (예를 들어, BrdU의) 잘 작동하지 않는 핵 항원 검색을 필요로하는 항체도 vibratome 섹션에서 잘 작동합니다. </li><li> 다음 일, 차단 솔루션으로 15 분 동안 샘플 때마다 세 번 씻는다. </li><li> 세안 후, 차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μl를 적용합니다. 실온에서 2 시간 45 분 동안 샘플을 빛으로부터 형광을 보호하고 바위에 알루미늄 호일에 24 웰 플레이트를 감싸. </li><li> 15 분마다 1X PBS로 샘플을 3 회 세척하고 2.4 절에 설명 된대로 슬라이드 vibratome 섹션을 탑재합니다. </li></ol></li><li> vibratome 섹션을 장착 <ol><li> vibratome 두 번 STI의 얇은 조각을 절단하여 장착 슬라이드를 준비CK 테이프와 슬라이드의 긴 측면을 따라 그들을 배치. </li><li> 조심스럽게 1X PBS 100 ㎕의 드롭 슬라이드에 두 번 스틱 테이프 사이에 5 ~ 10 vibratome 섹션을 배치합니다. </li><li> 모든 섹션을 펼치고 슬라이드에 걸쳐 단일 층으로 그들을 밖으로 확산. </li><li> 평면 앉아에서 커버 슬립을 방지 할 수 초과 아가로 오스 또는 고르지 않은 비트를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 vibratome 섹션 주위에서 초과 1X PBS를 흡수하기 위해 연구소 조직을 사용합니다. </li><li> vibratome 부 위에 장착 수성 매질의 드롭을 추가 한 후 커버 슬립. </li><li> VALAP가 면봉으로 적용 용융와 슬라이드로 된 커버를 밀봉. </li><li> 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 vibratome 섹션. 영상 시스템의 선택에 대한 더 자세한 설명을 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 전체 창자의 3 라이브 영상 창자 fetuse에서 수확연결된 대망가 그대로 유지와의 E12.5 후, 성공적으로 위의 시스템을 사용하는 문화에 융모을 개발한다. 따라서이 시스템은 생체 시간 경과 형태 형성의 3 차원 뷰를 위해 재구성 될 수있는 현상 장의 라이브 Z 단면 영상의 캡쳐를 허용한다. <ol><li> 라이브 영상 설정 <ol><li> 좋은 메쉬 화면으로 개별 폴리 카보네이트 막을 부착 순간 접착제를 사용합니다. 이 수직으로 공 초점 현미경의 침지 렌즈 아래 장소에 소장을 보유하는 지원 발판을 제공합니다. 라이브 영상 현미경의 선택에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. </li><li> 중앙 잘 문화 판에 메쉬 스크린을 놓습니다. </li><li> 폴리 카보네이트 막에 해부 장을 놓고 양쪽 끝에 순간 접착제 한 방울을 추가 할 수 있습니다. 장을 부착시킬만큼의 접착제를 사용하지만 코트 그것! </li><li> 폴리 카보네이트 아래 페놀 레드의 문화 미디어 무료 추가중심도의 문화 판에서 막. </li><li> 습도를 제공하도록 배양 플레이트의 외연에 물을 첨가. </li><li> 이미징 동안 대장의 움직임을 제어하는​​ 미디어 3 ㎖에 1X PBS에서 자일 라진 (xylazine)의 다섯 솔루션 : 태아 소장은 문화 수축의 연동과 같은 파도를 겪는 때문에, 하나의 100 μl를 추가합니다. 이 투여 량은 융모 발달을 손상시키지 않고 약 8 ~ 10 시간 동안 장 움직임을 제어합니다. </li><li> 소장의 가로보기의 경우, 3 ~ 4 % 아가로 오스 솔루션의 라이브 창자를 포함하고 vibratome에 두꺼운 부분 (150 ~ 500 μm의) 잘라. 절단되는 소장의 강성 아가로 오스의 강성을 일치하고 경험적으로 발달 단계를 결정했다. 일반적으로, 3 % 아가로 오스 솔루션은 E14.5 미만의 창자에서 잘 작동하고 4 % 용액은 창자 E15-E16에 적합합니다. </li><li> (섹션 3.1.1에서와 같이) 메시 스크린에 부착 된 폴리 카보네이트 멤브레인 vibratome 섹션을 붙인문화는 제 3.1.2-3.1.6에서 설명. </li><li> 동조 테이블 직립 스탠드 이광자 형광 공 초점 현미경 (690-1,040 nm의 사이 여기 레이저)를 이용하여 실시간 이미징을 수행. </li><li> 이광자 레이저 GFP 신호 최상의 해상도 깊은 용입을 제공 내지 900에 동조. 이미징 동안은 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또한, 가능한 최저로 발광 레이저의 파워를 설정하는 조직 손상을 줄여 준다. 통상적으로, GFP의 좋은 자극을 구하는 이광자 레이저에 12 % 전력을 사용한다. </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial conflicts to disclose.

동적 특성 및 개발 소장의 복잡한 조직 상호 작용은 이러한 형태 발생 이벤트의 전체 감사의 마음을 가지고 3D 시각화가 필요합니다. 이미징 기술 진화로, 능력 개발 / 개선과 함께, 기관 형성기 동안 공간 의사 소통과 상호 작용의 이해가 크게 향상되어 자세히 융모 형태 형성을 검사합니다. 전체 창자 배양 방법에 대해서도 테스트되었지만, 트랜스 웰 시스템은 긴 배양 시간?...

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells3. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes1. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons4. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.52. As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue6.
Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters11. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.
Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

<table><tbody><tr><td>Fine dissecting forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>&amp;nbsp;11254-20</td><td>2 pairs</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x sterile Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Costar&amp;nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm petri dishes</td><td>Falcon</td><td>&amp;nbsp;451007</td><td></td></tr><tr><td>Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes</td><td>Corning Costar&amp;nbsp;</td><td>3428</td><td>6 inserts per plate</td></tr><tr><td>BGJb media</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;15140</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A0278</td><td>make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;21-180-10</td><td>remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 &amp;micro;l pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.</td></tr><tr><td>6 inch glass pasteur pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary Tubes</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>pull to needles</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td>made in 1 x PBS, pH to 7.3</td></tr><tr><td>Culture plates</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Fine mesh stainless steel screen</td><td>purchase at hardware store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate membranes</td><td>Thomas scientific&amp;nbsp;</td><td>4663H25</td><td>alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports</td></tr><tr><td>Instant glue</td><td>purchase at hardware store</td><td>gel based preferrably</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm plates</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>7% agarose</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;A9414</td><td>prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath</td></tr><tr><td>minutien pins</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free media (DMEM)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&amp;nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free</td></tr><tr><td>3-4% agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414</td><td>prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath</td></tr><tr><td>Imaging of fixed intestines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name of Material/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>vaseline</td><td>purchase at pharmacy</td><td></td><td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td></tr><tr><td>lanolin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>L7387</td><td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td></tr><tr><td>paraffin</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td></tr><tr><td>70% glycerol in 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear and Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&amp;nbsp;F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>purchase at art supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>double stick tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cotton applicator swabs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)</td><td>Tissue Tek&amp;nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>slides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lab wipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>lint free delicate task wipe</td></tr><tr><td>Theiler staging chart&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf&quot;&gt;http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Leica SP5X confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Used to conduct the live imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMI 6000 stand&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Used to conduct the live imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Aqueous mounting medium (Prolong Gold)</td><td>Molecular Probes&amp;nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Name of Material/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Costar</td><td>&amp;nbsp;3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T-8787</td><td>used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td></td><td></td><td>used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development

태아 소장에서 대부분의 형태 형성 과정은 발달 단계를 통해 변화의 스냅 샷을 제공하는 고정 된 조직의 얇은 섹션에서 유추되고있다. 얇은 시리얼 섹션에서 세 가지 차원 정보로 인해 완벽하게 시리얼 섹션을 재구성 시리얼 섹션을 통해 조직의 올바른 방향을 유지의 어려움의 해석에 도전 할 수 있습니다. 그로 의해 외. 최근 연구 결과, 2011은 한 부위의 현상 융모의 형태 형성을 이해 삼차원 정보의 중요성을 강조. 단독 표지 장 세포의 3 차원 재구성은 장 상피 세포의 대부분은 모두 혀끝과 기저 표면에 문의하는 것이 보여 주었다. 더욱이, 상피의 선 단면에서 액틴 세포 골격의 삼차원 재구성 장내 루멘 연속이며 그 보조 루멘 (S)의 이슈임을 입증ectioning. 그 두 점은, 장 상피 세포에서 interkinetic 핵 마이그레이션 시연과 함께 pseudostratified 상피 세포로 개발하는 장 상피 세포를 정의하고 이전에 한 생각으로 계층화 없습니다. 상피 세 차원을 관찰 할 수있는 능력은이 점을 증명하고 태아 소장에서 상피 형태 형성을 재정에 정액이었다. 다중 광자 이미징 기술 및 3 차원 재구성 소프트웨어의 발전으로, 능력은 급속히 향상되고 장기 개발, 그대로 시각화. 이광자 여기는 고해상도 조직에 덜 파괴적인 침투를 깊게한다. 두 광자 이미징 및 월튼 등.에 전체 태아 마우스 내장의 3 ​​차원 복원은 2012 융모 파생물이의 패턴을 정의하는 데 도움을 주었다. 여기에서는 허용하도록 그 배양 시스템의 융모와 확장 생체 개발을 허용 전체 기관 배양 시스템을 설명창자는 세 가지 차원으로 자신의 개발 기간 동안 이미지를 만들 수 있습니다.

이 시스템은 약리학 적 시약 또는 재조합 단백질과 시그널링의 조작을 가능으로 태아 내장의 전체 이식편의 배양은, 장 개발 좌표 시그널링 분자의 위치, 분포, 및 지속 시간의 분석을 허용한다. (월튼 외로부터 재생도 1a., 2012) 트랜스 웰 배양 시스템 (2)은 가능한 조직에 약물이나 단백질 침지 아가 로스 비드를 배치함으로써, 로컬 신호 원을 확립하게 공기 - 액?...

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Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

mouse-fetal-whole-intestine-culture-system-for-ex-vivo-manipulation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

14.8K 조회수.  University of Michigan. Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine. 

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

연구

발생학

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

생체공학

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

암 연구학

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관내 빨기-위닝 전환 반복

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

면역학 및 감염병학

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

생물학

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Rat Intestinal Crypts 분리 및 장 오가노이드 생성

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. Accordingly, patient-derived organoids are used for disease modeling, drug discovery, and personalized treatment screening. Mouse intestinal organoids are commonly utilized to understand aspects of both intestinal function/physiology and stem cell dynamics/fate decisions. However, in many disease contexts, rats are often preferred over mice as a model due to their greater physiological similarity to humans in terms of disease pathophysiology. The rat model has been limited by a lack of genetic tools available in vivo, and rat intestinal organoids have proven fragile and difficult to culture long-term. Here, we build upon previously published protocols to robustly generate rat intestinal organoids from the duodenum and jejunum. We provide an overview of several downstream applications utilizing rat intestinal organoids, including functional swelling assays, whole mount staining, the generation of 2D enteroid monolayers, and lentiviral transduction. The rat organoid model provides a practical solution to the need of the field for an in vitro model which retains physiological relevance to humans, can be quickly genetically manipulated, and is easily obtained without the barriers involved in procuring human intestinal organoids.

저자 스포트라이트: Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids(쥐 장 오가노이드의 생성 및 조작)  

Here, we present a protocol to generate rat intestinal organoids and use them in several downstream applications. Rats are often a preferred preclinical model, and the robust intestinal organoid system fills the need for an in vitro system to accompany in vivo studies.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템

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조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관내 빨기-위닝 전환 반복

그만큼

위한 시스템

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작