화이자 제한에서 박사 손튼에 자금 것은 기꺼이 인정하고 있습니다.

1. 수집, 보관 및 세럼과 Bronchoalveolar 세척 유체의 작성 <ol><li> 4에서 응고하는 데 사용할 ° C 및 -20시 aliquots 같은 매장 혈청 ° C 이전에 혈액을 허용하여 치료 혈액 샘플에서 혈청 수집합니다. Bronchoalveolar 세척 유체 (BAL)도 -20 ° C.에 aliquots로 저장해야합니다 참고 : 스토리지의 혈청과 aliquots가 반복 테스트 동안 샘플 동결 - 해동 반복에 의한 대상 항원의 저하의 가능성을 제한으로 BAL. </li><li> 영유권 샘플 및 14,000 rpm으로 1 분 용 vortexing하고 원심 분리기에 의해 철저하게 혈청 및 BAL 샘플을 섞는다. </li><li> 인간 혈청 시료의 일상 테스트를 위해 조직 배양 매체 (중의)와 혈청 1시 1분 (V / V)를 희석. 중의는 RPMI-1640 배지, 10 % (V / V) 소태아 혈청, 200mM L-글루타민 솔루션의 1 % (V / V) 및 방부제 등 나트륨 azide (0.02 % W / V)로 구성되어 있습니다. 매체는 사전에 준비하고 몇 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. dilut 100 μl를 적용LFD에 에드 묘약. </li><li> 인간 BAL 체액을 위해, 그리고 동물 모델에서 BAL 체액을 위해, 아니 미리 치료, LFD으로 깔끔한 샘플을 100 μl를 적용합니다. </li><li> 동물 모델에서 혈청, 인산은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 끓는 물에 목욕, 14,000 rpm으로 5 분을위한 원심 분리기의 3min위한 열을 4% (W / V)를 포함하는 식염수를 버퍼로 혈청 1시 2분 (V / V)를 희석, 100을 적용 LFD 장치에 스트레이트로 뜨는의 μl. </li></ol> 2. 측면 흐름 장치로 혈청 및 BAL의 응용 <ol><li> 실온 (23 ℃)에서 측면 흐름 장치를 보관합니다. 이 온도에서는 장치는 12 개월 동안 안정. 수준의 표면에 자신의 파우치와 장소에서 장치를 제거합니다. </li><li> 멸균 피펫 팁을 사용하여 장치의 릴리스 포트에 사전 처리 혈청 또는 스트레이트 BAL 시료 100 μl를 적용합니다. </li><li> 분석은 테스트 결과가 기록되어야하는 시간에 실온에서 15 분, 실행 여유를 두십시오. 참고 : 초 이내에 유체가 SE 될 것입니다욕실이 관찰 윈도우에서 nitrocellulose 막 따라 모세관 현상에 의해 마이 그 레이션합니다. </li></ol> 3. LFD 결과 녹음 및 통역 <ol><li> LFD는 내부 제어 라인 (플라스틱 하우징에 문자 C로 표시)과 테스트 라인 (글자 T로 표시)으로 구성되어 있습니다. 제어 라인은 항상 혈청이나 BAL 샘플에 관계없이 Aspergillus 항원에 나타납니다. 이것은 분석이 제대로 실행되었는지 보여줍니다. </li><li> Aspergillus 항원이 혈청이나 BAL 샘플에 존재하는 경우, 테스트 라인은 또한 예제 응용 프로그램 중 15 분 이내에 나타납니다. 테스트 라인의 강도는 샘플에서 Aspergillus 항원 선물의 양에 비례하기 때문에, 테스트 라인 (+) 약한 양성으로 나타날 수, 중간 양성 (+ +) 또는 강한 긍정 (+ + +) . 그러나, 어떠한 긍정적인 테스트 라인은 관계없이 강도의, 예제에서 Aspergillus 항원의 존재를 나타내는 것입니다. 일 년Aspergillus 항원의 전자 부재도, 테스트 라인은 표시되지 않습니다, 그리고 결과는 부정적으로 기록됩니다 (-). </li></ol> 4. 대표 결과 BAL 및 혈청 샘플과 부정, 약한 긍정, 적당한 긍정, 강한 긍정 LFD 결과의 대표적인 예는 그림 1에 표시됩니다. (AML) 환자 EORTC / MSG 진단 기준에 따라 진단 급성 골수양 백혈병에서 BAL 유체를 사용하여 항원 양성 LFD 테스트 (약한와 강한) 또는 부정 LFD의 시험 결과는 표 1에 표시됩니다. 해당 임상과 mycological (galactomannan 문화) 데이터, 각 환자에 대한 성 Bartholomews 병원 8 시에 개발된 Aspergillus 특정 PCR 검사의 결과가이 표에 포함되어 있습니다. 질병의 진단은 호스트 요인 (neutropenia, 코르티 코 스테로이드의 장기간 사용, 기타 인정 T-세포 immunos 치료에 기초되었다uppressants), 임상 기준 및 BAL에 대한 GM의 양성 (여기서는 GM의 인덱스 값&gt; 0.8으로 정의). 2002 년 EORTC / MSG 가이드라인 10, 환자 12, 13 및 16에서 호스트 요인 및 임상 기준이나 GM의 양성에 기초하여 &#39;가능한&#39;아이오와 진단했다. 각각 임상 데이터 및 균류학에서 증거를 지원 동반하지 않는 한 개정 (2008) EORTC / MSG 지침 2, 호스트 요인과 GM의 양성 혼자 또는 호스트 요인 혼자 임상 기준에 따라 &#39;가능성&#39;침략 곰팡이 감염을 가리키지 않을 것입니다. 환자 6 인해 호스트 요인, 주요 및 사소한 임상 특징과 GM의 양성 모두 2002 년과 2008 가이드라인 아래의 &#39;가능성&#39;아이오으로 진단되었다. 참고, 그 LFD이나 PCR의 assays도 현재 EORTC / MSG 가이드라인에 포함하는 동안, BAL 예제에서 Aspergillus 항원 및 핵산의 존재를 나타내는 두 assays와 상업 galactomannan 테스트 간의 강력한 합의가<html> 환자 6과 12의. IPA를 진단 LFD와 PCR assays의 효능을 보여주는 재판의 추가 결과는 존슨 외 8에서 찾을 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> 그림 1. 혈청 및 BAL을 사용 LFD 테스트 결과 (제어 및 테스트 라인) 제외 (단 제어 라인)과 긍정. 테스트 라인 반응의 농도는 혈청 및 BAL 샘플의 대상 항원의 농도에 비례합니다. 반응은 일반적으로 범위 약한 (+) 중간 통해 (+ +)에 대한 강한 (+ + +). 관계없이 테스트 라인 강도, 세 가지 혈청 긍정적인 반응이 혈류에 Aspergillus 항원을 순환의 존재로 인해 침입 폐 아스 페르 길 루스 증 질환을 나타내는 것입니다. 긍정 BAL 반응 (약한, 중간 또는 강한)는 포자와 폐의의 잠재적 병원성 균사 개발 발아를 나타낼 것이다. &quot;pdflinebreak&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> 환자 안돼. </td><td> Pati엔트 정보 </td><td> 임상 기준 1 </td><td> BAL 배양이 </td><td> GM EIA 색인 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus PCR 결과 </td><td> LFD 결과 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> 주요 중부 표준시 표지판 (결절과 후광)과 사소한 일 </td><td> 부정 </td><td> 0.9 (긍정) </td><td> 유망한 후보자 </td><td> 유망한 후보자 </td><td> 긍정적인 </td><td> (+) 긍정적인 나약 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 추정 이전 곰팡이 감염 </td><td> 마이너 아무 주요 한도 </td><td> 칸디다 glabrata </td><td> 6.43 (긍정 강한) </td><td> 가능한 </td><td> 없음 </td><td> 긍정적인 </td><td> 강한 긍정 (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> Coagulase-음성 포도상ylococcus와 E 혈액에서 대장균 </td><td> 더 중요한 두 사소한 없습니다 </td><td> 부정 </td><td> 0.25 (음수) </td><td> 가능한 </td><td> 없음 </td><td> 부정 </td><td> 마이너스 (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> 가슴 감염 </td><td> 새로운 침투 플러스 복수 유출을 포함한 세 미성년자 기준 </td><td> 부정 </td><td> 0.16 (음수) </td><td> 가능한 </td><td> 없음 </td><td> 부정 </td><td> 마이너스 (-) </td></tr></tbody></table> 계산된 tomography 스캔 1 Nodules 또는 halos은 곰팡이 감염의 암시이다 그것이 정상적인 인간의 식물 9 일부로 격리 일반적인 두 번째로 효모이므로 BAL 액 2 칸디다 glabrata는 오염 물질로 간주됩니다 BAL의 GM EIA 시험에서&gt; 0.8의 3 색인이 Aspergillus 감염의 지표입니다 4 &#39;possibl에 대한 2002 년 EORTC / MSG 진단 기준에 따라E &#39;,&#39;가능성 &#39;또는&#39;검증된 침입 곰팡이 병 10 5 &#39;가능한&#39;에 대한 개정 (2008) EORTC / MSG 진단 기준, &#39;가능성&#39;또는 &#39;검증된&#39;침략 곰팡이 병이를 바탕으로 표 1. LFD 가능성 IPA로 및 제어 AML 환자 (감염의 증거도없고)에서 급성 골수양 백혈병 환자에서 BAL 샘플을 테스트하고, 감염의 EORTC / MSG 진단 결과.

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우리는 공개 할게 없다.

IPA의 최종 식별은 진정한 생검 샘플에서 etiologic 대리인의 분리에 의해 달성될 수 있지만, 적절한 샘플 회복이 매우 아픈 환자에 자주 불가능하며 Aspergillus는 혈액에서 드물게 복구할 수 있습니다. 주요 진보는 IPA 진단에 가슴 스캔 계산된 단층의 사용되었습니다 있지만, 이러한 &quot;헤일로&quot;또는 &quot;공기 초승달&quot;간판 등 폐 IPA의 암시가 특징 중 일시적이거나 호흡 유물에 의한 것이 또는 다른 곰팡이 감염 11,12합니다. 이러한 데이터는 따라서 환자의 혈청에서 순환되는 체액이나 BAL, 가래 또는 소변 샘플 13 존재 그 곰팡이의 서명 분자를 (GM과 β-글루칸)를 식별하는 것을 목표로 serological 기술을 보충하고 있습니다. 이 테스트는 만족스러운 감도를 표시하는 동안, 그들은 특정 조건 하에서 1,6 충분한 특이성이 부족하거나 간섭에 시달리다 </sup&gt;. IPA 검출을위한 LFD 테스트는 여기에 제시하는 것은, 대부분의 유명, 바이러스, 박테리아, 기생충 및 독소 14-19의 검출을위한 테스트에 날짜와하는 데 사용되었습니다 IPA와 공격의 기술 &#39;포인트의 케어&#39;진단을 가능하게 첫째 1988 년 Unipath에 의해 도입된 검사 가정용 임신은입니다. 여기에서 설명한 Aspergillus LFD에서 Aspergillus-특이적인 mAb JF5는 다공성 nitrocellulose 막에서 캡쳐 영역 (테스트 라인)로 고정됩니다. 별도의 영역에서 막에 고정 안티 - 마우스 면역 글로불린은 내부 통제 (제어 라인)을 역임했습니다. 릴리스 포트에 혈청이나 BAL 액의 추가에서 분리 패드의 MAb JF5-콜로이드 골드 켤레축가 대상 항원에 바인딩하고 복잡한 그리고 모세관 현상에 의한 다공성 멤브레인 따라 전달합니다. 캡처 영역에 고정화 MAb JF5은 빨간색 테스트 라인의 결과 JF5-콜로이드 골드 항원 복잡한에 바인딩합니다. 모든 언바운드 JF5-콜로이드 골드켤레축는 분석이 제대로 실행되었는지 나타내는 내부 컨트롤에 바인딩합니다. 빨간색 제어 라인에서이 결과를. 테스트를 수행하는 데 단 15 분 복용, 신속한이며, GM과 β-글루칸 검출을 기반으로 혈청 및 BAL 검사에 비해 저렴하고, 고가의 장비 또는 실행할 수있는 다양한 실험 시설을 필요로하지 않습니다. 또한, MAb JF5는 GM과 β-글루칸 테스트 1,4,6의 허위 - 긍정적인 반응을 일으키는 것으로 표시되었습니다 약물이나 오염 물질과 교차 반응하지 않습니다. 현재 진단 테스트를 통해 추가적인 큰 장점은 Aspergillus 종의 침략 성장을 나타내는 것입니다 활동을 감지하는 LFDs 능력입니다. LFD 프로 시저에서 중요한 단계는 장치에 대한 혈청 또는 BAL 샘플 신청 후 결과 15 분을 읽을 필요가있다. 시험이 5 월 바이어스 결과 interpretati로 결과를 기록하기 전에 이상 15 분 동안 남아있을 수 없습니다에. 약한 반응은 배양 기간을 연장 향상되지 않습니다. 감염 동물 모델에서 혈청의 열처리는 분석 감도를 향상시키는 것으로 확인되었습니다. 시험의 한계는 그것이 질적이라는 것입니다, 그리고 양성의 주관적인 평가를 할 수있는 연산자에 의존합니다. 테스트 라인의 농도는 혈청 및 BAL 샘플 (그림 1)의 항원 내용에 따라 다릅니다. 그러나, 어떤 긍정적인 반응 (알려진 제외 비교에 의해 결정) Aspergillus 항원 따라서 감염의 존재를 나타냅니다. LFD assays의 주관을 제한하려면, 휴대용 디바이스는 LFD 테스트 라인 농도의 부량을 허용하고 항원 검출 20 문턱 값의 설립을 활성화하는 사용할 수 있습니다. LFD 앞으로의 개발은 상용화 및 기타 침입 곰팡이 병원균의 동시 검출을 허용 멀티 플렉스 LFD의 개발을 포함매우 구체적인 MAbs에게 3을 사용.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> 은 Exeter 대학교 </td><td></td><td> 요청시 해당 작성자의 가능 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> 시그마 </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 시그마 </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> 소태아 혈청의 다른 소식통은 중의의 준비에 사용할 수 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of invasive pulmonary aspergillosis in haematological malignancy patients by using lateral-flow technology

침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증 (IPA)는 병적 상태와 haematological 강한 악의 환자와 조혈 줄기 세포 이식받는 1 사망률의 주요 원인이다. IPA가 탐지되면 무서운 진단 도전을 상징하고, &#39;황금 표준&#39;의 부재에서, 임상 데이터 및 미생물학과 조직 병리학 가능의 조합에 의존하고 있습니다. IPA의 진단은 연구 및 치료 암과, &quot;검증된&quot; &quot;가능성&quot;과 &quot;가능성&quot;침략 곰팡이 질환 2를 정의 알레르기 및 전염병의 균류학 연구 그룹 (EORTC / MSG) 합의의 국립 연구소를위한 유럽 조직을 따라야합니다 . 현재까지는 핵산 기반 검사가 외부 IPA 감지하고 그래서 중합 효소 사슬 반응 (PCR)에 대해 검증되지 않은 현재의 EORTC / MSG 진단 기준에 포함되지 않습니다. histological 섹션 Aspergillus의 식별로 인해 시미의 문제가다른 침투성 곰팡이 병원균 3, 검증된 식별과 hyphal morphologies의 larities는 순수 문화의 etiologic 요원의 절연이 필요합니다. 문화 기반의 접근 방법은 생검 샘플의 가용성에 의존하지만, 이들은 항상 아픈 환자에 액세스할 수 있으며, 획득한 때 항상 문화 가능한 propagules를 얻을 수 없습니다. Aspergillus의 pathogenesis에 중요한 기능은 angio-침공, 혈청 및 bronchoalveolar 세척 (BAL) 유체의 특성 antigenic 서명 분자를 탐지 검사를 사용 immunologically 균류를 추적할 수있는 기회를 제공하는 특성입니다. 이것은 Aspergillus galactomannan 및 보존 곰팡이 세포 벽 구성 요소를 감지 (1 → 3)-β-D- &#39;범 - 곰팡이&#39;분석을 (Fungitell 테스트) 감지 Platelia의 효소 면역 분석법의 개발 (GM-EIA)로 이어졌다 글루칸,하지만 그들의 세포 벽의 1,4에서이 구성 요소를 결여 mucorales 인치 인가차세대 단클론 항체의 최근 개발 (MAb) 기반 감염 1.5의 대리 마커를 감지 assays하게되었다 이러한 테스트 1,4-6의 정확성을 둘러싼 피소. 손튼 5 최근 IPA의 포인트의 케어 (POC) 진단을위한 immuno-색층 측방 흐름 장치 (LFD)를 개발하는 하이 브리 도마 기술의 사용을 사용하여 Aspergillus-특이적인 mAb (JF5)의 생성을 설명했다. LFD의 가장 큰 장점 MAb JF5는 균류 5의 적극적인 성장 중에 분비되는 세포외 당단백질 항원에 바인딩 이후로 활동을 감지하는 기능입니다. 이러한 Aspergillus의 포자는 흡입된 공기의 일반적인 구성 요소이기 때문에 IPA를 진단하는 폐암 BAL과 같은 유체를 사용하는 경우 이것은 중요한 고려 사항이다. IPA를 진단 장치의 유틸리티는 LFD는 향상된 감도와 사양을 표시 감염의 동물 모델을 사용하여 증명되었습니다ificity는 Platelia GM과 Fungitell (1 → 3)-β-D-글루칸의 assays 7로 비교했다. 여기서는 인간의 혈청 및 BAL 체액에서 Aspergillus 항원을 감지하는 간단한 LFD 절차를 제시. 그것의 속도와 정확도가 haematological 강한 악의 환자에서 IPA의 진단을위한 소설 외래 포인트의 케어 테스트를 제공합니다.

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Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

침입 폐 아스 페르 길 루스 증에 대한 신속하고 정확한 포인트의 케어 테스트는 제공됩니다. 그것에 바인딩 특정 단클론 항체를 사용하여 수평 흐름 기술을 활용<em&gt; Aspergillus</em&gt; 항원이 폐의 감염 동안 분비. 검정은 혈청 및 brochoalveolar 세척과 호환되며 질병 진단을위한 소설 부가 시험을 나타냅니다.

측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

detection-invasive-pulmonary-aspergillosis-haematological-malignancy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.9K 조회수.  University of Exeter. 침입 폐 아스 페르 길 루스 증에 대한 신속하고 정확한 포인트의 케어 테스트는 제공됩니다. 그것에 바인딩 특정 단클론 항체를 사용하여 수평 흐름 기술을 활용 Aspergillus 항원이 폐의 감염 동안 분비. 검정은 혈청 및 brochoalveolar 세척과 호환되며 질병 진단을위한 소설 부가 시험을 나타냅니다.

비디오: Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

폐 마우스의 면역 조직 샘플의 수확과 함께 오른쪽 심실 수축기 압력 측정

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models of ALI are key in enhancing our understanding of disease pathogenesis. Lipopolysaccharide (LPS) derived from gram positive bacteria induces neutrophilic inflammation in the airways and lung parenchyma of mice. Efficient pulmonary delivery of compounds such as LPS is, however, difficult to achieve. In the approach described here, pulmonary delivery in mice is achieved by challenge to aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS. Dissolved LPS was aerosolized by a nebulizer connected to compressed air. Mice were exposed to a continuous flow of LPS aerosol in a Plexiglas box for 10 min, followed by 2 min conditioning after the aerosol was discontinued. Tracheal intubation and subsequent bronchoalveolar lavage, followed by formalin perfusion was next performed, which allows for characterization of the sterile pulmonary inflammation. Aerosolized LPS generates a pulmonary inflammation characterized by alveolar neutrophilia, detected in bronchoalveolar lavage and by histological assessment. This technique can be set up at a small cost with few appliances, and requires minimal training and expertise. The exposure system can thus be routinely performed at any laboratory, with the potential to enhance our understanding of lung pathology.

We describe a method for inducing neutrophilic pulmonary inflammation by challenge to aerosolized lipopolysaccharide by nebulization, to model acute lung injury. In addition, basic surgical techniques for lung isolation, tracheal intubation and bronchoalveolar lavage are also described.

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

요약

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백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에

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에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

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