약동학 및 약력학 연구를 위한 뇌실 내 약물 전달 및 샘플링

치료제를 중추신경계에 직접 전달하는 것은 혈액뇌장벽을 우회하는 한 가지 방법입니다. 본 프로토콜은 뇌척수액 및 신체 기관의 후속 수집을 위한 뇌실 내 주사를 보여줍니다. 이를 통해 새로운 치료법을 개발하기 위한 동물 모델에서 약물 약동학 및 약력학을 쉽게 조사할 수 있습니다.

혈액뇌장벽(BBB)은 외부 물질로부터 뇌를 보호하지만, 일부 치료제가 질병이나 감염을 개선하기 위해 중추신경계(CNS)로 침투하는 것을 막기도 합니다. 약물은 BBB를 우회하기 위해 동물과 인간의 CNS에 직접 투여됩니다. 본 프로토콜은 항생제, 즉 다제내성 그람 음성 박테리아를 치료하기 위한 최후의 항생제인 폴리믹신(polymyxin)의 뇌실 내 전달을 통해 뇌 감염을 치료하는 독특한 방법을 설명합니다. 쥐의 외심실에 도달하는 가이드 캐뉼라를 이식하기 위해 간단한 정위 수술 프로토콜이 개발되었습니다. 24 시간의 회복 기간이 지나면 쥐는 가이드에 맞는 캐뉼러를 통해 의식적으로 반복적으로 주입 할 수 있습니다. 주사는 느리고 제어된 유속을 얻기 위해 미세 주입 펌프를 사용하여 볼루스 또는 주입으로 수동으로 전달할 수 있습니다. 심실 내 주사는 Evans Blue 염료로 성공적으로 확인되었습니다. 뇌척수액(CSF)을 배출할 수 있으며, 뇌 및 기타 장기를 채취할 수 있습니다. 이 접근법은 CNS로의 약물 전달과 관련된 연구와 약동학 및 약력학 활성의 후속 평가에 매우 적합합니다.

혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)의 중요한 보호 메커니즘입니다. 선택적 투과성 해부학적 장벽은 순환하는 혈액과 그 용질을 뇌의 세포외액에서 분리하여 대부분의 분자가 뇌로 들어가는 것을 막는다 ^1,2,3,4 분자의 크기, 친^유성5, 활성 수송 메커니즘의 유용성 2에 따라 달라진다.

이 보호 장벽은 복잡한 뇌 항상성과 CNS 건강을 효과적으로 조절하는 데 유익합니다 ^4,6. 그러나 뇌 감염이나 다른 중추신경계 질환을 치료하기 위한 약물을 전달하는 것도 어렵게 만든다 ^4,7. 다양한 방법을 사용하여 BBB를 파괴하는 것 외에도 ^8,9, BBB를 우회하는 주요 방법은 뇌척수액(CSF)으로 약물을 방출하여 뇌로 직접 전달하는 것입니다⁴. 상대적으로 침습적인 관행이지만 환자와 실험실 동물에게 표적 치료제를 제공하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 인간의 경우, 약물은 뇌실내 시스템 또는 CSF로 전달될 수 있으며, 이후 외측 심실에 삽입된 카테터에 부착된 두피 아래에 있는 저장소인 옴마야 저장소(Ommaya Reservoir)를 사용하여 샘플링할 수 있습니다^10,11. 설치류와 같은 실험실 동물에서도 동일한 목표를 달성하기 위해 유사한 기술이 확립되었습니다. 미삼투압 펌프를 마우스^12,13,14,15 및 랫트^16,17에 이식하여 심실 시스템 또는 뇌 실질로 약물을 지속적으로 전달했습니다. 또한, 일회용 바늘^(18,19)을 사용하여 마취 된 마우스와 외과적으로 이식 된 캐뉼라^{20 , 21 , 22 , 23}을 사용하여 의식이있는 쥐에서 직접 intrabroventricular 주사를 수행했습니다. 중추신경계로의 약물 전달은 다양한 분야에서 이해를 높이는 매우 유용한 방법이었습니다 20,24,25,26,27,28.

중추신경계 감염은 새로운 치료법과 기존 항감염 요법에 대한 이해가 시급히 필요한 분야 중 하나입니다. 다제내성 그람음성 박테리아에 의한 중추신경계 감염은 특히 우려된다⁷. 폴리믹신(Polymyxin)은 이러한 '슈퍼버그'로 인한 감염을 치료하는 데 점점 더 많이 사용되는 최후의 항생제입니다²⁹. 폴리믹신을 현행 투여 가이드라인³⁰에 따라 정맥 주사할 경우, 중추신경계로의 침투율은 매우 낮지만, 고용량의 경우 신독성의 위험이 증가한다. 따라서 폴리믹신 정맥 주사 요법은 중추신경계 감염을 치료하는 데 거의 도움이 되지 않는다⁷. 폴리믹신을 중추신경계로 전달하기 위한 안전하고 효과적인 투여 요법을 수립하는 것은 시급한 미충족 의료 수요 31,32,33. 따라서, 본 프로토콜은 확립되었으며, 랫드의 CSF에 직접 항생제를 주입하는 것에 초점을 맞추어 기술하고 있다. 그러나 신경독성이 없고 치료 농도를 소량(예: 쥐에서 최대 10μL)으로 투여할 수 있는 모든 약물을 투여하는 데 사용할 수 있습니다. 설명된 기술은 다른 뇌 영역을 표적으로 하고 여러 번 주사하도록 수정할 수도 있습니다.

현재 프로토콜은 효율적인 약동학 및 ICV 투여 후 약물 배포를 가능하게 하는 간단한 수술 및 주사 기술을 제시합니다. 수술에는 가이드 캐뉼라를 이식하는 것이 포함됩니다. 미삼투압 펌프 ^{12,13,14,15,16,17}을 이식하는 것보다 덜 침습적인 절차이기 때문에 CSF에 약물을 단기간 투여하는 데 적합한 고급 옵션입니다. 이 프로토콜은 단순화되어 수술 후 24시간 동안 매우 높은 생존율과 안정적인 체중을 제공할 수 있으며, 이는 기존 방법에 비해 개선된 것입니다³⁴. 수술 후, 의식이 있는 쥐는 최대 혈장 농도를 낮추기 위해 수동 볼루스 ICV 주사 또는 마이크로 펌프를 사용하여 더 느린 전달을 받았습니다. 동시에 그들은 우리 안에서 자유롭게 움직일 수 있습니다. 안전하고 효과적인 약물 투여 요법을 확립하기 위해 CSF, 뇌, 척수, 신장, 혈장 등의 샘플을 사용하여 뇌내실(ICV) 투여 후 약동학 및 약물 분포를 연구했습니다. 예를 들어 면역조직화학 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석 이미징(MALDI-MSI)을 사용하여 약물 분포를 시각적으로 조사할 수도 있습니다. 필요한 경우, 예를 들어, 양측 캐뉼라를 이식하여 양쪽 반구에 일방적으로 배포되는 약물을 주입할 수 있습니다.

모든 실험은 과학적 목적을 위한 동물의 보살핌과 사용에 대한 호주 규정에 따라 수행되었습니다. 실험은 멜버른 대학교 윤리 위원회(application #1914890)의 승인을 받았습니다. 8-14주 된 수컷과 암컷 Sprague-Dawley 쥐가 실험에 사용되었습니다.

1. 외측심실 캐뉼레이션을 위한 입위선 수술

1. 수술 중에는 오토클레이브 면 팁과 수술용 드레이프를 사용하십시오.
2. 수술을 위해 다음을 설정하십시오.
   1. 입체택시 프레임, 마취 전달 시스템, 약물, 화학 물질 및 보조 재료를 설정합니다( 재료 표 참조). 입체 프레임, 광섬유 광원, 휴대용 드릴 등을 80% 에탄올로 청소합니다.
   2. 살균을 위해 22G 가이드 캐뉼러 및 관련 더미 캐뉼러( 재료 표 참조)를 80% 에탄올에 담그십시오.
      알림: 제조업체는 22G 가이드와 더미 캐뉼라를 받침대 아래 ~4mm 길이로 미리 절단했습니다.
   3. 열 비드 살균기를 사용하여 수술 기구( 재료 표 참조)를 20초 동안 살균한 다음 80% 에탄올을 분사합니다. 멸균된 기구를 멸균 드레이프에 놓습니다.
   4. 상자의 절반을 가열 패드 위에 놓고 회수 상자(언더패드가 늘어선 쥐 하우징 상자)를 준비합니다.
3. 수술을 수행합니다.
   1. 에탄올로 세척한 22G 가이드 캐뉼러를 입체식 프레임의 캐뉼러 홀더에 나사로 고정합니다.
   2. 쥐를 유도 챔버(300mm x 200mm, 재료 표 참조)에 넣고 1L/min의 산소에서 5% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
   3. 쥐가 완전히 마취되면(페달 반사 없음) 쥐를 입위 프레임으로 옮기고 노즈 콘을 통한 유지를 위해 1L/분의 산소에서 이소플루란을 2%-3%로 줄입니다. 바이트 바에 이빨을 걸고 코 위로 콧방울을 조심스럽게 당깁니다 - 쥐를 부드럽게 뒤로 당겨 안전한지 확인합니다.
   4. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 보호 눈 윤활제를 바르십시오.
   5. 통증 관리와 수술 후 회복을 위해 식염수에 카프로펜(5mg/kg), 부프레노르핀(0.05mg/kg), 식염수 3mL를 피하주사(s.c.)합니다.
   6. 페달 반사를 확인하기 위해 발가락을 꼬집습니다. 일단 없으면 쥐의 두개골을 프레임에 고정하십시오. 한쪽 이어바를 외이도에 넣고 조입니다. 반대쪽도 반복합니다.
   7. 이어바를 옆으로 움직여 이어바에 표시된 숫자가 양쪽에서 동일한지 확인합니다. 두개골을 눌렀을 때 머리가 움직이지 않아야 합니다.
   8. 이발기로 정수리를 면도합니다. 티슈와 식염수로 머리카락을 닦아냅니다. 필요한 경우 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 아이 루저를 다시 바르십시오.
   9. 각 단계에 대해 멸균 면봉을 사용하여 4% 클로르헥시딘과 알코올성 피부 제제 용액으로 두피를 면봉으로 닦습니다( 재료 표 참조). 두개골 중앙에서 시작하여 모든 표면이 청소될 때까지 바깥쪽으로 원을 그리며 움직입니다.
   10. 의도한 절개 부위를 따라 ~150 μL의 Ropivacaine(1%) s.c.( 재료 표 참조)를 주입합니다.
   11. 메스 날을 사용하여 눈 사이에서 두개골 기저부까지 머리 정중선을 따라 10-15mm 절개를 만듭니다.
   12. 솜털과 메스를 사용하여 결합 조직을 긁어내고 두개골을 드러냅니다.
   13. 멸균된 면 팁을 3% 과산화수소 용액에 담그고 두개골 표면에 바릅니다. 화학 물질이 피부와 반응할 때까지 5초 동안 기다린 다음 마른 면봉으로 해당 부위를 청소하십시오.
   14. 3% 과산화수소를 두 번째로 적용합니다. 이렇게 하면 두개골의 봉합선이 더 선명하게 나타납니다. 화학 물질이 피부와 반응할 때까지 10초 동안 기다렸다가 마른 면봉으로 해당 부위를 청소하십시오. 식염수로 세탁하고 깨끗한 면봉으로 말리십시오.
   15. 소량의 슈퍼 에칭 젤을 화장솜 끝에 조심스럽게 바른 다음 두개골 표면에 바릅니다. 이것은 치과 시멘트가 접착될 수 있는 더 다공성 표면을 만듭니다.
   16. 두개골에 식염수를 넉넉히 바르고 슈퍼 에천트를 씻어내고 깨끗한 면봉으로 말리십시오.
   17. 브레그마를 식별하고 펠트 팁 펜을 사용하여 표시합니다.
   18. 가이드 캐뉼러의 배치를 방해하지 않는 지점에 앵커 나사의 움푹 들어간 부분을 뚫습니다.
       알림: 오른쪽 측면 심실이 캐뉼레이션된 경우 왼쪽 반구와 심실을 기준으로 후방으로 드릴을 뚫습니다.
   19. 드릴을 두개골에 대해 ~75°-80° 각도로 잡고 두개골 두께의 약 절반 깊이로 움푹 들어간 곳을 천천히 뚫습니다. 화장솜 끝에 식염수를 사용하여 뼈 가루를 닦아냅니다.
   20. 두개골이 파손되지 않도록 집게로 움푹 들어간 부분을 단단히 잡고 드라이버로 두개골에 나사로 나사를 조여 조심스럽게 삽입하십시오. 완전히 돌릴 때마다 나사가 단단히 고정되었는지 테스트하십시오.
   21. 두개골이 평평한지 확인합니다. 프레임의 모바일 암을 사용하여 가이드 캐뉼라를 브레그마의 두개골에 닿도록 배치합니다. 모니터를 제어하는 프레임의 버튼을 눌러 Z 평면 좌표를 나타내는 DV(dorsal-ventral)를 0으로 설정합니다.
   22. 프레임의 모바일 암을 사용하여 가이드 캐뉼라(길이 22G 및 4mm)를 올리고 람다로 이동합니다. 두개골 표면에 닿도록 낮추고 DV 디스플레이를 다시 확인합니다.
       참고: 브레그마의 DV와 람다의 DV의 차이는 0.2mm 미만이어야 합니다. 필요한 경우 그에 따라 노즈 콘을 조정하십시오(예: 필요에 따라 쥐의 머리를 위 또는 아래로 움직여 측정).측정을 반복합니다.
   23. 가이드 캐뉼러를 다시 이동하여 브레그마를 터치하고 모니터의 버튼을 눌러 DV, AP(전방-후방) 및 ML(내측-외측)의 세 좌표를 모두 다시 영점화합니다.
   24. 가이드 캐뉼러를 미리 설정된 선택한 좌표로 이동합니다.
       참고: 300-350g의 성체 쥐에서 우측 외측 심실의 캐뉼레이션을 위해 -0.7mm AP, -1.4mm ML 및 -4.00mm DV(가이드 캐뉼라와 동일한 길이)의 좌표가 사용되었습니다.
   25. 마커 펜을 사용하여 캐뉼라의 끝을 색칠한 다음 두개골 표면으로 내려 위치를 터치하고 표시하여 최종 캐뉼라 위치를 표시합니다.
   26. 드릴 샤프트를 수직 직선 위치, 즉 스컬에 대해 2.3° 각도로 유지하여 22G 가이드 캐뉼라용 직경 90mm의 구멍을 뚫습니다. 천천히 그리고 점진적으로 두개골 깊숙이 들어가도록, 즉 뇌 조직을 뚫지 않도록 주의하십시오.
       알림: 필요한 경우 모바일 입체 암을 사용하여 캐뉼러를 구멍으로 내려 캐뉼라를 성공적으로 배치할 수 있는지 또는 추가 드릴링이 필요한지 테스트합니다.
   27. 캐뉼라가 뇌로 내려가면 다시 들어 올리고 캐뉼라의 플라스틱 받침대 아래쪽에 슈퍼 접착제를 조심스럽게 바르고 입체 프레임의 이동식 암을 사용하여 캐뉼라를 구멍으로 다시 내립니다.
   28. 접착제가 굳을 수 있도록 그대로 두십시오.
   29. 기다리는 동안 계량 보트에서 치과 용제와 분말( 재료 표 참조)을 혼합합니다. 치과용 시멘트 분말을 계량 보트에 붓고 1mL 주사기를 사용하여 ~300μL의 용매를 첨가한 다음 동일한 주사기를 사용하여 걸쭉해지고 사용 가능한 농도가 될 때까지 혼합합니다. 필요한 경우 점도를 높이기 위해 더 많은 분말을 추가하거나 점도를 줄이기 위해 더 많은 용매를 추가하십시오.
   30. 전용 나사를 사용하여 캐뉼러 홀더에서 캐뉼러를 풀고 암을 조심스럽게 들어 올립니다.
       알림: 캐뉼라는 90° 각도로 두개골에 접착되어야 합니다.
   31. 일회용 1mL 주사기에 새 치과용 시멘트를 뽑아 캐뉼라 주위에 도포하여 노출된 두개골에 바르십시오. 피부나 캐뉼라 입구에 치과 시멘트를 묻히지 마십시오. 일관성에 따라 몇 초 동안 설정하십시오.
   32. 치과용 시멘트가 두꺼워지면 주걱을 사용하여 치과용 시멘트를 더 바르고 나사를 완전히 덮는 최종 헤드 마운트를 형성합니다.
       알림: 더미 캐뉼라가 여전히 나사로 고정될 수 있도록 캐뉼라를 너무 많이 덮지 않도록 주의하십시오. 피부에서 과도한 치아 시멘트를 제거하십시오.
   33. 치과 시멘트가 건조되고 단단해지면 멸균 더미 캐뉼라를 삽입하십시오.
   34. 이소플루란을 끄고, 이어바를 해제하고, 프레임에서 쥐를 제거하고 회수 상자에 넣습니다.
   35. 동물이 회복되면 ~15-30분 후에 깨끗한 하우징 박스에 보관합니다.
       참고: 수술 후 쥐는 단독 주택이 필요합니다. 헤드 마운트와의 간섭 위험을 최소화하기 위해 푸드 호퍼가 케이지 안으로 내려가는 표준 그리드 케이지 상단을 전용 높게 올려진 그리드 케이지 상단으로 교체하는 것이 좋습니다. 또는 동물의 사육 높이보다 훨씬 낮은 케이지 부분을 차단하십시오.
   36. 모니터링 체크리스트를 작성하고 프로토콜에 설명된 모니터링 지침에 따라 모니터링합니다.
       알림: 손이 닿기 쉽도록 바닥에 음식 알갱이를 놓는 것을 고려하십시오. 실험을 방해하지 않는 경우, 수술 후 추가 SC 주사를 대체하기 위해 단 음식으로 추가 통증 완화를 제공할 수 있습니다(예: 달콤한 견과류 초콜릿 페이스트와 혼합된 부프레노르핀 35,36,37). 이 경우, 통증 완화를 제공할 때 음식 신공포증을 피하기 위해 수술 전후에 보상으로 동일한 과자를 제공했습니다. 너트 페이스트는 케이지 벽에 부착된 테이프에 제공될 수 있습니다.
   37. 가이드 캐뉼러나 주입 캐뉼라보다 더미 캐뉼라를 더 많이 비축하면 실수로 벗겨지면 동물 케이지 침구 사이에서 길을 잃을 수 있습니다. 이러한 경우 캐뉼라를 새로운 멸균 더미 캐뉼러로 교체하십시오.

2. ICV 주사

1. 약물 및 비히클(예: 0.9% 멸균 식염수에 30mg/mL의 폴리믹신 B( 재료 표 참조)을 준비합니다. 체중이 300-400g 사이인 성인 쥐에서 주입량을 5-10μL 사이로 유지하십시오.
2. 수술 후 최소 24시간이 지나면 쥐의 무게를 측정하고 시술실로 운반합니다.
3. 쥐의 몸무게를 사용하여 주입량을 계산합니다.
4. 케이지 뚜껑을 제거하고 더미 캐뉼라의 나사를 풉니다.
   참고: 쥐는 일반적으로 새장에 부드럽게 안을 때 가만히 앉아 있으며 제지가 필요하지 않습니다. 티 타월은 호기심이 많거나 신경질적인 쥐 또는 광대뼈의 간지러움에 사용할 수 있습니다.
5. 볼루스 주입의 경우 튜브의 한쪽 끝을 주사기의 고정 또는 탈착식 바늘 위로 당기고 단단히 밀봉되도록 하여 최소 40cm 길이의 PE-50 튜브( 재료 표 참조)를 10μL 기밀 마이크로 주사기에 부착합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 장착된 인젝터 캐뉼러를 부착합니다.
   1. 캐뉼러를 통해 필요한 양을 그립니다. 캐뉼라가 장착되고 주입될 때까지 가이드에 삽입합니다. 모든 액체가 주입되면 역류를 방지하기 위해 최소 1분 동안 주사기 플런저를 제자리에 유지합니다.
6. 전달 속도를 늦추려면 마이크로 주입 펌프를 사용하여 약물을 주입하십시오( 재료 표 참조).
   1. 먼저 여과수와 1G 드로잉업 바늘이 있는 일회용 23mL 주사기를 사용하여 PE-50 튜브를 완전히 채웁니다. 그런 다음 드로잉 업 바늘에서 일회용 주사기를 제거하고 마이크로 주사기로 교체하십시오.
   2. 1-3μL를 뒤로 당겨 작지만 눈에 띄는 기포를 만듭니다. 그런 다음 필요한 양의 약물을 작성하십시오. 선택적으로, 약물 흐름의 가시성을 높이기 위해 기포를 마커로 표시합니다. 펌프의 제자리에 주사기를 잠급니다.
      알림: 사용된 약물 및 장비에 대한 올바른 설정, 즉 사용 설명서에 따라 사용되는 주사기의 전달 속도와 내경을 설정하는지 확인하십시오.
7. 모든 액체가 주입되면 자동으로 멈추지 않으면 펌프를 중지하십시오. 역류를 방지하기 위해 바늘을 최소 1분 더 삽입한 상태로 두십시오.
8. 인젝터 캐뉼러를 천천히 제거하고 가이드 캐뉼러를 조입니다.
9. 에탄올과 DI 워터를 각각 3회씩 끌어 배출하여 장비를 청소합니다.

3. CSF 및 조직 샘플링

1. 쥐를 시술실로 이송합니다.
2. 쥐를 유도 챔버에 놓고 호흡이 느려질 때까지(~ 5분) 2L/min 산소에 5% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
3. 쥐를 입위 프레임으로 옮기고 콧방울을 통해 동일한 수준의 깊은 마취를 유지합니다.
4. 페달 반사를 확인하십시오. 일단 없으면 이어 바를 사용하여 프레임에 두개골을 고정하십시오.
   참고: 이것은 디스플레이, 둥근 이어바 또는 움직일 수 있는 팔이 없는 더 단순한 입체 프레임일 수 있습니다. 이는 복구가 아닌 절차입니다. 필요한 단일 기능은 모든 쥐 귀바입니다.
5. 노즈 콘을 사용하여 쥐의 코를 약 45°로 아래쪽으로 기울여 목이 좋은 작업 위치에 노출되도록 합니다.
6. 작고 뭉툭한 구부러진 가위를 사용하여 두개골을 만지고 두개골 끝까지 후방으로 움직입니다. 이 위치에서 목의 정중선을 통해 약 2-3cm 길이의 가장 바깥쪽 근육층을 자릅니다. 다른 모든 근육층을 조심스럽게 잘라냅니다.
   1. 작은 스프링 견인기를 사용하여 상처를 열고 잘 볼 수 있도록 합니다. 수조 마그나 막이 보일 때까지 자릅니다. 화장솜 팁을 사용하여 더 이상 피부를 부드럽게 제거하십시오.
7. 출혈이 발생하면 거즈를 사용하여 청소하고 출혈을 멈춥니다.
8. 필요한 경우 작은 롤링 조직 스트립을 사용하여 수조 마그나 주위에 놓아 혈액이 CSF를 오염시키지 않도록 합니다.
   참고: 염료를 사용한 주입의 성공 여부를 확인하려면 장착된 캐뉼라와 일회용 1mL 주사기를 사용하여 CSF를 수집하기 전에 마취된 쥐에 2-3μL의 1.1% Evans Blue 염료( 재료 표 참조)를 주입합니다.
9. CSF 추출을 위한 도구를 준비하려면 주사기에 ~500μL의 여과수를 채우고 23G 드로잉 업 바늘을 부착한 다음 바늘 위로 튜브를 당깁니다. 당겨진 유리 피펫을 튜브의 다른 쪽 끝에 부착합니다.
10. CSF를 추출하려면 당겨진 피펫을 노출된 수조 마그나에 천천히 삽입합니다.
    참고: CSF는 천천히 수동적으로 파이펫으로 흘러 들어가 주사기를 사용하여 능동적으로 주입됩니다. 염료를 주입하면 CSF가 파란색으로 변합니다(그림 1).
11. 라벨이 붙은 튜브에 CSF를 넣고 즉시 드라이아이스에 올려 놓습니다. 그런 다음 CSF를 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
12. 분석을 위해 다른 관심 조직을 수집합니다. 혈장의 경우 최소 3mL의 심장 혈액을 채취합니다.
    1. 깊이 마취된 쥐를 등에 눕히고 흉강을 열어 심장을 드러냅니다. 지혈제를 사용하여 흉곽을 조이고 동물의 목에 올려 놓아 시야를 확보합니다. 고리가 달린 조직 겸자를 사용하여 우심실을 잡고 18G 바늘이 달린 5mL 일회용 주사기를 중격과 평행하게 좌심실에 삽입합니다. 주사기로 혈액을 천천히 빼냅니다. 3-5mL의 혈액이 채취되면 심장에서 바늘을 제거합니다.
13. 주사기에서 바늘을 제거하고 날카로운 용기에 넣으십시오. 혈액을 헤파린 처리된 튜브로 옮기고 2,739 x g 및 4°C에서 15분 동안 회전한 후 200μL 피펫으로 상층액을 수집하고 드라이아이스에서 스냅 동결합니다.
14. 가위로 심장을 제거하여 쥐를 안락사시킵니다. 이소플루란 공급을 끕니다.
15. 신장이나 비장과 같은 관심 있는 다른 복부 기관을 수집합니다. 장기를 식별하고, 고리가 있는 조직 집게로 관심 장기를 잡고, 들어 올리고, 부착물을 자릅니다. 장기를 라벨이 붙은 튜브에 넣고 드라이 아이스에서 얼립니다.
16. 뇌를 제거하려면 날카롭고 큰 가위로 두개골 바닥을 잘라 동물의 목을 베십시오. 헤드 마운트를 손으로 잡아당깁니다. 두개골을 덮고 있는 나머지 피부를 잘라냅니다.
17. 해부 가위를 사용하여 기저부에서 람다까지 정중선의 두개골을 절단합니다. 즉, 후두상골을 반으로 자릅니다. 지혈제를 사용하여 반쪽을 잡고 겹쳐 치우십시오. 소뇌가 완전히 드러나도록 반대쪽도 반복합니다.
18. 시상 봉합사를 따라 전두골까지 절단합니다. 지혈제를 사용하여 각 두정골을 잘라냅니다. 필요한 경우 전두골을 더 자르고 더 많은 뼈를 제거하여 후각구를 노출시킵니다.
19. 머리를 거꾸로 들고 주걱으로 뇌를 조심스럽게 떼어내고, 주걱으로 뇌를 절단하여 시신경과 삼차신경에서 뇌를 분리한다. 뇌를 튜브에 모아 드라이아이스에 얼립니다.
20. 염료를 주입하면 뇌실이 파란색으로 염색됩니다. 일회용 칼날을 사용하여 주사 부위(그림 2A, B)와 ~1cm 후방(그림 2C)에서 뇌를 절단하여 심실의 염료 분포를 조사합니다.
21. 척수를 제거하려면 쥐의 등쪽 표면의 정중선을 따라 피부를 잘라 척추를 노출시킵니다. 척추동물 주위를 양측으로 절개하고 요추 척수의 꼬리 끝에서 가로로 절단하여 척추 기둥을 절제합니다.
22. 척수 전체가 노출될 때까지 가위를 사용하여 기둥을 따라 얇은 판을 양측으로 자릅니다. 한쪽 끝, 예를 들어 상부 끝에서 척수를 들어 올리고 모든 신경이 절단될 때까지 꼬리 방향으로 척추 신경을 절단하여 추출합니다. 척수를 튜브에 모아 드라이 아이스에서 얼립니다.
    참고: 데이터 분석을 위해 장기 채취 전후에 모든 튜브의 무게를 잰다. 필요하고 적절한 경우, 뇌척수액 채취 후 및 뇌 채취 전에 심실 시스템을 세척하여 심실 구획에 남아 있는 약물을 제거할 수 있습니다. 튜브에 부착된 식염수가 채워진 1mL 주사기와 주입기 캐뉼러를 사용하여 가이드 캐뉼라에 삽입합니다. 식염수 2-3mL를 주사합니다. 식염수는 수조 마그나의 개구부에서 나와야 합니다. 가이드 캐뉼러, 더미 캐뉼러 및 나사는 아세톤에 24시간 동안 담근 후 의료용 세제와 물로 담그고 세척하여 재사용할 수 있습니다. 건조되면 미세한 집게를 사용하여 잔여 치과 시멘트를 제거할 수 있습니다.

제시된 수술 프로토콜은 매우 성공적이었으며, 훈련된 외과의의 생존율이 >99.8%에 달하고 동물은 수술 전 0일차에 비해 수술 후 1일차에 안정적인 체중을 보였습니다(0일차의 평균 ± SD 315.8g ± 42.1g, 1일차의 경우 314.1g ± 43.0g, 그림 3).

CSF를 채취하기 전에 이식된 캐뉼라에 1.1% Evans Blue 염료를 주입하면 주사가 의도한 위치로 전달되...

연구자와 임상의는 ICV 주사를 사용하여 BBB의 보호 메커니즘을 우회하고 약물을 CNS로 직접 전달합니다 12,18,19,21,24. 본 연구는 약물을 중추신경계로 효율적으로 전달하고 약동학 분석을 위해 CSF를 추출하기 위한 완전한 ICV 프로토콜입니다. 실험 시작...

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

저자들은 동물을 제공하고 돌봐준 멜버른 대학의 생물의학 동물 시설에 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 국립 알레르기 및 전염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases, R01 AI146241, GR 및 TV)의 연구 보조금으로 지원되었습니다. JL은 호주 국립보건의학연구위원회(NHMRC)의 수석 연구원입니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 미국 국립알레르기·전염병연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases) 또는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 공식 견해를 대변하는 것은 아닙니다.