薬物動態および薬力学研究のための脳室内薬物送達およびサンプリング

治療薬を中枢神経系に直接送達することは、血液脳関門を回避する1つの方法です。現在のプロトコルは、脳脊髄液および身体器官のその後の収集のための脳室内注射を示しています。これにより、新しい治療法を開発するための動物モデルにおける薬物動態と薬力学の研究が容易になります。

血液脳関門(BBB)は、脳を異物から保護しますが、一部の治療薬が中枢神経系(CNS)に渡って病気や感染症を改善するのを防ぎます。薬物は、BBBを回避するために、動物や人間の中枢神経系に直接投与されます。本プロトコルは、抗生物質、すなわちポリミキシン、多剤耐性グラム陰性菌を治療するための最終選択の抗生物質の脳室内送達を通じて脳感染症を治療するユニークな方法を説明しています。ラットの側脳室に到達するガイドカニューレを埋め込むために、簡単な定位固定術プロトコルが開発されました。24時間の回復期間の後、ラットはガイドに取り付けられたカニューレを介して意識的に繰り返し注射することができます。注入は、ボーラスとして手動で送達するか、マイクロインジェクションポンプを使用して注入して、ゆっくりと制御された流量を得ることができます。脳室内注射は、Evans Blue色素で成功裏に確認されました。脳脊髄液(CSF)を排出し、脳や他の臓器を採取することができます。このアプローチは、CNSへの薬物送達とその後の薬物動態活性および薬力学的活性の評価を含む研究に非常に適しています。

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)の重要な保護メカニズムです。選択的に透過性のある解剖学的バリアは、循環する血液とその溶質を脳の細胞外液から分離し、したがって、ほとんどの分子が脳1,2,3,4に入るのを防ぎます。これは、そのサイズ、親油性5、および能動的輸送メカニズム2の利用可能性によって異なります。

この保護バリアは、複雑な脳の恒常性と中枢神経系の健康の効果的な調節に有益です^4,6。しかし、脳内の感染症や他の中枢神経系疾患を治療するための薬剤を送達することも困難にします^4,7。さまざまな^方法8,9を使用してBBBを破壊することとは別に、BBBを回避するための主要なアプローチは、薬物を脳脊髄液(CSF⁾⁴に放出することにより、薬物を直接脳に送達することです。比較的侵襲的な手法ですが、患者や実験動物に標的治療薬を届けるために成功裏に使用されています。ヒトでは、薬物を脳室内システムまたはCSFに送達し、続いて、側脳室^10,11に挿入されたカテーテルに取り付けられた頭皮の下にあるリザーバーであるOmmyaリザーバーを使用してサンプリングすることができる。同様の技術は、同等の目標を達成するために、げっ歯類などの実験動物でも確立されています。微小浸透圧ポンプをマウス^{12、13、14、15}およびラット^16、17に移植し、心室系または脳実質への連続的な薬物送達を行った。さらに、麻酔をかけたマウスでは使い捨て針^18,19を用いて、意識のあるラットでは外科的に移植されたカニューレ20,21,22,23を用いて、直接脳室内注射を行った。CNSへの薬物送達は、さまざまな分野での理解を深めるための非常に貴重な方法である20,24,25,26,27,28。

中枢神経系感染症は、新しい治療法と既存の抗感染症療法の理解を深めることが緊急に必要とされている分野の1つです。多剤耐性グラム陰性菌によって引き起こされるCNS感染症は特に懸念されます⁷。ポリミキシンは、これらの「スーパーバグ」²⁹による感染症の治療にますます使用される最終選択の抗生物質です。ポリミキシンが現在の投与ガイドライン³⁰に従って静脈内投与される場合、CNSへの浸透は非常に低く、高用量は腎毒性のリスクを高めます。したがって、ポリミキシンの静脈内療法は、CNS感染症の治療にはほとんど役に立ちません⁷。ポリミキシンを中枢神経系に送達するための安全で効果的な投与計画を確立することは、緊急のアンメットメディカルニーズである31,32,33。したがって、本プロトコルが確立され、ラットのCSFに直接抗生物質を注射することに焦点を当てて説明されています。ただし、神経毒性がなく、治療濃度を少量(例:ラットで最大10μL)投与できる任意の薬物の投与に使用できます。記載されている技術は、異なる脳領域を標的とし、複数回の注射を送達するように変更することもできます。

現在のプロトコルは、効率的な薬物動態と薬物のICV投与後の分布を可能にする簡単な手術と注射技術を提示します。手術には、ガイドカニューレの埋め込みが含まれます。これは、微小浸透圧ポンプ12,13,14,15,16,17の移植よりも侵襲性の低い手順であるため、これはCSFへの薬物の短期投与に適した高度なオプションである。このプロトコルは簡素化されており、手術後24時間で非常に高い生存率と安定した体重を生み出すことができ、これは既存の方法と比較して改善されています³⁴。手術後、意識のあるラットは、手動ボーラスICV注射を受けたか、マイクロポンプを使用してピーク血漿濃度を下げるためのゆっくりとした送達を受けました。同時に、彼らはケージの中で自由に動くことができました。安全で効果的な薬物投与計画を確立するために、CSF、脳、脊髄、腎臓、血漿などのサンプルを使用して、脳室内(ICV)投与後の薬物動態と薬物分布を研究しました。薬物分布は、免疫組織化学やマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング(MALDI-MSI)などを使用して、視覚的に調査することもできます。必要に応じて、両側カニューレを埋め込むことができ、例えば、そうでなければ両半球に一方的に分布する薬物を注射することができます。

すべての実験は、科学目的での動物の世話と使用に関するオーストラリアの規則に従って行われました。 実験はメルボルン大学の倫理委員会によって承認されました（アプリケーション#1914890)。実験には、8〜14週齢の雄と雌のSprague-Dawleyラットを使用しました。

1. 側方脳室カニューレ挿入のための脳定位固定術

1. 手術中は、オートクレーブ加工されたコットンチップとサージカルドレープを使用してください。
2. 手術のために以下を設定します。
   1. 定位固定装置、麻酔送達システム、薬物、化学薬品、および補助材料を設定します(材料の表を参照)。 脳定位固定装置フレーム、光ファイバー光源、ハンドヘルドドリルなどを80%エタノールで清掃します。
   2. 22 Gガイドカニューレと関連するダミーカニューレ( 材料の表を参照)を80%エタノールに浸して滅菌します。
      注:メーカーは、22Gガイドとダミーカニューレを台座から~4mmの長さに事前にカットしました。
   3. 手術器具( 材料の表を参照)をヒートビーズ滅菌器を使用して20秒間滅菌し、次に80%エタノールをスプレーします。滅菌した器具を滅菌ドレープの上に置きます。
   4. リカバリーボックス(アンダーパッドが裏打ちされたラットハウジングボックス)を準備し、ボックスの半分を加熱パッドの上に置きます。
3. 手術を行います。
   1. エタノール洗浄した22Gガイドカニューレを脳定位固定装置フレームのカニューレホルダーにねじ込みます。
   2. ラットを誘導チャンバー(300 mm x 200 mm、 材料表を参照)に入れ、1 L / minの酸素で5%イソフルランで麻酔を誘発します。.
   3. ラットが深く麻酔されたら(ペダル反射なし)、ラットを定位固定装置フレームに移動し、イソフルランを1 L / minの酸素で2%〜3%に減らして、ノーズコーンを介した維持を行います。.歯をバイトバーに引っ掛け、ノーズコーンを慎重に鼻の上に引っ張ります-ラットを優しく引き戻して、しっかりと固定されていることを確認します。
   4. 乾燥を防ぐために、両目に保護用のアイローションを塗布します。
   5. カルプロフェン(5 mg / kg)、ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)を生理食塩水に注入し、3 mLの生理食塩水を皮下(s.c.)に注射して、痛みの管理と術後の回復を助けます。.
   6. つま先をつまんでペダル反射をチェックします。不在になったら、ラットの頭蓋骨をフレームに固定します。片方のイヤーバーを外耳道に入れて締めます。反対側で繰り返します。
   7. イヤーバーを横に動かして、イヤーバーに与えられた数字が両側で等しくなるようにします。頭蓋骨を押し下げるとき、頭が動かないようにしてください。
   8. バリカンで頭のてっぺんを剃ります。ティッシュと生理食塩水で髪を拭き取ります。必要に応じて、乾燥を防ぐために両目にアイローションを再度塗布します。
   9. 各ステップで滅菌綿棒を使用して、4%クロルヘキシジンとアルコール性皮膚調製液で頭皮を綿棒で拭きます( 材料の表を参照)。.頭蓋骨の中心から始めて、すべての表面がきれいになるまで外側に円を描くように移動します。
   10. 目的の切開部位に沿って~150 μLのロピバカイン (1%) s.c. ( 材料表を参照) を注入します。
   11. メスの刃を使用して、目の間から頭蓋骨の基部まで、頭の正中線に沿って10〜15mmの切開を行います。
   12. 綿の先端とメスを使って結合組織をこすり落とし、頭蓋骨を露出させます。
   13. 滅菌綿の先端を3%過酸化水素溶液に浸し、頭蓋骨の表面に塗布します。化学物質が皮膚と反応するまで5秒待ってから、乾いた綿の先端でその部分をきれいにします。
   14. 3%の過酸化水素を2回目に塗布します。これにより、頭蓋骨の縫合線がよりはっきりと見えるようになります。化学物質が皮膚と反応するまで10秒待ってから、乾いた綿の先端でその部分をきれいにします。生理食塩水で洗い、清潔な綿の先端で乾かします。
   15. コットンチップに少量のスーパーエッチングジェルを丁寧に塗り、頭蓋骨の表面に塗ります。これにより、歯科用セメントが接着するためのより多孔質な表面が作成されます。
   16. 頭蓋骨に生理食塩水をたっぷりと塗ってスーパーエッチャントを洗い流し、きれいな綿の先端で乾かします。
   17. ブレグマを特定し、フェルトペンを使用してマークします。
   18. ガイドカニューレの配置を妨げない場所にアンカースクリューのくぼみをドリルで開けます。
       注:右側脳室がカニューレ挿入されている場合は、左半球で心室に対して後方にドリルで穴を開けます。
   19. ドリルを頭蓋骨に対して~75°-80°の角度で保持し、頭蓋骨の厚さの約半分の深さでくぼみをゆっくりとドリルします。綿の先端に生理食塩水を使用して、骨のほこりを拭き取ります。
   20. ネジは鉗子でくぼみにしっかりと保持し、ドライバーで頭蓋骨にねじ込むことで、頭蓋骨の破損を防ぎます。各完全な回転の後、ネジがしっかりと固定されているかどうかをテストします。
   21. 頭蓋骨が平らであることを確認します。フレームの可動アームを使用して、ガイドカニューレをブレグマの頭蓋骨に触れるように配置します。フレーム制御モニターのボタンを押して、Z平面座標を表すDV(背側-腹側)をゼロにします。
   22. フレームの可動アームを使用してガイドカニューレ(22G、長さ4mm)を持ち上げ、ラムダに移動します。頭蓋骨の表面に触れるように下げ、DVディスプレイに再度注目します。
       注: ブレグマでの DV とラムダでの DV の差は 0.2 mm 未満である必要があります。必要に応じて、それに応じてノーズコーンを調整します、つまり、必要に応じてラットの頭を上下に動かし、測定を繰り返します。
   23. ガイドカニューレをタッチブレグマに戻し、モニターのボタンを押して、DV、AP(前後)、ML(内側外側)の3つの座標すべてを再ゼロにします。
   24. ガイドカニューレを事前に設定された選択した座標に移動します。
       注:300〜350 gの成体ラットの右側脳室のカニューレ挿入には、-0.7 mm AP、-1.4 mm ML、および-4.00 mm DV(ガイドカニューレと同じ長さ)の座標を使用しました。.
   25. マーカーペンを使用してカニューレの端に色を付け、頭蓋骨の表面まで下げて位置に触れてマークすることにより、最終的なカニューレの位置をマークします。
   26. ドリルシャフトをまっすぐな垂直位置、つまりスカルに対して90°の角度で保持することにより、22Gガイドカニューレ用の直径2.3mmの穴を開けます。ゆっくりと徐々に頭蓋骨の奥深くに移動するように、つまり脳組織に穴を開けないように注意してください。
       注意: 必要に応じて、可動式脳定位固定装置アームを使用してカニューレを穴に下げ、カニューレを正常に配置できるかどうか、またはさらに穴あけが必要かどうかをテストします。
   27. カニューレが脳に下がったら、カニューレを持ち上げ、カニューレのプラスチック台座の下側に瞬間接着剤を慎重に塗布し、脳定位固定フレームの可動アームを使用してカニューレを穴に戻します。
   28. 接着剤が固まるまでそのままにしておきます。
   29. 待っている間、計量ボートで歯科用溶剤と粉末( 材料の表を参照)を混ぜます。デンタルセメントパウダーを計量ボートに注ぎ、1mLのシリンジを使用して~300μLの溶媒を加え、同じシリンジを使用して濃くなり使用可能な濃度になるまで混合します。必要に応じて、粉末を追加して粘度を上げるか、溶剤を追加して粘度を下げるようにします。
   30. 専用ネジを使用してカニューレをカニューレホルダーから外し、アームを慎重に持ち上げます。
       注:カニューレは90°の角度で頭蓋骨に接着する必要があります。
   31. 露出した頭蓋骨に新鮮な歯科用セメントを貼り付けるには、使い捨ての1mLシリンジに引き込み、カニューレの周りに貼り付けます。皮膚やカニューレの開口部に歯科用セメントが付着しないようにしてください。一貫性にもよりますが、数秒間設定します。
   32. 歯科用セメントが厚くなったら、スパチュラを使用してさらに歯科用セメントを塗布し、ネジ全体を覆う最終的なヘッドマウントを形成します。
       注意: ダミーのカニューレをねじ込むことができるように、カニューレを覆いすぎないように注意してください。皮膚から余分な歯科用セメントを取り除きます。
   33. 歯科用セメントが乾いて固まったら、滅菌ダミーカニューレを挿入します。
   34. イソフルランの電源を切り、イヤーバーを放し、ラットをフレームから取り外してリカバリーボックスに入れます。
   35. 動物が回復したら、15~30分で清潔なハウジングボックスに保管します。
       注:手術後、ラットは一軒家である必要があります。フードホッパーがケージ内に下がる標準的なグリッドケージトップを、ヘッドマウントとの干渉リスクを最小限に抑えるために、専用の高盛り上がりグリッドケージトップに交換することを検討してください。あるいは、動物の飼育高さよりもはるかに低いケージの部分をブロックします。
   36. 監視チェックリストに記入し、プロトコルに概説されている監視ガイドラインに従って監視します。
       注意: 手が届きやすいように、いくつかの食品ペレットを床に置くことを検討してください。それが実験を妨げない場合、追加の手術後皮下注射、例えば、甘いナッツチョコレートペースト35,36,37と混合されたブプレノルフィンを置き換えるために、甘い食品に追加の痛みの緩和を提供することができる。この場合、痛みの緩和を提供するときに食物恐怖症を避けるために、手術の前後に報酬として同じ甘いものの一部が提供されました。ナットペーストは、ケージの壁に取り付けられたテープで提供できます。
   37. ガイドカニューレや注射カニューレよりも多くのダミーカニューレをストックしてください、なぜなら、誤って外れた場合、動物ケージの寝具の中で迷子になる可能性があるためです。このような場合は、カニューレを新しい滅菌ダミーカニューレと交換してください。

2. ICV注射

1. 薬物とビヒクル、例えば、0.9%滅菌生理食塩水中のポリミキシンB( 材料の表を参照)30 mg / mLを準備します。.体重が300〜400 gの成体ラットでは、注入量を5〜10μLに保ちます。.
2. 手術後少なくとも24時間で、ラットの体重を量り、処置室に運びます。.
3. ラットの体重を使用して注入量を計算します。
4. ケージの蓋を取り外し、ダミーのカニューレを緩めます。
   注:ラットは通常、ケージにそっと保持するとじっと座っており、拘束する必要はありません。ティータオルは、好奇心旺盛なネズミや神経質なネズミ、または頬骨のくすぐりに使用できます。
5. ボーラス注射の場合は、長さ40 cm以上のPE-50チューブ( 材料表を参照)を10 μLの気密マイクロシリンジに取り付け、チューブの一方の端をシリンジの固定針または取り外し可能な針に引っ張り、しっかりと密閉します。.取り付けられたインジェクターカニューレをチューブのもう一方の端に取り付けます。
   1. カニューレを通して必要な量を描きます。カニューレをガイドに装着するまで挿入し、注入します。すべての液体が注入されたら、逆流を避けるために、シリンジプランジャーを少なくともさらに1分間所定の位置に保持します。
6. 送達速度を遅くするには、マイクロインジェクションポンプを使用して薬物を注入します( 材料の表を参照)。
   1. まず、ろ過水と使い捨ての1mLシリンジと23Gのドローアップニードルを使用して、PE-50チューブを完全に充填します。次に、使い捨てシリンジをドローアップニードルから取り外し、マイクロシリンジと交換します。
   2. 1〜3μLを戻して、小さいながらも目に見える気泡を作ります。次に、必要な量の薬を描きます。必要に応じて、気泡にマーカーで印を付けて、薬物の流れが見えるようにします。シリンジをポンプの所定の位置にロックします。
      注意: 使用する薬剤と機器の設定が正しいことを確認します、つまり、ユーザーマニュアルに従って使用する注射器の送達速度と内径を設定します。
7. すべての液体が注入されたら、ポンプが自動的に停止しない場合はポンプを停止します。逆流を避けるために、針を少なくともさらに1分間挿入したままにします。
8. インジェクターカニューレをゆっくりと取り外し、ガイドカニューレをねじ込みます。
9. エタノールと脱イオン水をそれぞれ3回ずつ吸い上げて排出することにより、装置を清掃します。

3. CSFおよびティッシュ サンプリング

1. ラットを処置室に運びます。
2. ラットを誘導室に置き、呼吸が遅くなるまで(~5分)、2 L / min酸素中の5%イソフルランで麻酔を誘発します。
3. ラットを定位固定装置フレームに移動し、ノーズコーンを通じて同じレベルの深部麻酔を維持します。
4. ペダル反射を確認してください。不在になったら、イヤーバーを使用して頭蓋骨をフレームに固定します。
   注:これは、ディスプレイのないシンプルな定位固定装置フレーム、丸みを帯びたイヤーバー、または可動アームにすることができます。これは非回復手順です。必要な機能は、ラットイヤーバーです。
5. ノーズコーンを使用して、ラットの鼻を約45°下向きに傾けて、首を良好な作業位置に露出させます。
6. 小さくて鈍い湾曲したはさみを使用して、頭蓋骨を触り、頭蓋骨の端まで後方に移動します。この位置で、首の正中線を約2〜3 cmの長さで、最も外側の筋肉層を切り取ります。他のすべての筋肉層を慎重に切り取ります。
   1. 小さなスプリングリトラクターを使用して傷口を開いたままにし、視界を良くします。大槽膜が見えるまで切ります。綿の先端を使用して、これ以上の皮膚をやさしく取り除きます。
7. 出血が発生した場合は、ガーゼを使用して出血を止めてきれいにしてください。
8. 必要に応じて、丸めた組織の小さなストリップを使用し、血液がCSFを汚染しないように大槽の周りに置きます。
   注:染料を使用した注射の成功を確認するには、麻酔をかけたラットに2〜3μLの1.1%エバンスブルー染料( 材料の表を参照)を注入してから、適合したカニューレと使い捨ての1mLシリンジを使用してCSFを収集します。
9. CSFを抽出するためのツールを準備するには、シリンジに~500μLのろ過水を入れ、23Gのドローアップニードルを取り付け、ニードルにチューブを引っ張ります。引っ張ったガラスピペットをチューブのもう一方の端に取り付けます。
10. CSFを抽出するには、引っ張ったピペットを露出した槽マグナにゆっくりと挿入します。
    注:CSFはゆっくりと受動的にピペットに流れ込み、シリンジを使用して積極的に引き上げられます。染料を注入すると、CSFは青色に着色されます(図1)。
11. ラベル付きのチューブにCSFを追加し、すぐにドライアイスの上に置きます。その後、CSFは-80°Cで保存できます。
12. 分析のために他の関心のある組織を収集します。血漿の場合は、少なくとも3 mLの心臓血を採取します。.
    1. 深く麻酔をかけたラットを仰向けに置き、胸腔を開いて心臓を露出させます。止血器を使用して胸郭を固定し、動物の喉に置いて視認性を高めます。フック付きの組織鉗子を使用して右心室を保持し、18Gの針が付いた5mLの使い捨て注射器を中隔と平行に左心室に挿入します。ゆっくりと血液を注射器に引き込みます。3〜5mLの血液を採取したら、心臓から針を抜きます。
13. 注射器から針を取り出し、鋭利な容器に入れます。血液をヘパリンチューブに移し、2,739 x g 、4°Cで15分間回転した後、上清を200μLのピペットで回収し、ドライアイス上で凍結します。
14. ハサミで心臓を取り除いてラットを安楽死させます。イソフルランの供給をオフにします。
15. 腎臓や脾臓など、関心のある他の腹部臓器を収集します。臓器を特定し、フック付きの組織鉗子で目的の臓器を保持し、持ち上げてアタッチメントを切断します。臓器をラベル付きのチューブに入れ、ドライアイスで凍結します。
16. 脳を取り除くには、頭蓋骨の付け根を切って、鋭くて大きなハサミで動物の首を切り落とします。ヘッドマウントを手で引き抜きます。頭蓋骨を覆っている残りの皮膚を切り取ります。
17. ディセクターハサミを使用して、頭蓋骨を基部からラムダへの正中線で切断する、つまり後頭上骨を半分に切断します。止血器を使用して半分をつかみ、それを離します。反対側で繰り返して、小脳を完全に露出させます。
18. 矢状縫合糸に沿って前頭骨まで切断します。止血器を使用して、各頭頂骨を剥がします。必要に応じて、前頭骨をさらに切断し、さらに骨を取り除いて嗅球を露出させます。
19. 頭を逆さまにして、へらで脳を慎重にこじ開け、へらでそれらを切断することにより、脳を視神経と三叉神経から切り離します。脳をチューブに集め、ドライアイスでスナップフリーズします。
20. 染料を注入すると、脳室は青色に染まります。使い捨てのブレードを使用して、注射部位(図2A、B)と~1cm後部(図2C)で脳を切断し、脳室内の色素分布を調査します。
21. 脊髄を切除するには、ラットの背側表面の正中線に沿って皮膚を切って脊柱を露出させます。脊椎動物の柱の周りに両側を切開し、腰椎脊髄の尾側端で横方向に切断することにより、脊椎柱を切除します。
22. 脊髄全体が露出するまで、ハサミを使用して椎弓を柱に沿って両側に切断します。脊髄を一方の端(吻側端など)から持ち上げ、すべての神経が切断されるまで脊髄を尾側方向に切断して抽出します。脊髄をチューブに集め、ドライアイスで凍結します。
    注:データ分析のために、臓器採取の前後にすべてのチューブを計量します。必要かつ適切な場合、CSF採取後および脳採取前に心室系を洗浄して、心室コンパートメント内の残留薬物を除去することができます。チューブに付着した生理食塩水を充填した1mLシリンジとインジェクターカニューレを使用し、ガイドカニューレに挿入します。生理食塩水を2〜3mL注入します。生理食塩水は大槽の開口部から出るはずです。ガイドカニューレ、ダミーカニューレ、ネジは、アセトンに24時間浸した後、医療用洗剤と水に浸して洗浄することで再利用できます。乾燥したら、細かい鉗子を使用して残留歯科用セメントを取り除くことができます。

提示された外科的プロトコルは非常に成功しており、訓練を受けた外科医は>99.8%の生存率に達し、動物は0日目の手術前の体重と比較して、1日目に手術後の安定した体重を示しました(0日目の平均±SDは315.8g±42.1g、1日目±314.1g43.0g)、 図3)。

CSFを採取する前に、埋め込まれたカニューレに1.1%のEvans Blue染料を注入すると、注射?...

研究者や臨床医は、ICV注射を使用してBBBの保護メカニズムを回避し、薬物を直接CNSに送達します12,18,19,21,24。本研究は、薬物を効率的にCNSに送達し、薬物動態分析のためにCSFを抽出するための完全なICVプロトコルです。実験の開始時に、このプ?...

著者には、開示すべき利益相反はありません。

著者らは、動物の提供と世話をしてくれたメルボルン大学の生物医学科学動物施設に感謝しています。本研究は、国立衛生研究所アレルギー・感染症研究所(R01 AI146241、GR、TV)の研究助成を受けて行われました。JLは、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)の主任研究員です。内容は著者の責任であり、必ずしも国立アレルギー感染症研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。