These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

윤리 문 : 드 확인 된 인체 조직과 혈장 샘플 심사위원회 (Institutional Review Board)에서 헨드릭 의료 센터에서 얻었다 프로토콜을 승인했다. 오티 닐화 된 항체의 1 추가 참고 :이 단계의 모니터링는 선택 사항입니다. 모니터링하지 않을 경우 다른 프로토콜을 참조하십시오. <ol><li> 시중에서 판매하는 아비딘 파생 코팅 플레이트 (재료 및 장비 표 참조) 구합니다. </li><li> 우물에 50 μl의 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2를 추가합니다. 참고 : 28 ° C에서 Preinc​​ubate PBS는 온도 관련 공명 변화를 최소화합니다. </li><li> 열기 생물 검정 스캐너 소프트웨어와 공백, 표준의 선택 및 샘플 플레이트 레이아웃, 설정 온도 (28 ° C), 분당 스캔의 수를 포함하는 실험 절차를 정의 할 수있는 설치 마법사를 따라 (1) 실험의 길이 ( 150 분 예비 단계를 수용). </리&gt; <li> 라벨 무료 생물 검정 스캐너로 준비 분석 플레이트를 삽입하고 첫 번째 스캔을 시작합니다. 첫 번째 스캔이 완료되면, &quot;시작하는 자체 기준&quot;을 선택합니다. 기준선은 실험의 시작에서 수집 스캔 초기 설정이다. 문제는이 특정 판에서 수행 된 제 1 판독 경우, 스캐너가 온도를 평형과베이스 라인에서 드리프트를 제거하기 위해 실행할 수 있습니다. 샘플을 첨가하여 기준의 스크린 샷은 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 기준선 안정화, 또는 적어도 5 스캔 후 판독을 일시 중지하고, 플레이트를 토출. </li><li> 싱크대에 덤핑으로 PBS를 제거하고 접시에 제어 우물하지만 모든 [PBS의 pH가 7.2에서 10 ㎍ / ml의] 50 μL의 RL21A 바이오틴 항체를 추가합니다. 제어 우물에 50 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 채도가 약 1.5 시간에 도달 할 때까지 읽기를 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 일시 정지 판을 꺼냅니다. </li><li> 세척<html> 플레이트 200 μL 200 μL / 웰 PBS pH를 7.2 3 린스 하였다 / 웰의 인산 완충 생리 식염수 + 0.05 % 트윈 20 (PBST)로 3 회. PBS로 반복합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 종이 타월에 판에서 초과 PBS를 누릅니다. 참고 :이 단계는 자동 평 와셔를 수행하거나 싱크대에 액체를 덤핑과 피펫 PBST를 대체하여 플레이트 200 μL PBST로 3 회 세척 할 수있다. </li><li> 모든 활성 우물에 50 μl의 PBS 산도 7.2을 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 접시를 넣고 세척 후 공명을 모니터링 읽고 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 중지하고 판을 꺼냅니다. </li></ol> 1 단계의 대체 프로토콜 : <ol start="13"><li> 모든 우물 [10 ㎍ / ml의 PBS] 50 μL의 RL21A 바이오틴 항체를 추가합니다. </li><li> 1.5 시간 또는 밤새 4 ° C 상온에서 품어. </li><li> 200 μL와 접시 3 회 반복한다 / 잘 PBST 단계 1.9에서와 같이 200 μL / 잘 PBS 3 린스 하였다. </li></ol>분석 대상의 jove_title &quot;&gt; 2. 추가 <ol><li> PBS를 제거하고 적절한 분석 완충액을 잘 당 50 μl를 추가합니다. 이 분석을 위해, 상업적으로 입수 한 정상 인간 혈청을 PBS에 희석 1:20 사용 하였다. </li><li> 열기 생물 검정 스캐너 소프트웨어는 실험 절차를 정의하기 위해 설치 마법사를 따라. </li><li> 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 기본 읽기 시작합니다. 문제는이 특정 판에서 수행 된 제 1 판독 경우, 온도를 평형과베이스 라인에서 드리프트를 제거하기 위해 스캐너 실행을 할 수 있습니다. </li><li> 기준선 안정화, 또는 적어도 5 스캔 후 판독을 일시 중지하고, 플레이트를 토출. </li><li> 우물에서 분석 버퍼를 제거합니다. </li><li> 와 스파이크 컨트롤 HLA A * 02 : [0.625-10 ㎍ / ㎖의]에서 분석 버퍼에 이르기까지 관련 (FLSL) 또는 농도 무관 (SLLV, YLEV, 또는 KVL) 펩티드 베어링 01 단량체. 플레이트의 대조군 웰에 표준의 50 μL를 추가 </li><li> 샘플 분석 버퍼 분석 50 μl를 추가플레이트의 웰. 이 분석을 위해, 상업적으로 입수 한 인간 혈청을 사용 하였다 아군. </li><li> 약 30 ~ 60 분 다시 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 포화 상태에 도달 할 때까지 읽기를 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 일시 정지 판을 꺼냅니다. </li><li> 200 μL와 접시 3 회 반복한다 / 잘 PBST 단계 1.9에서와 같이 200 μL / 잘 PBS 3 린스 하였다. </li><li> 모든 활성 우물에 50 μL 분석 버퍼를 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 접시를 넣고 세척 후 공명을 모니터링 읽고 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 중지하고 판을 꺼냅니다. 주 : 검정 완충액은 PBS, 조직 배양 배지, 또는 상기 분석의 목표에 따라 PBS에 1:20으로 희석 인간 혈청 일 수있다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 생물학적 검정 스캐너 소프트웨어 또는 반출 바람직한 통계 분석 소프트웨어 원시 데이터 파일을 사용하여 분석한다. 생물학적 검정 스캐너 소프트웨어가 자동 결합에 기초하여 곡선을 생성실험 설치하는 동안 제공 플레이트 레이아웃. 주 : 분석을 위해 생물학적 정량 스캐너 소프트웨어를 사용하지 않는 경우, 단계를 수행 3.2-3.4. </li><li> 이후의 각 데이터 포인트에서 기저선 및 음성 대조군을 뺀다. </li><li> 각 시점에서의 복제에 웰에 대한 평균 및 표준 편차를 계산한다. </li><li> 막대 그래프의 결합 곡선을 선택하거나 엔드 포인트 데이터의 그래프를 생성합니다. </li></ol>

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</ol>

저자, 데브라 Wawro Weidanz와 로버트 마 그누 손은이 문서에서 사용되는 생물 검정 플레이트 리더와 분석 플레이트를 생산 공진 센서 법인에서 각각 최고 경영자 (CEO)와 최고 기술 책임자 (CTO)이다.

본원에 기재된 방법은 높은 처리량 환자의 혈청, 혈장, 소변 또는 타액 시료에 가용성 펩티드 / HLA 복합체의 신속한 검출을 가능 96- 또는 384- 웰 포맷 것이다 암 진단을위한 바이오 마커 스크리닝 시스템을 소개한다. 모노클로 날 항체 및 라벨없는 검출 시스템을 흉내 T 세포 수용체를 이용하여 상기 분석 시스템은 통상의 ELISA에 의해 3.5 시간에 비해 1 시간 미만으로 분석 시간을 삭감. 이 높은 처리량 방법은 치료 암 백신 또는 바이오 의약품에 대한 임상 시험에 환자의 신속한 계층화 할 수 있습니다. 이러한 질병 표적 검출을위한 현재의 방법은 개별 환자 샘플 번거롭고 시간 소모적 프로세스의 친 화성 정제 및 HPLC-MS / MS를 필요로한다. 이 방법은 종래의 ELISA 기법 의무가 있지만, 이러한 우려를 방지 β2 마이크로 글로불린 항체와 같은 보조 검출 시약은 초기 HL의 구조를 변경할 수있다분자는 TCRM 제한 검출에 결합 억제한다. 라벨없는 검출은 이러한 우려를 완화. 이 과정은 이러한 표면 플라즈몬 공명 시스템으로 다른 라벨없는 시스템에서 사용하기 위해 수정 될 수있다. 그러나이 크게 본 연구에서 사용 된 생물학적 검정 시스템에 비해 높은 처리 능력을 감소시킬 것이다. 이 프로토콜은 효과적으로 몇 가지 중요한 단계 준수와 환자의 혈청 및 혈장 비 HLA 바이오 마커의 검출을 위해 수정할 수 있습니다. &lt;200 PM 시프트 가능성 후속 검출 단계 낮은 신호 발생하므로 초기 항체 코팅 공정의 모니터링은, 표면의 최적화를 위해 권장된다. 혈청 단백질의 풍부가 낮은 농도 분석의 결합 마스크 수 있으므로 기준 및 사후 세척 읽기는 엔드 포인트 분석하는 데 유용합니다. 마지막으로, 샘플의 온도 변화에 잘 잘 변화에 발생할 수 있습니다. 그것은 모든 샘플을 미리 배양하는 것이 좋습니다D 라벨없는 biosassay 부 온도 컨트롤러는 실온 이상에서 2-3 ℃로 설정 될 수있다. 냉장 샘플 작동 온도에 도달 할 수있는 충분한 시간을 허용한다. 이 프로토콜의 장래 변형이 플​​레이트 표면에 TCRM의 다중화를 포함한다. 생물 검정 시스템은 적어도 8 플렉스의 밀도로 우물의 안보에 현재 의무가 있습니다. 시험 샘플 볼륨 당, 각 웰에 4-8 TCRM을 도입함으로써 감소 및 환자 당 점점 복잡한 데이터의 수집을 가능하게한다. 이 기능은 더 치료 옵션과 관련하여 환자를 제공하는 계기가 될 것이다.

클래스 I 인간 백혈구 항원 (HLA)의 시료 세포 내 단백질의 레퍼토리 프로 테오 분해로부터 유도 된 길이가 8-11 개의 아미노산의 펩티드는 모든 유핵 세포 1,2- 표면의 펩타이드를 제공한다. HLA 복합체 순환은 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 (도 1) 각각의 셀의 상태를 나타내는 &quot;자연의 바이오 마커&quot;이다. CTL에 의해 일으키는 세포의 제거에 질병 관련 펩티드 결과의 인식. 따라서, 적응 면역 반응이 바이러스 감염 및 종양의 제거에 매우 효과적이다. 그러나 면역 체계는 종종 효과적인 CTL 응답을 회피 할 수있는 바이러스 나 종양에 대한 선택을 촉진 압력을가한다. 모방하는 T 세포 수용체 (TCRM) 모노클로 날 항체의 특정 펩티드 / HLA-A * 02 인식 (모노클로 날 항체) : 유방암 관련 단백질, 대 식세포 이동 억제 인자로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 (MIF19-27) 3 및 NY-ESO-1은 157-165, CTL은 4,5- 대응 방법 효과적인 항 종양의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 이 작업은 대표적인 인구의 30 %까지 발현 HLA-A * 0201 분자에 집중된다. 그러나, TCRM의 생산 다음에 다른 관련 HLA / 펩타이드 복합체의 식별은 훨씬 광범위한 인구 작품의 유틸리티를 확대하고, 대상 면역 요법과 동반 질환 진단의 개발을 가능하게한다. 세포 표면에 대한 결합 펩티드 / HLA 복합체의 부분은 플라즈마 내로 방출된다. 때문에 HLA 관련 바이오 마커의 immunopeptidome 광산에 대한 펩타이드 / HLA 풀, 현재의 방법의 매우 복잡한 특성으로 인해 시간이 소요됩니다. 이 프로세스는 플라즈마로부터 가용성 HLA의 친 화성 정제를 필요로 역상 고압 액체 크로마토 연관된 HLA 펩티드의 분리탠덤 질량 분광법 (MS / MS) -6,7- 그래피 (RP-HPLC) 및 펩타이드 서열. 이 프로세스는 신규 한 치료 적 표적의 발견을위한 가능한 선택이지만, 이미 치료 백신 또는 바이오 파이프 라인 80-10에서 HLA 연관된 타겟 동반자 진단 도구로 성가신 과정이다. 이러한 목표는 관련 임상 시험에 환자를 계층화하고 더 많은 정보 치료 옵션을 제공하기위한 신속한 동반자 진단 개발을위한 도구를 제공에 대해 TCRM은 지시했다. 본 연구에서는 암 진단을위한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템은 TCRM 최소한의 처리 단계와 생물학적 상호 작용을 모니터링하는 라벨이없는 생물 검정 시스템을 사용하는 표시됩니다. 라벨없는 생물 분석 시스템은 유전체 도파로 격자 11-14 발생 가이드 모드 공명 (GMR) 효과를 이용한 방법에 기초한다. 때 광대역 빛이 접촉 회절을이 시스템에 필요한 접시에 격자, 두 가지 특정 파장이 반영됩니다. 고정화 된 수용체와 리간드 간의 결합 상호 작용이 스펙트럼 분석기 (12)와 공명 파장 시프트를 추적하여 실시간으로 모니터링된다. 별도의 공진 피크는 입사 TE (입사면에 수직 전기 벡터) 및 TM (입사면에 수직 인 자기 벡터) 잠재적 11,14 검출 정밀도를 높일 수있는 다수의 데이터 포인트를 제공하는 편광 상태에 대해 발생한다. 이 라벨없는 측정계 항체 미리 감응 플레이트를 사용하여 데이터 분석을 분석 실행 시간은 약 45 분이다. 또한, 다수의 환자 샘플을 HPLC-MS / MS 기반 포맷 위에, 96- 또는 384- 웰 포맷 분명한 이점을 심문 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td><td>Resonant Sensors Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td><td>Resonant Sensors Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ResoVu software</td><td>Resonant Sensors Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL21A Biotinylated TCRm mAb&amp;nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL9A Biotinylated TCRm mAb&amp;nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLSL HLA-A*02:01 Monomer&amp;nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td></tr><tr><td>SLLV HLA-A*02:01 Monomer&amp;nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td></tr><tr><td>YLEV HLA-A*02:01 Monomer&amp;nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td></tr><tr><td>KVL HLA-A*02:01 Monomer&amp;nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td></tr><tr><td>Pooled Normal Human Serum&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2657100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Cell Supernatant</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modification of Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-63</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>ThermoFisher</td><td>5318-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2,2&amp;rsquo;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td><td>ThermoFisher</td><td>37615</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-human &amp;beta;2 microglobulin&amp;nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0072</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;nbsp; microplates</td><td>ThermoFisher</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 microplate reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immpress Reagent Kit</td><td>Vector</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpact DAB</td><td>Vector</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin QS</td><td>Vector</td><td>H3403</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>MP BioMedicals</td><td>50328</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b</td><td>MP BioMedicals</td><td>50330</td><td></td></tr><tr><td>anti-HLA-A2 (BB7.2)</td><td>Experimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

미국 암 학회 (American Cancer Society)에 따르면, 20 만 명 이상의 여성들이 침습적 유방암 매년 진단되고 약 40,000 병으로 죽을 것이다. 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I의 세포 단백질 시료 프로 테오 분해로부터 유도 된 펩티드를 순환 및 세포 독성 T 림프구 (CTL)에 의해 심문 세포 표면에 이러한 단편을 제시한다. T 세포 수용체 모방의 발생 (TCRM) 모노클로 날 항체 유방암 인식 (모노클로 날 항체) 특정 펩타이드 / HLA-A * 02 : 대 식세포 이동 억제 인자 (MIF 19-27) 및 NY-ESO-로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 1 157-165은 효과적인 항 종양 CTL 반응의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 본래 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 유방암 세포에 의해 창고 및 잠재적으로 관련 암 바이오 마커를 표현하고 있습니다. 이 작품은, 진단 암에 대한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템에서T 세포 수용체를 가이드 모드 공명 (GMR) 센서 기술을 이용하여 신규, 라벨없는 바이오 센서와 결합 모방 모노클로 날 항체를 포함하는 s를 제공한다. 창고 MIF / HLA-A의 검출은 * 02 : MDA-MB-231 세포 상층 액 01 단지는, 인간 혈청 아군, 환자 플라즈마가 설명된다. 이 작품의 영향을 대상으로 면역을위한 동반자 질환 진단의 개발을 통해 맞춤 의학 혁명을 가져다 줄 수있을 것이다.

01 분자 3 : 실험의 대표적인 세트는 HLA-A * 02의 컨텍스트 내에서 잘 특성화 TCRM, RL21A, 특히 펩티드를 인식 쥐의 IgG2a 단클론 항체 (MIF 19-27 또는 FLSL)를 사용하여 수행 하였다. 동족 펩티드 / HLA 단량체뿐만 아니라 부적합 HLA 단량체 (15)은 설명 된 절차를 보여주기 위해 사용 하였다. (3)는 분석 포맷을 도시한다. RL21A 다른 펩타이드 / HLA가 3 복합체와 작은 교차 반응성 FLSL / HLA 모노머에 대한 특정이다. 이 특이성은 라벨없는 생물 분석 시스템 (도 4)를 사용하여 효과적으로 요약된다. 고정화 FLSL / HLA 단량체 (도 5)에 RL21A 항체의 적정에 의해 측정이 실험 라벨없는 생물 검정 시스템의 감도가 낮은 나노 몰 범위이다. 백그라운드 신호 크게 혈청 샘플에서 증가 하였지만,이야인간 혈청에서 스파이크 된 FLSL / HLA 단량체 pecific 검출은도 6에서 달성되고, 농도 구배를 용이하게 식별 가능한 이들 샘플이다. 마지막으로, MDA-MB-231 세포주로부터의 상층 액은, 이전 FLSL / HLA-A * 02 제시 도시 : 01 분자를,이 라벨없는 분석 플랫폼 (도 7)를 사용하여 수용성 FLSL 단량체를 포함하도록 도시된다. FLSL / HLA 단량체 이후 추가 RL21A에 신호 (그림 7)을 증가시킨다. 인해 시스템의 감도, 웰에도 4 및도 5에 표준 편차의 함수로서와 같이 온도 변화의 결과로 발생할 수있는 음의 공진 시프트 포함한 잘 변동. 이러한 변화는 실온의 약간 과량 (즉, 28 ° C)의 온도에서 모든 샘플 및 생물학적 검정 플레이트 판독기의 사전 인큐베이션 대폭 저감 할 수있다. 간단히도 8에서, (96)- 그럼 폴리스티렌 플레이트를 코팅 하였다 [10 ㎍ / ml의] RL21A의 PBST로 세척하고 0.5 % 저지방 우유, 블로킹 및 일련 희석액을 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션 PBST로 세척하고, 실온에서 2 시간, 대 정상적인 인간 혈청 FLSL HLA 단량체는 표준 곡선을 생성하기 위해 PBS에 1:10으로 희석 또는 환자 혈장은 PBS에 1:10으로 희석. HLA 손상을 검출하고, PBST 세척 : 플레이트를 PBST로 세척하고, 토끼 항 - 인간 β2 마이크로 글로불린에의 [5000 (1)]와 함께 실온에서 1 시간 배양 하였다. 플레이트를 염소 항 - 토끼 IgG를 [1 : 10,000]에 30 분 동안 인큐베이션시키고, PBST로 세척 하였다. 비색 검출 ABTS (2,2&#39;- Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6​​-술폰산] -diammonium 염) 15 분의 배양 시간과 기판 및 마이크로 플레이트 판독기에서 405 nm에서 관찰을 사용하여 수행 하였다. FLSL / HLA 세 환자 샘플에서 검출되었다. 도 8b에서, 환자 플라즈마 RL.064는 PBS에 1:20으로 희석 한 후 추가되었다판 ED 60 분의 레이블이없는 검출기에서 모니터링. 환자 혈청에서 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출은 달성되었다. 스튜던트 t 시험 그래프 및 통계 소프트웨어 (p &lt;0.05)를 사용하여 수행 하였다. 도 8c에, 조직 절편은 양성 대조군 마우스 항 - HLA-A2 (BB7.2) RL21A, 각각의 IgG2a 및 IgG2b의 네거티브 컨트롤 1 ㎍ / ㎖의에 염색 하였다. 염색은 제조업체의 지시에 따라 핵 염색 항 마우스 검출 키트, DAB (diaminobenzadine)와 헤 마톡 실린 QS를 사용하여 검출되었다. RL21A으로 종양 조직의 염색은 FLSL / HLA 복합체의 프리젠 테이션을 확인합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> 도 1 :. 클래스 I 인간 백혈구 항원에 의해 종양 항원 제시 변환 암성 세포 질환이다. HLA 샘플 intracellul아칸소 단백질과 세포 표면에서 암 관련 변경 사항을 알 수있다. CTL과 TCRM 그 세포에 별개의 HLA-펩타이드 복합체를 통해 암 세포를 인식 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 초기 기준을 보여주는 데이터 수집의 생물 검정 스캐너 ​​소프트웨어에서 데이터 수집의 스크린 샷 예는 FLSL / HLA 복합체의 10 ㎍ / ml로 코팅 된 플레이트에 RL21A 항체를 첨가하여 검색합니다. 항체의 농도는 표시됩니다. 각 라인은 개인이 아니라 시간이 지남에 따라 모니터링 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> 그림 3 :. 분석 플레이트 캡처 확인해의 회절 격자 표면에 고정 항체의 분석 형식의 그림evant 펩타이드 / 솔루션 HLA 복합체. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> 그림 4 :. 관련이없는 HLA 모노머 (YLEV, SLLV 및 KVL)에 비해 그 관련 (FLSL) HLA 모노머에 대한 바이오틴 RL21A TCRM의 특이성의 FLSL / HLA 복잡한 데모에 대한 RL21A의 특이성. 오티 닐화 RL21A TCRM [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 아비딘 코팅 된 플레이트 표면에 고정화하고, 검출에 표지 된 PBS 또는 무관 관련 HLA 단량체 [10 ㎍ / ㎖의]를 사용하여 수행 하였다. RL21A는 FLSL / HLA 단지에 대한 특정했다. 양방향 그래프는 ANOVA 통계 소프트웨어 (p &lt;0.001)를 이용하여 수행 하였다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> 그림 5 :. detecti의 동종의 펩타이드 / HLA 복합체 RL21A의 감도를 바인딩 그림제한 및 FLSL / HLA 복합체 RL21A의 감도를 결합합니다. 비 오티 닐화 된 HLA 단량체 FLSL [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 플레이트 표면에 고정화하고, 지시 된 바와 같이 표지 된 RL21A는 PBS에서 연속 희석으로 플레이트에 첨가 하였다. 이 시스템에 대한 인식은 낮은 나노 몰 범위에 있었다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> 그림 6 :. 인간 혈청에서 HLA의 검출의 가시 박힌 인간 혈청 데모에서 HLA 단지의 검출. 오티 닐화 RL21A TCRM [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 아비딘 코팅 된 플레이트 상에 고정화시켰다. 관련 (FLSL) 또는 무관 (SLLV) HLA 단량체와 아군 풀링 정상적인 인간 혈청은 PBS에 1:20으로 희석 한 다음 판에 추가하고 60 분 동안 라벨없는 검출기에서 측정 하였다. 인간 혈청에 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출은 달성되었다. 일반적으로, 백그라운드 신호 (부적합 SLLV 단량체) 높다ER 희석 혈청 샘플 분석 PBS에서 정제하여 (도 4 참조)에 비해. 양방향 그래프는 ANOVA 통계 소프트웨어 (p &lt;0.0001)을 사용하여 수행 하였다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> 도 7 :. 가용성 HLA 복합체가 유방암 세포 배양 상청액에서 검출 유방암 세포 상청액 HLA를 감지하는 능력이 입증된다. 오티 닐화 RL21A TCRM, RL9A TCRM (음성 대조군), 및 이소 제어 분석 플레이트의 표면에 고정시켰다. 아군 [5 ㎍ / ㎖의] unspiked 및 MDA-231 세포 배양 상등액을 첨가하고, 라벨없는 검출기에서 60 분 동안 결합​​을 모니터링 하였다. FLSL 및 SLLV HLA 단량체 샘플 RL9A과 RL21A 바인딩에 대한 긍정적 인 컨트롤을 나타냅니다 아군. 일방향 ANOVA는 그래프 및 통계 소프트웨어 (p &lt;0.0001)을 사용하여 수행 하였다. 그림 8 :. 환자 샘플에서 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출 (A) 면역 흡착제 분석 (ELISA) 링크 전통적인 효소는 환자의 혈장에서 FLSL / HLA 특정 단지를 검출하기 위해 사용 하였다. (B) 바이오틴이 RL21A TCRM 또는의 IgG2a는 [10 μg의는 / ㎖]하는 아비딘 분석 플레이트에 고정되었다. 환자 RL.064에서 (C) 유방 종양 조직 이전에 FLSL / HLA 복합체의 종양 프리젠 테이션을 확인하기 위해 3 기술로 염색했다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다.

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K 조회수.  Texas Tech University Health Sciences Center.  그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다. 

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MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the outcome of this deadly disease. MicroRNAs (miRNAs) are tissue specific, small, non-coding RNAs regulating gene expression, which may act as extracellular messengers of biological signals derived from the cross-talk between the tumor and its surrounding microenvironment. They could thus represent ideal candidates for early detection of lung cancer. In this work, a methodological workflow for the prospective validation of a circulating miRNA test using custom made microfluidic cards and quantitative Real-Time PCR in plasma samples of volunteers enrolled in a lung cancer screening trial is proposed. In addition, since the release of hemolysis-related miRNAs and more general technical issues may affect the analysis, the quality control steps included in the standard operating procedures are also presented. The protocol is reproducible and gives reliable quantitative results; however, when using large clinical series, both pre-analytical and analytical features should be cautiously evaluated.

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

Here, we present the detailed protocol adopted in the BioMILD screening trial to perform the circulating microRNA signature classifier test for early lung cancer detection.

예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (MSC)의 경험

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

연구

암 연구학

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, optimization of their biotechnological synthesis is limited by the relatively low throughput of detection and quantification of monosaccharide and linkages. Conventional techniques of glycan analysis include chromatographic/mass-spectrometric methods with throughput on the order of hundreds of samples per day without automation. We demonstrate here, a genetically encoded bacterial biosensor for the high-throughput, linkage-specific detection and quantification of the fucosylated HMO structures, 2&#8217;-fucosyllactose and 3-fucosyllactose, which we achieved via heterologous expression of fucosidases. As the presence of lactose in milk or in biotechnological processes could lead to false positives, we also demonstrate the reduction of signal from lactose using different strategies. Due to the high throughput of this technique, many reaction conditions or bioreactor parameters could be assayed in parallel in a matter of hours, allowing for the optimization of HMO manufacturing.

We describe here the high-throughput detection and quantification of fucosylated human milk oligosaccharides (HMOs) using a whole-cell biosensor. We also demonstrate here, the adaptation of this platform towards analysis of HMO production strains, focusing on improving the signal to noise ratio.

Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

생화학

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

생체공학

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 HPLC 방법

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

생물학

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

분자 각 인을 사용 하 여 생체의 磁 검출 용량 성 바이오 센서 기반

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...