⁶⁸ga 표지 나노 분자의 방사선 합성, 품질 관리 및 소동물 양전자 방출 단층 촬영 이미징

이 논문은 새로운 방사성 표지 프로브(즉, ⁶⁸Ga-표지된 나노바디 NM-02)의 방사선 합성, 제형, 품질 관리 및 이종 이식 모델에서 소동물 PET/CT 이미징에 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

소동물 양전자 방출 단층촬영(PET) 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 이미징 기술은 전임상 암 연구에서 매우 중요하므로 방사성 추적자 합성, 품질 보증 및 생체 내 주입 프로토콜에 대한 세심한 주의가 필요합니다. 이 연구는 소동물 PET 실험의 견고성과 재현성을 향상시키기 위해 맞춤화된 포괄적인 워크플로우를 제시합니다. ⁶⁸Ga를 사용한 방사화학 실험실의 합성 공정은 상세하며, 각 방사성 추적자 생산에 대한 엄격한 품질 관리 및 보증 프로토콜을 강조합니다. 농도, 몰 활성도, pH 및 순도와 같은 매개변수는 인간 연구에 적용할 수 있는 표준에 따라 엄격하게 모니터링됩니다. 이 방법론은 간소화된 주사기 준비와 마우스에 대한 정확한 정맥 주사를 위해 맞춤형으로 설계된 30G 캐뉼라를 도입합니다. 스캔 중 체온 및 심박수를 포함한 동물 건강을 모니터링하여 절차 전반에 걸쳐 동물의 건강을 보장합니다. PET 및 SPECT 스캔의 선량은 동물 및 연구자에 대한 방사선 노출을 최소화하면서 데이터 수집의 균형을 맞추기 위해 미리 결정됩니다. 마찬가지로, CT 스캔은 방사선 노출을 제한하기 위해 사전 프로그래밍된 설정을 사용하며, 특히 치료 효과를 평가하는 장기 연구와 관련이 있습니다. 이러한 단계를 최적화함으로써 워크플로우는 절차를 표준화하고 변동성을 줄이며 소동물 PET/SPECT/CT 영상의 품질을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 이 리소스는 분자 이미징에서 전임상 조사의 정확성과 신뢰성을 개선하여 궁극적으로 이 분야를 발전시키고자 하는 연구자에게 귀중한 통찰력을 제공합니다.

가장 관련성이 높은 주제 중 하나는 유방암 분야의 연구입니다. 유방암은 여전히 빈번하게 발생하는 암으로 여성에서 발생하는 모든^{암의 약} 1/3을 차지합니다. 치료는 종양의 생물학적, 조직학적 특성과 질병의 단계에 맞게 조정됩니다. 종양이 이미 전이되지 않는 한 생존 확률은 일반적으로 양호하며, 이 경우 5년 생존율은 약 30%에 불과합니다¹. 다른 부인암도 비슷한 운명을 겪고 있는데, 예를 들어 난소암은 1기 종양의 5년 생존율이 95%> 나타났지만, 전이된 4기 종양의 경우 15%에 불과했다 ^2,3.

비침습적 영상, 특히 양전자 방출 단층촬영(PET)은 신진대사, 수용체 발현 및 치료 반응과 같은 종양 분자 측면에 대한 탁월한 통찰력을 제공하면서 암 연구를 변화시키고 있습니다 ^4,5,6. 이를 통해 특정 대사 영역의 시각화 및 정량화가 가능하여 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 매우 짧은 시점에서 (새로운) 치료법의 효과를 모니터링할 수 있습니다. 실제로, PET는 1-3회의 치료 주기 후에 반응과 무반응을 평가할 수 있으며, 기존의 컴퓨터 단층 촬영(CT) 영상에서 볼 수 있는 형태학적 변화에 비해 더 빠르고 더 나은 평가를 할 수 있다⁷. PET의 비침습적 특성은 종단 연구도 가능하게 합니다.

모든 동물 모델은 새로운 (방사성) 의약품의 치료 능력을 철저히 평가하기 위해 최대한의 표준화가 필요하므로 종양 모델 생성과 소동물 PET 이미징/데이터 분석 모두에서 이에 중점을 두어야 합니다. 동물에서 가장 좋은 종양 모델(피하 접종 또는 정소성 이식, 생쥐, 인간 또는 신유전 종양, 일상적인 임상 치료를 동반하거나 동반하지 않음)에 대해 논쟁할 수 있지만, 그것은 이 출판물의 목표를 벗어납니다. 암 연구를 위해 여러 모델이 사용되었으며, 여기에 설명된 모델은 비교적 간단한 피하 모델입니다.

방사화학의 품질 관리는 동물 안전과 치료 효과에 가장 중요합니다. 이것은 방사성 의약품 자체뿐만 아니라 제품 제형에도 영향을 미칩니다. 임상용 방사성의약품 생산에 관한 광범위한 법률이 있으며^{, 8,9} (현행 법률과 지침에 대한 자세한 개요는 ¹⁰ 참조), 전임상 연구를 위한 방사성의약품의 특성에 대한 몇 가지 지침이 있습니다(자세한 개요는 ¹¹ 참조). 우리는 임상 및 전임상 응용 모두를 위한 방사성 의약품을 생산하며, 임상 응용 분야를 위한 합성에서 발견되는 고급 품질 관리에서 전임상 응용 분야를 위한 합성으로의 번역을 단순화합니다.

우리의 연구 초점은 지시된 테라노스틱스, 특히 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 양성 암에 대한 것입니다. 따라서 우리는 치료 중 암을 진단하고 모니터링하기 위해 새로운 방사성 의약품을 개발합니다. 성공적인 진단용 방사성 의약품은 다양한 방사성 동위원소를 사용하는 치료용 화합물로도 평가됩니다. 이러한 방사성 의약품의 평가는 먼저 동물 모델에서 수행되며, 유망한 전임상 결과를 얻은 후 임상 번역을 위해 노력하고 있습니다. 이 기사에서는 분자 이미징에서 전임상 조사의 정확성과 신뢰성을 향상시키기 위해 마우스 정맥 주사 및 PET/CT 스캔에 대한 표준 관행뿐만 아니라 품질 관리 및 보증을 보장하기 위해 사용되는 프로토콜(예: One Radiopharmaceutical)을 제시합니다. 프로토콜은 방사화학(추적자 합성 및 품질 관리), 동물 모델 생성(피하 종양 모델) 및 이미징의 세 가지 섹션으로 나뉩니다.

연구 프로토콜은 최고 수준의 동물 복지를 준수하며 RWTH Aachen 대학병원의 동물 관리 지침을 엄격히 준수합니다. 우리는 연구에 관련된 모든 동물에 대한 윤리적이고 인도적인 대우를 보장하기 위해 최선을 다하고 있으며, 절차는 지역 동물 윤리 위원회에서 검토하고 승인합니다. 모든 동물 실험은 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 대한 규정과 함께 동물 보호법을 준수하기 위해 독일 관할 당국(Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV)의 승인을 받았습니다.

참고: 이 연구 전반에 걸쳐 사용된 장비, 재료 및 시약의 전체 목록은 재료 표에 나와 있습니다. ⁶⁸Ga의 취급은 가능할 때마다 피펫으로 수행해야 하며 철은 라벨링 수율을 크게 감소시킬 수 있으므로 금속을 피해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이는 방사성 화학 절차가 완료될 때까지 주사 바늘을 사용하지 말아야 한다는 것을 의미합니다.

1. 방사화학과

1. ⁶⁸Ga를 사용한 NM-02-DOTA-GA의 방사성 표지
   주의: 이 프로토콜은 방사성 물질의 취급 및 조작을 포함합니다. 연구자는 방사성 물질 취급에 관한 현지 법률, ALARA(합리적으로 달성 가능한 최소) 관행을 따르고, 납 차폐 작업을 하고, 직접 접촉 시간을 최소화하고, 방사선 노출의 각 단계에서 최대 거리를 유지해야 합니다. 방사능 검출 장치로 실험 절차를 모니터링해야 합니다.
   1. ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator를 10mL의 0.6M HCL(1.2GBq/10mL)로 수동 또는 자동으로 용리합니다. 카트리지를 통해 용리액을 통과시켜 PS-H⁺ 카트리지(크기 M - 0.8mL)에 ^68Ga를 트랩합니다. 총 1mL의 4M NaCl이 있는 PS-H⁺ SPE 카트리지를 단계적으로 천천히 마이크로 원심분리기 튜브에 용리합니다.
   2. 용리액의 처음 0.3mL를 버리고 나머지 0.7mL를 다른 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.
   3. 새 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 명시된 대로 NM-02-DOTA-GA의 방사선 라벨링을 진행합니다.
      참고: 나노바디-킬레이터 접합체(NM-02-DOTA-GA)는 이전에 공급업체의 프로토콜에 따라 제조되었습니다. 접합체는 -80°C의 부분 표본에 수개월 동안 보관할 수 있습니다.
   4. 최대 5μL의 3M NH₄OAc를 사용하여 제품의 pH를 약 7로 조정합니다.
2. 품질 관리
   1. 올바른 설정(동위원소로 ⁶⁸Ga, 1 mL 주사기, 기하학적 0.1 mL)에서 활동계를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 농축된 샘플의 활성을 측정합니다. 방사성 화학 수율 (충치 보정)은 40 % 이상이어야합니다.
   2. pH 테스트 스트립(0-14)에 충분한 양을 찾아 pH 테스트 스트립(10-15μL)으로 pH를 측정합니다.
   3. 박층 크로마토그래피(TLC)
      1. 실리카 함침 TLC 스트립에서 방사성 표지 반응 혼합물 1 μL를 발견합니다. 부분 표본을 약 1분 동안 건조시킵니다. 밀폐된 TLC 챔버에서 약 2-3mm로 미리 채워진 시트르산을 이동상으로 사용하여 TLC를 실행합니다. 액체가 스트립 상단에 도달했을 때 챔버에서 TLC 스트립을 제거합니다.
      2. TLC 스트립을 라디오-TLC 스캐너에 놓고 제조업체의 프로토콜에 따라 측정합니다. 생성물은 원점(R_f < 0.2)에 나타나야 하며, 자유 ⁶⁸Ga 양이온은 용매 전면(R_f > 0.9)으로 용리됩니다.
      3. 방사성 크로마토그램을 사용하여 R_f 0.0-0.2의 AUC(Integrated Area Under the Curve)를 총 AUC(R_f 0.0-1.0)로 나누고 100을 곱하여 반응의 방사성 표지 수율을 계산합니다.
   4. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
      1. 모든 라인이 침수될 수 있도록 올바른 용매를 사용하여 HPLC가 최소 10분 동안 작동했는지 확인하고 측정 설정을 조정하십시오. 아세토니트릴(용매 A)과 트리플루오아세트산(1mL) 및 시트레이트 용액(20mL)과 결합된 0.9% NaCl 용액(980mL)의 혼합물을 50:50 혼합물의 등용매 흐름을 사용합니다.B. 280nm에서 UV 흡광도를 측정합니다.
      2. 생성물 5μL를 취하여 15μL의 0.9% NaCl로 희석합니다. 혼합물 15μL를 분석용 방사성 HPLC(5μm SEC-s2000 154 Å 컬럼, 유속: 2mL/분)에 주입합니다.
      3. 아세토니트릴(용매 A)과 트리플루오아세트산(1mL) 및 시트레이트 용액(20mL)과 결합된 0.9% NaCl 용액(980mL)의 혼합물을 50:50 혼합물의 등용매 흐름을 사용합니다.B. 280nm에서 UV 흡광도를 측정합니다. UV와 감마 채널 사이의 머무름 시간에 약간의 변화가 있습니다. 이는 HPLC의 설계 때문입니다(감마 신호는 UV 검출기 뒤에 직렬로 설치됨).
      4. 방사성 화학적 순도는 감마 채널의 피크를 적분하여 측정합니다. 생성물은 이전에 non-radiolabeled 나노바디를 측정하여 결정된 통합 범위에 있어야 합니다. 또한 감마 채널의 다른 모든 피크를 적분하고 불순물로 평가합니다. 순도는 >95%여야 합니다.
   5. 내독소
      1. (인증된) 내독소가 없는 물을 사용하여 총 부피 150μL로 제품을 1:20 희석하여 희석합니다.
      2. 필요한 모든 시약이 시중에서 판매되는 일회용 내독소 카트리지를 내독소 검사 리더기에 삽입하고 각 카트리지 챔버에 희석된 제품 25μL를 로드합니다.
      3. 재생을 누릅니다. PTS는 내부 양성 및 음성 통제가 있으며 최종 보고서에 포함될 것입니다. 테스트는 약 15분 정도 소요됩니다. 내독소 함량이 V_max = 20mL에서 8.7 EU/mL <인 경우 제품은 내독소가 없는 것으로 간주됩니다.
   6. 후향적 무균
      1. 품질 시료를 주입하고 채취한 후 방사성 의약품을 멸균 바이알에 담아 4°C의 냉장고에 보관합니다.
      2. 10,⁵ Bq 또는 10 Bq/g의 면제 한도를 초과하지 않는 경우 무균 분석을 위한 인증된 기관(사내 또는 외부 기업)에 샘플을 인계하여¹²에 따른 무균 테스트를 수행합니다.
3. 주사기 준비(동물당 1개)
   1. 올바른 설정(동위원소로 ^68Ga, 주사기 1mL, 기하학의 경우 0.1mL)에서 활동도계를 사용하여 제품의 활성을 측정합니다.
   2. 마이크로 원심분리기 튜브에 생성물 15MBq(약 25μL)를 넣고 0.9% NaCl - 75μL로 부피를 채웁니다.
   3. 주사기에 50μL를 추가하고 올바른 설정(동위원소로 ^68Ga, 주사기 1mL, 기하학의 경우 0.1mL)에서 활동계를 사용하여 측정합니다. 주사기에는 10MBq의 제품이 들어 있어야 합니다.
      참고: ⁶⁸Ga 표지 나노바디 NM-02가 형성되는 즉시 ⁶⁸Ga를 취급할 때 플라스틱 피펫 팁이 더 이상 필요하지 않습니다. 여기서부터 프로토콜에서 액체 취급을 언급할 때마다 적절한 주사기(1mL)와 바늘(27-30G)을 사용하십시오.

2. 동물 모델 생성

1. 동물 사육
   1. 피하 종양 발생을 위해 생후 6-8주령에 암컷 면역결핍 Rj: ATHYM-Foxn1^nu/nu 마우스(상용 공급업체에서)를 사용합니다. 도착하면 모든 생쥐를 동물실에 직접 수용하고 순응을 위해 이송 후 최소 1주일을 제공합니다.
   2. 동물을 12시간 조명/12시간 어둠 주기로 수용하고 음식과 물을 무료로 이용할 수 있습니다. 실내 온도와 상대 습도를 각각 20-25 °C 및 45%-65% 사이로 유지하십시오.
2. 이식을 위한 세포의 준비
   1. 1 x 10⁶ SKOV-3 세포로 세포 배양을 시작하고 T175 세포 배양 플라스크에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 농축된 25mL의 예열 DMEM/F12 배지를 추가합니다.
   2. 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에서 세포를 배양하고 일주일에 최소 2회 전체 배지를 교체하십시오.
   3. 세포 이식 1주일 또는 늦어도 1일 전에 세포 배양 플라스크에서 배지 20μL를 채취하여 마이코플라스마¹³을 검사합니다. 세포 주입에는 마이코플라스마 음성 세포만 사용하십시오.
   4. 세포 주입 당일, 전체 배지를 흡인하고 PBS 5mL를 병에 피펫팅합니다. 병을 앞뒤로 여러 번 휘젓어 남은 매체를 씻어냅니다.
   5. 플라스크에 트립신 3mL를 추가하고 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에서 4분 동안 배양하여 세포를 해리합니다. 세포 배양 플라스크에서 세포가 분리되었는지 40배 배율로 현미경 아래를 확인합니다.
   6. 7mL의 배지를 첨가하여 트립신 활성을 중화하고 세포 현탁액을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   7. 150 x g 에서 5분(실온에서) 세포를 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 상층액을 제거하고 배지 1mL를 첨가하여 세포를 재현탁시킵니다.
   8. 마이크로 원심분리 튜브에 세포 현탁액 12μL를 넣고 동일한 양의 트리판 블루를 추가합니다. 혈구계 챔버에 10 μL의 신중하게 혼합된 세포 현탁액을 로드합니다.
   9. 정의된 영역 내에서 염색되지 않고 생존 가능한 세포를 계수하고 세포 수를 계산합니다. 세포 농도를 5 x 10⁷ cells/mL 배지로 조정하고 세포 현탁액을 1mL의 기저막 매트릭스와 조심스럽게 혼합합니다.
   10. 각 마우스에 대해 1mL 인슐린 주사기에 50% 기저막 매트릭스가 있는 0.2mL 세포 배지에 있는 5 x 10⁶ 세포를 채취합니다. 기저막 매트릭스의 응고를 방지하기 위해 주입할 때까지 주사기를 얼음 위에 두십시오.
       알림: 마우스의 무게가 20g 미만인 경우 혼합물을 150μL(15-20g의 경우) 또는 100μL(10-15g의 경우)만 주입하십시오. 피하 적용의 경우 GV-SOLAS에서 권장하는 최대 체중 10mL/kg¹⁴를 초과하지 않도록 주의합니다.
3. 접종 및 후속 조치
   1. 한 손으로 목과 꼬리를 고정하여 깨어 있는 동물의 옆구리에 세포 현탁액을 피하로 주입합니다. 일반적으로 우리는 왼쪽 측면에 주사하는 것을 선호합니다.
   2. 기저막 매트릭스가 굳을 때까지 10-15초 동안 기다린 다음 바늘을 제거합니다.
   3. 디지털 캘리퍼를 사용하여 두 개의 수직 종양 축을 측정하여 이식 후 매일 종양 성장을 모니터링합니다.
   4. 이러한 측정값을 사용하여 다음 공식으로 계산된 종양 부피를 사용하여 종양 성장을 평가합니다.
      V_T = L × B² × π / 6
      여기서 _{V T}^{는 종양의} 부피(mm)3, L은 종양의 길이(mm, 즉, 두 개의 수직 축 중 큰 축), B는 종양의 너비(mm)입니다(즉, 두 개의 수직 축 중 작은 축⁽¹⁵). 이 기술은 피부도 포함하기 때문에 종양의 부피를 과대평가하는 경향이 있습니다.
   5. 종양 질량은 전자 저울에서 측정할 때 마우스의 무게에 영향을 미칩니다. 종양 질량에 대해 보정된 동물의 무게를 계산하려면 다음 공식을 사용하십시오.
      m_{마우스 -T} = m_마우스 - 0.82 × V_T
      여기서 , m,_mouse-T 는 종양 질량을 제외한 마우스 무게(g)이고, m_마우스 는 전자 저울에 따른 마우스 무게(g)이며, V_{, T} 는 계산된 종양 부피(^mm3)입니다. 숫자 0.82 g / mm³ 는 이전 동물 실험에서 분리 된 일련의 종양의 평균값에서 유래 한 것으로, 무게를 측정하고 주어진 공식을 사용하여 부피를 결정했습니다. 이는 평균 종양 밀도를 나타냅니다.
   6. 또한 마우스와 비교하여 종양이 얼마나 큰지 확인하고 다음 공식을 사용하여 종양 부담을 모니터링합니다.
      종양 부담 [%] = (0.82 × V_T) / m_마우스 × 100
      여기서 종양 부담은 백분율로 표시되며, 0.82 × V_T는 g 단위의 종양 질량(즉, VT, 계산된 종양 부피(^mm3, 평균 종양 밀도의 곱하기)에 해당하고, m_마우스는 g의 척도에 따른 마우스 체중입니다.
   7. 동물의 종양 부피가 200mm3 이상에 도달하면 실험에 따라 비침습적 PET/CT 또는 SPECT/CT로 일정을 잡습니다.

3. 이미징

1. 주사기 준비(맞춤형 시스템)
   알림: 마우스 꼬리가 작습니다. 따라서 27G 캐뉼라 이하의 사용이 필요합니다(숫자가 클수록 바늘이 작음). 암컷 마우스의 경우, 볼루스 주사를 위해 접근할 수 있는 유일한 정맥은 세 개의 꼬리 정맥입니다. 해부학적으로 등쪽 꼬리 정맥은 두 개의 측면 정맥에 비해 척추에 더 가깝습니다. 의인성 뼈 긁힘을 피하기 위해 이 정맥에 주입하지 마십시오. 경험에 비추어 볼 때 30G 캐뉼라를 사용하면 더 작은 정맥에도 접근할 수 있으므로 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 30G 카테터는 구매할 수 없기 때문에 이 유형은 연구원이 주의해서 제작해야 합니다.
   1. 계획된 투여 경로에 따라 방사성 추적자로 주사기를 준비합니다. 정맥 주사의 경우 25g 마우스에 대해 최대 5mL/kg 체중이 투여되는지 확인하십시오. 이는 최대 주입 부피가 125μL임을 의미합니다.
   2. 30G 카테터를 준비하려면 먼저 30G 바늘을 사용하고 금속 가위로 또는 플라스틱에서 구부려 금속 바늘 샤프트를 제거합니다.
   3. 0.3mm 직경의 PE10 튜브를 허브에서 제거한 샤프트 부분에 수동으로 삽입합니다. 튜브에 구멍이 뚫리지 않도록 주의해야 합니다.
      알림: 다른 유형의 플라스틱도 사용할 수 있습니다. 그러나 PE10은 벽 강성과 유연성 사이에서 최상의 균형을 제공합니다.
2. 정맥 주사
   참고: 정맥 주사는 깨어 있는 동물에서도 수행할 수 있습니다. 그러나 이것이 필요하지 않은 경우 연구 동물의 부담을 줄이기 위해 동물에게 이소플루란 진정제를 주입해야 합니다.
   1. 30G 카테터를 0.9% NaCl 완충액 또는 기타 원하는 완충액으로 채웁니다.
   2. 마우스를 유도 챔버에 넣고 동물이 오른쪽 반사를 잃을 때까지 산소(또는 의료용 압축 공기)와 기체 이소플루란의 혼합물을 계속 채웁니다. 인덕션의 경우 0.8L/min의 산소 또는 공기 흐름으로 3.5%-5% 이소플루란을 사용합니다.
   3. 즉시 진정제를 투여한 마우스를 콧스코를 통해 이소플루란 진정제를 유지하면서 가열 매트(37-38°C)의 초기 복부 위치에 놓습니다. 마우스에 과열 징후(예: 과도한 스트레칭, 빠른 호흡, 피부 발적)가 있는지 자주 확인하십시오. 마취 유지를 위해 0.8L/min의 산소 또는 공기 흐름으로 1.8%-2.5% 이소플루란을 사용하십시오.
   4. 진정 중 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 바르십시오. 양쪽 측면 꼬리 정맥을 검사하고 주사에 가장 적합한 정맥을 선택합니다. 정맥의 가시성과 직경을 고려해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 선택한 정맥이 가열 매트와 접촉하도록 꼬리를 약간 회전하고 정맥이 1분 동안 확장되도록 합니다.
   5. 선택한 정맥이 위쪽으로 오도록 전체 마우스를 측면 위치로 돌립니다. 꼬리의 끝과 밑부분을 테이프로 고정합니다.
   6. 주로 사용하는 손으로 30G 카테터를 잡고 주로 사용하지 않는 손의 검지 손가락을 선택한 정맥에 부드럽게 올려 놓아 내부에 혈액을 백업합니다. 백업 부위에서 정맥이 확장되어 작은 혹을 형성합니다.
   7. 주로 사용하는 손으로 30G 카테터를 정맥의 혹을 향하는 꼬리와 평행하게 놓습니다. 주로 사용하는 핸드를 앞으로 움직입니다. 대부분의 경우 이 기술은 직접적인 정맥 천자를 보장합니다.
   8. 정맥 내부로 들어가면 플라스틱 튜브에서 혈액 역류가 보입니다. 주사 중에 바늘이 정맥 내부로 움직이지 않도록 플라스틱 튜브를 고정합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에서 30G 바늘에 연결된 추적 주사기를 삽입합니다.
      참고: 추적자의 동적 분포를 평가해야 하는 경우, 동물을 PET 스캐너 베드에 놓고 PET를 시작한 후 다음 사항을 수행해야 합니다.
   9. 추적 주사기의 내용물을 최소 10초 동안 천천히 주입합니다. 30G 바늘을 30G 카테터 시스템에 연결한 상태에서 추적 주사기만 제거하고 0.9% NaCl 버퍼(또는 기타 원하는 버퍼)가 있는 주사기를 연결하여 카테터를 플러시합니다. 주사 절차 중 호흡을 지속적으로 모니터링하고 이소플루란 농도를 조정하여 약 초당 1회 호흡을 유지합니다.
   10. 꼬리 정맥에서 30G 카테터를 제거하고 멸균 면 찜질을 사용하여 출혈을 멈춥니다.
   11. 남은 활성을 측정하려면 30G 카테터, 완충 주사기, 빈 추적 주사기 및 면 찜질을 측정하십시오.
3. PET/CT 획득
   참고: ⁶⁸Ga 표지 나노바디 NM-02의 경우 모든 동물은 작은 동물 PET/CT 시스템으로 이미지화됩니다.
   1. PET 인수
      1. 진정제를 투여한 쥐를 동물 침대의 복부 위치에 놓고 PET 스캐너에 부착합니다. PET의 콧방울로 이소플루란 흐름을 전환하고 0.8L/분의 의료용 공기 중에서 1.5%-2.5% 이소플루란으로 유지하여 스캔 중 동물의 호흡 속도가 분당 75회에서 50회 사이가 되도록 합니다.
      2. 의료용 테이프로 목 뒤의 마우스를 동물 침대에 고정합니다. 필요한 경우 진정 중 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 다시 한 번 바르십시오.
      3. 동물 침대의 가열 패드를 약 80 % 전력으로 켜십시오.이 전력은 약 30 ° C에 해당합니다.
      4. 획득 시간을 45분으로 설정하고 스캔할 관심 영역을 선택합니다. ⁶⁸Ga 를 연구 동위원소로 선택하고 스캔을 시작합니다. 주입된 활성량, 주입 시간, 빈 주사기의 측정 시간을 입력합니다. 하나의 PET 베드 위치는 160mm로, 전신 마우스 스캔에 충분한 길이입니다.
      5. 추적자의 동적 분포를 평가해야 하는 경우 먼저 PET 스캔을 시작하고 수집을 위해 30초 동안 기다린 다음 3.2.9-3.2.10단계를 진행합니다. 추가 출혈을 방지하기 위해 완충 주사기가 부착된 상태로 마우스에 카테터를 그대로 두십시오. 인공물을 피하기 위해 CT 획득 전에 PET가 끝날 때 카테터를 분리할 수 있습니다.
   2. CT 획득
      1. PET 스캐너에서 동물 침대를 분리하고 즉시 CT 스캐너에 연결하십시오. 필요한 경우 꼬리 정맥에서 캐뉼러를 분리하십시오. 정맥 천자 후 최소 30분 후에는 주사 부위가 이미 응고되어 더 이상 출혈이 발생하지 않습니다.
      2. 이소플루란 흐름을 CT 스캐너의 콧방울로 전환합니다.
      3. PET 이미징을 위해 스캔할 동일한 관심 영역을 선택합니다. 표준 획득 프로토콜 선택: 440 μA, 50 kVp, 32 ms 노출 시간 및 960 노출/360°의 나선형 모드에서 1080° 회전; CT 스캔 시간은 전신 마우스 스캔의 경우 약 7분입니다.
      4. 호흡수를 조절하고 동물 침대의 발열 패드를 켭니다. 스캔하는 동안 호흡을 지속적으로 모니터링하고 분당 75회에서 50회 사이의 호흡 속도를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 조정합니다.

4. 포스트 이미징 동물 관리

1. 스캔이 끝나면 동물이 깨어나는 데 최소 15분이 걸립니다. 새끼 새끼의 공격을 피하려면 약 15분 동안 또는 원래 수용 케이지에 다시 넣을 때까지 스스로 걸을 수 있을 때까지 동물을 혼자 우리에 가두십시오. 이 기간 동안 저체온증을 피하기 위해 적외선을 사용하십시오.
2. 처음에는 혈역학적 쇼크를 피하기 위해 동물을 왼쪽(안전한 위치)에 눕힙니다. 안과 연고는 동물이 깨어나면 스스로 제거하므로 그대로 두십시오.

5. PET/CT 재건술

1. 192 × 192 × 384 매트릭스에서 511keV의 피크에서 0.4mm의 등각 복셀 크기까지 ± 15%의 에너지 창으로 3차원 정렬된 하위 집합 기대값 최대화(즉, 30회 반복되는 OSEM-3D)를 사용하여 PET 재구성을 수행합니다. CT 기반 보정(예: 감쇠 보정, 산란 보정, 데드 타임 및 무작위 이벤트)을 PET 재구성에 적용합니다.
2. 트레이서의 동적 분포를 평가해야 하는 경우 다중 프레임 재구성을 적용합니다. 예를 들어, 45분 스캔에 사용할 수 있는 프레임은 4 x 30초, 3 x 1분, 5 x 2분, 2 x 5분 및 2 x 10분입니다.
3. 반복 재구성 알고리즘(즉, ISRA) 재구성 프로세스를 사용하여 200 × 200 × 425 매트릭스에서 0.2mm의 등각 복셀 크기로 CT 표준 획득 프로토콜을 재구성합니다. 공급업체 소프트웨어를 사용하여 다음 공식을 사용하여 CT 값을 Hounsfield 단위(HU)로 변환합니다.
   
   여기서 μ_W 는 물의 선형 감쇠 계수, μ_A 는 공기의 선형 감쇠 계수, μ_t 는 조직의 선형 감쇠 계수입니다.
4. PET 및 CT 이미지는 모세관 팬텀 스캔에서 생성된 매트릭스를 사용하여 재구성 후 자동으로 정렬되었습니다. 재구성된 모든 데이터를 보관하고 필요에 따라 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터베이스 서버로 전송합니다.

6. 이미지 처리 및 분석

참고: 공동 등록된 PET/CT 이미지는 각 하이브리드 스캔이 주제로 저장되는 이미지 분석 소프트웨어의 데이터베이스 서버 내에서 정량화에 추가로 사용됩니다.

1. CT를 기반으로 종양을 식별하고 이를 관심 영역으로 선택합니다. CT에서 종양 기저를 수동으로 마스킹합니다.
2. 사용자 독립적인 분할을 달성하려면 PET 또는 SPECT에서 새로 형성된 종양 마스크의 임계값을 설정합니다. PET 사용의 경우 최소 임계값 1.0 표준화 흡수 값(SUV)을 사용합니다. SPECT의 경우, 심장 또는 말단 복부 대동맥에서 측정된 평균 혈액 풀 흡수량보다 높은 최소 임계값을 사용합니다.
3. 평균, 최대, 가장 인기 있는 10 복셀의 평균(즉, 뜨거운 평균 10) 및 새로 생성된 관심 볼륨의 총 흡수를 기록합니다.
4. 이러한 값을 사용하여 통계 분석에 추가로 사용될 SUV 및 TBR(Target-to-Background) 값을 생성합니다.

방사성 의약품의 품질 관리에서 가장 중요한 측면 중 하나는 HPLC를 사용하는 것인데, 이는 화학적 및 방사성화학적 순도(이 경우 98.2%)를 보여줄 뿐만 아니라 용출 시간과 피크 모양을 비방사성 참조 화합물과 비교하여 방사성 의약품의 정체를 증명할 수 있기 때문입니다. 이 참조 화합물은 이 경우 라벨링되지 않은 나노바디로, 질량 분석법 또는 핵 자기 공명과 같은 고전...

방사선 합성
여기에 설명된 방사성 합성은 새로운 ⁶⁸Ga-표지 화합물에 대한 전형적 특성으로, 합성 시간이 짧고 적절한 pH에 중점을 두고 가능한 한 금속을 피합니다. 이를 위해서는 구성 요소가 추가되는 순서를 엄격하게 따르는 것이 중요합니다. 어쨌든, ⁶⁸Ga 용액의 pH 값은 먼저 3 M NH₄OAc로 pH 4로 조정해야합니다. 그렇지 않으면 pH가 ...

FMM은 NanoMab Technology Ltd. 및 Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH의 의료 자문사입니다. 그는 최근 NanoMab Technology Ltd., Siemens 및 GE Precision Healthcare LLC로부터 기관 보조금을 받았습니다. 또한 그는 CURIOM과 중재 연구 계약을 맺고 있습니다.

저자는 기술 지원에 대해 Susanne Allekotte에게 감사를 표합니다.