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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’administration de produits thérapeutiques directement dans le système nerveux central est un moyen de contourner la barrière hémato-encéphalique. Le présent protocole démontre l’injection intra-ventriculaire pour le prélèvement ultérieur de liquide céphalo-rachidien et d’organes corporels. Cela facilite l’étude de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamique des médicaments dans des modèles animaux pour le développement de nouveaux traitements.

Résumé

Bien que la barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le cerveau des entités étrangères, elle empêche également certains traitements de pénétrer dans le système nerveux central (SNC) pour améliorer les maladies ou les infections. Les médicaments sont administrés directement dans le SNC chez les animaux et les humains pour contourner la BHE. Le protocole actuel décrit une façon unique de traiter les infections cérébrales par l’administration intraventriculaire d’antibiotiques, c’est-à-dire les polymyxines, les antibiotiques de dernière intention pour traiter les bactéries à Gram négatif multirésistantes. Un protocole de chirurgie stéréotaxique simple a été mis au point pour implanter une canule guide atteignant le ventricule latéral chez le rat. Après une période de récupération de 24 h, les rats peuvent être injectés consciemment et à plusieurs reprises à travers une canule ajustée au guide. Les injections peuvent être administrées manuellement en bolus ou en perfusion à l’aide d’une pompe de micro-injection pour obtenir un débit lent et contrôlé. L’injection intraventriculaire a été confirmée avec succès avec le colorant Evans Blue. Le liquide céphalorachidien (LCR) peut être drainé, et le cerveau et d’autres organes peuvent être prélevés. Cette approche se prête tout particulièrement bien aux études impliquant l’administration de médicaments dans le SNC et l’évaluation ultérieure de l’activité pharmacocinétique et pharmacodynamique.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un mécanisme de protection crucial pour le système nerveux central (SNC). La barrière anatomique sélectivement perméable sépare le sang circulant et ses solutés du liquide extracellulaire du cerveau, empêchant ainsi la plupart des molécules de pénétrer dans le cerveau 1,2,3,4, en fonction de leur taille, de leur lipophilie 5 et de la disponibilité d’un mécanisme de transport actif 2.

Cette barrière protectrice est bénéfique pour la régulation efficace de l’homéostasie cérébrale complexe et la santé du SNC 4,6. Cependant, il est également difficile d’administrer des médicaments pour traiter les infections cérébrales ou d’autres maladies du SNC 4,7. Outre la perturbation de la BHE à l’aide de diverses méthodes 8,9, l’approche principale pour contourner la BHE consiste à administrer un médicament directement dans le cerveau en le libérant dans le liquide céphalo-rachidien (LCR)4. Bien qu’il s’agisse d’une pratique relativement invasive, elle a été utilisée avec succès pour administrer des traitements ciblés aux patients et aux animaux de laboratoire. Chez l’homme, les médicaments peuvent être administrés dans le système intraventriculaire ou LCR, puis échantillonnés à l’aide du réservoir d’Ommaya, un réservoir situé sous le cuir chevelu, attaché à un cathéter inséré dans le ventricule latéral10,11. Des techniques similaires ont été mises au point chez des animaux de laboratoire tels que les rongeurs pour atteindre des objectifs équivalents. Des pompes micro-osmotiques ont été implantées chez des souris 12,13,14,15 et des rats16,17 pour une administration continue de médicament dans le système ventriculaire ou le parenchyme cérébral. De plus, des injections intra-ventriculaires directes ont été effectuées chez des souris anesthésiées à l’aide d’une aiguille jetable18,19 et chez des rats conscients via une canule implantée chirurgicalement20,21,22,23. L’administration de médicaments dans le SNC a été une méthode inestimable pour améliorer la compréhension dans divers domaines 20,24,25,26,27,28.

Les infections du SNC sont l’un de ces domaines qui nécessite de toute urgence de nouvelles thérapies et une meilleure compréhension des thérapies anti-infectieuses existantes. Les infections du SNC causées par des bactéries à Gram négatif multirésistantes sont particulièrement préoccupantes7. Les polymyxines sont les antibiotiques de dernière intention de plus en plus utilisés pour traiter les infections dues à ces « superbactéries »29. Lorsque les polymyxines sont administrées par voie intraveineuse conformément aux directives posologiques actuelles30, leur pénétration dans le SNC est très faible, tandis que des doses plus élevées augmentent le risque de néphrotoxicité. Par conséquent, le traitement par polymyxine intraveineuse est peu utile pour traiter les infections du SNC7. L’établissement d’un schéma posologique sûr et efficace pour l’administration de polymyxines dans le SNC est un besoin médical urgent non satisfait 31,32,33. Par conséquent, le protocole actuel a été établi et est décrit en mettant l’accent sur l’injection d’antibiotiques directement dans le LCR des rats. Il peut toutefois être utilisé pour administrer tout médicament qui n’est pas neurotoxique et où des concentrations thérapeutiques peuvent être administrées en petits volumes (par exemple, jusqu’à 10 μL chez le rat). Les techniques décrites peuvent également être modifiées pour cibler différentes régions du cerveau et administrer plusieurs injections.

Le protocole actuel présente une technique simple de chirurgie et d’injection qui permet une pharmacocinétique et une distribution efficaces des médicaments après l’administration d’un VCI. La chirurgie consiste à implanter une canule de guidage. Comme il s’agit d’une procédure moins invasive que l’implantation d’une pompe micro-osmotique 12,13,14,15,16,17, il s’agit d’une option avancée adaptée à l’administration à court terme de médicaments dans le LCR. Ce protocole est simplifié et permet d’obtenir des taux de survie très élevés et des poids corporels stables 24 h après l’opération, ce qui représente une amélioration par rapport aux méthodes existantes34. Après l’opération, les rats conscients ont reçu soit une injection manuelle de bolus ICV, soit une administration plus lente à l’aide d’une micropompe pour abaisser les concentrations plasmatiques maximales. En même temps, ils pouvaient se déplacer librement dans leur cage. Afin d’établir des schémas posologiques sûrs et efficaces, des échantillons de LCR, de cerveau, de moelle épinière, de rein, de plasma, etc., ont ensuite été utilisés pour étudier la pharmacocinétique et la distribution du médicament après l’administration intra-ventriculaire (ICV). La distribution des médicaments peut également être étudiée visuellement, par exemple à l’aide de l’immunohistochimie ou de l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MSI). Si nécessaire, une canule bilatérale peut être implantée, par exemple pour injecter des médicaments qui se distribueraient autrement unilatéralement dans les deux hémisphères.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément au code australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Les expériences ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université de Melbourne (demande #1914890). Des rats Sprague-Dawley mâles et femelles âgés de 8 à 14 semaines ont été utilisés pour les expériences.

1. Chirurgie stéréotaxique pour la canulation du ventricule latéral

  1. Utilisez des embouts en coton autoclavés et des champs chirurgicaux pendant la chirurgie.
  2. Configurez ce qui suit pour la chirurgie.
    1. Installez un cadre stéréotaxique, un système d’administration d’anesthésie, des médicaments, des produits chimiques et du matériel d’assistance (voir le tableau des matériaux). Nettoyez le cadre stéréotaxique, la source de lumière à fibre optique, la perceuse à main, etc., avec de l’éthanol à 80 %.
    2. Trempez la canule guide de 22 G et la canule factice associée (voir tableau des matériaux) dans de l’éthanol à 80 % pour la stérilisation.
      REMARQUE : Le fabricant a prédécoupé le guide 22 G et la canule factice à une longueur de ~4 mm sous le piédestal.
    3. Stérilisez les instruments chirurgicaux (voir tableau des matériaux) à l’aide du stérilisateur à billes de chaleur pendant 20 s, puis vaporisez de l’éthanol à 80 %. Placez les instruments stérilisés sur le champ stérile.
    4. Préparez une boîte de récupération (une boîte de logement pour rats doublée d’un coussin) avec la moitié de la boîte placée sur un coussin chauffant.
  3. Effectuez la chirurgie.
    1. Vissez la canule de guidage 22 G nettoyée à l’éthanol dans le support de canule sur le cadre stéréotaxique.
    2. Placez le rat dans une chambre d’induction (300 mm x 200 mm, voir tableau des matériaux) et induisez une anesthésie avec 5 % d’isoflurane à 1 L/min d’oxygène.
    3. Une fois que le rat est profondément anesthésié (pas de réflexe de pédale), déplacez-le vers le cadre stéréotaxique et réduisez l’isoflurane à 2 % à 3 % dans 1 L/min d’oxygène pour le maintien à travers le cône nasal. Accrochez les dents sur la barre de morsure et tirez délicatement le cône nasal sur le nez - tirez doucement sur le rat pour vérifier qu’il est bien fixé.
    4. Appliquez un lubrifiant protecteur pour les yeux sur les deux yeux pour éviter le dessèchement.
    5. Injecter du carprofène (5 mg/kg), de la buprénorphine (0,05 mg/kg) dans une solution saline et 3 mL de solution saline sous-cutanée (s.c.) pour gérer la douleur et faciliter la récupération post-opératoire.
    6. Pincez les orteils pour vérifier le réflexe de pédale. Une fois absent, fixez le crâne du rat dans le cadre. Placez une barre d’oreille dans le conduit auditif et serrez. Répétez l’opération de l’autre côté.
    7. Déplacez les barres d’oreille latéralement pour vous assurer que les numéros indiqués sur les barres d’oreille sont égaux des deux côtés. La tête ne doit pas bouger lorsqu’on appuie sur le crâne.
    8. Rasez le haut de la tête avec une tondeuse. Essuyez les cheveux avec un mouchoir en papier et une solution saline. Si nécessaire, réappliquez du lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour éviter le dessèchement.
    9. Tamponnez le cuir chevelu avec de la chlorhexidine à 4 % et une solution de préparation alcoolique pour la peau, à l’aide de cotons-tiges stériles pour chaque étape (voir le tableau des matériaux). Commencez par le centre du crâne et déplacez-vous en cercles vers l’extérieur jusqu’à ce que toute la surface soit nettoyée.
    10. Injecter ~150 μL de ropivacaïne (1 %) s.c. (voir le tableau des matériaux) le long du site d’incision prévu.
    11. À l’aide de la lame du scalpel, faites une incision de 10 à 15 mm le long de la ligne médiane de la tête, entre les yeux et la base du crâne.
    12. Utilisez les cotons-tiges et le scalpel pour gratter le tissu conjonctif et exposer le crâne.
    13. Trempez un embout en coton stérile dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % et appliquez-le à la surface du crâne. Attendez 5 secondes pour que le produit chimique réagisse avec la peau, puis nettoyez la zone avec un coton-tige sec.
    14. Appliquez une deuxième fois du peroxyde d’hydrogène à 3 %. Cela fera apparaître plus clairement les lignes de suture du crâne. Attendez 10 secondes pour que le produit chimique réagisse avec la peau, puis nettoyez la zone avec un coton-tige sec. Laver avec une solution saline et sécher avec un coton-tige propre.
    15. Appliquez soigneusement une petite quantité de gel Super etch sur un coton-tige, puis appliquez-le à la surface du crâne. Cela crée une surface plus poreuse à laquelle le ciment dentaire peut adhérer.
    16. Appliquez une quantité généreuse de solution saline sur le crâne pour laver le super mordançant et séchez-le avec un coton-tige propre.
    17. Identifiez le bregma et marquez-le à l’aide du stylo-feutre.
    18. Percez une empreinte pour la vis d’ancrage à un endroit qui n’obstruera pas le placement de la canule de guidage.
      REMARQUE : Si le ventricule latéral droit est canulé, percez sur l’hémisphère gauche et postérieurement par rapport au ventricule.
    19. Tenez la perceuse à un angle de ~75°-80° par rapport au crâne et percez lentement une encoche d’une profondeur d’environ la moitié de l’épaisseur du crâne. Utilisez une solution saline sur un coton-tige pour essuyer la poussière d’os.
    20. Insérez soigneusement la vis en la maintenant fermement dans l’encoche avec une pince et en la vissant dans le crâne avec le tournevis, en évitant de casser le crâne. Après chaque tour complet, vérifiez si la vis est bien en place.
    21. Vérifiez que le crâne est plat. À l’aide des bras mobiles du cadre, positionnez la canule de guidage pour toucher le crâne au niveau de la crête. Mettez à zéro la DV (dorsale-ventrale) représentant les coordonnées du plan Z en appuyant sur le bouton du moniteur de contrôle de cadre.
    22. Soulevez la canule de guidage (22 G et 4 mm de longueur) à l’aide des bras mobiles du cadre et déplacez-la vers lambda. Abaissez-le de manière à ce qu’il touche la surface du crâne et notez à nouveau l’affichage DV.
      REMARQUE : La différence entre DV à bregma et DV à lambda doit être inférieure à 0,2 mm. Si nécessaire, ajustez le cône nasal en conséquence, c’est-à-dire que la tête du rat est placée vers le haut ou vers le bas selon les besoins, et répétez les mesures.
    23. Déplacez la canule de guidage vers l’arrière pour toucher le bregma et remettez à zéro les trois coordonnées : DV, AP (antéro-postérieur) et ML (médial-latéral) en appuyant sur les boutons du moniteur.
    24. Déplacez la canule de guidage aux coordonnées préétablies de votre choix.
      REMARQUE : Pour la canulation du ventricule latéral droit chez un rat adulte de 300 à 350 g, les coordonnées suivantes ont été utilisées : -0,7 mm AP, -1,4 mm ML et -4,00 mm DV (la même longueur que la canule guide).
    25. Marquez la position finale de la canule en coloriant l’extrémité de la canule à l’aide du marqueur, puis en l’abaissant jusqu’à la surface du crâne pour toucher et marquer la position.
    26. Percez un trou de 2,3 mm de diamètre pour la canule de guidage 22 G en maintenant la tige de forage en position verticale droite, c’est-à-dire à un angle de 90° par rapport à la godille. Veillez à vous enfoncer lentement et progressivement dans le crâne, c’est-à-dire à éviter de percer dans le tissu cérébral.
      REMARQUE : Si nécessaire, abaissez la canule dans le trou à l’aide du bras stéréotaxique mobile pour tester si la canule peut être placée avec succès ou si un forage supplémentaire est nécessaire.
    27. Une fois que la canule a été abaissée dans le cerveau, soulevez-la, appliquez soigneusement de la super colle sur la face inférieure du piédestal en plastique de la canule et abaissez la canule dans le trou à l’aide du bras mobile du cadre stéréotaxique.
    28. Laisser en place pour permettre à la colle de prendre.
    29. Pendant l’attente, mélangez le solvant dentaire et la poudre (voir la table des matériaux) dans un bateau de pesée. Versez la poudre de ciment dentaire dans le bateau de pesée, utilisez une seringue de 1 mL pour ajouter ~300 μL de solvant et mélangez à l’aide de la même seringue jusqu’à ce qu’elle épaississe et ait une consistance utilisable. Si nécessaire, ajoutez plus de poudre pour augmenter la viscosité ou plus de solvant pour réduire la viscosité.
    30. Libérez la canule du support de canule à l’aide de la vis dédiée et soulevez délicatement le bras.
      REMARQUE : La canule doit être collée sur le crâne à un angle de 90°.
    31. Appliquez le ciment dentaire frais sur le crâne exposé en l’aspirant dans la seringue jetable de 1 ml et en l’appliquant autour de la canule. Évitez tout ciment dentaire sur la peau ou l’ouverture de la canule. Laissez reposer quelques secondes, en fonction de sa consistance.
    32. Lorsque le ciment dentaire devient plus épais, utilisez une spatule pour appliquer plus de ciment dentaire et former le support de tête final recouvrant entièrement la vis.
      REMARQUE : Veillez à ne pas trop couvrir la canule afin que la canule factice puisse toujours être vissée. Retirez tout excès de ciment dentaire de la peau.
    33. Insérez une canule factice stérile une fois que le ciment dentaire est sec et ferme.
    34. Éteignez l’isoflurane, relâchez les barres d’oreille, retirez le rat du cadre et placez-le dans la boîte de récupération.
    35. Une fois que l’animal s’est rétabli ~15-30 min, logez-le dans une boîte de logement propre.
      REMARQUE : Après la chirurgie, les rats doivent être logés dans une maison individuelle. Envisagez de remplacer les dessus de cage de grille standard où la trémie alimentaire s’abaisse dans la cage par des dessus de cage de grille haut et haut dédiés pour minimiser le risque d’interférence avec le support de tête. Vous pouvez également bloquer toutes les parties de la cage qui sont beaucoup plus basses que la hauteur d’élevage de l’animal.
    36. Remplissez la liste de contrôle de surveillance et surveillez conformément aux lignes directrices de surveillance décrites dans le protocole.
      REMARQUE : Pensez à placer des granulés de nourriture sur le sol pour un accès plus facile. Si cela n’interfère pas avec l’expérience, un soulagement supplémentaire de la douleur peut être fourni dans les aliments sucrés pour remplacer les injections supplémentaires de s.c. post-opératoires, par exemple, la buprénorphine mélangée à de la pâte de chocolat aux noix sucrées 35,36,37. Dans ce cas, une partie du même bonbon a été fournie en récompense avant et après la chirurgie pour éviter la néophobie alimentaire lors du soulagement de la douleur. La pâte de noix peut être fournie sur du ruban adhésif fixé à la paroi de la cage.
    37. Stockez plus de canules factices que de canules de guidage ou de canules d’injection, car elles pourraient se perdre dans la litière de la cage des animaux si elles se détachent accidentellement. Dans le cas d’un tel événement, remplacez la canule par une nouvelle canule factice stérile.

2. Injections ICV

  1. Préparez le médicament et le véhicule, par exemple, 30 mg/mL de polymyxine B (voir le tableau des matériaux) dans une solution saline stérile à 0,9 %. Maintenir le volume d’injection entre 5 et 10 μL chez les rats adultes dont le poids corporel varie entre 300 et 400 g.
  2. Au moins 24 h après la chirurgie, pesez le rat et transportez-le à la salle d’intervention.
  3. Calculez le volume d’injection en utilisant le poids corporel du rat.
  4. Retirez le couvercle de la cage et dévissez la canule factice.
    REMARQUE : Les rats restent généralement immobiles lorsqu’ils les tiennent doucement dans leur cage et n’ont pas besoin de retenue. Un torchon peut être utilisé pour un rat curieux ou nerveux ou un chatouillement des pommettes.
  5. Pour une injection en bolus, fixez un tube PE-50 (voir le tableau des matériaux) d’au moins 40 cm de long à une microseringue étanche au gaz de 10 μL en tirant une extrémité du tube sur l’aiguille fixe ou amovible de la seringue et en assurant une étanchéité parfaite. Fixez la canule d’injecteur montée à l’autre extrémité de la tubulure.
    1. Prélevez la quantité requise à l’aide de la canule. Insérez la canule dans le guide jusqu’à ce qu’elle soit installée et injectez. Une fois que tout le liquide est injecté, maintenez le piston de la seringue en place pendant au moins une minute supplémentaire pour éviter le reflux.
  6. Pour un débit plus lent, injectez les médicaments à l’aide d’une pompe de micro-injection (voir la table des matériaux).
    1. Tout d’abord, utilisez de l’eau filtrée et une seringue jetable de 1 ml avec une aiguille de tirage de 23 g pour remplir complètement le tube PE-50. Retirez ensuite la seringue jetable de l’aiguille d’aspiration et remplacez-la par la microseringue.
    2. Aspirez 1 à 3 μL pour créer une bulle d’air petite mais visible. Ensuite, prélevez la quantité de médicaments requise. En option, marquez la bulle d’air avec un marqueur pour faciliter la visibilité du flux de drogue. Verrouillez la seringue en place sur la pompe.
      REMARQUE : Assurez-vous que les paramètres sont corrects pour le médicament et l’équipement utilisés, c’est-à-dire réglez la vitesse d’administration et le diamètre intérieur de la seringue utilisée conformément au manuel d’utilisation.
  7. Une fois que tout le liquide est injecté, arrêtez la pompe si elle ne s’arrête pas automatiquement. Laissez l’aiguille insérée pendant au moins une minute supplémentaire pour éviter le reflux.
  8. Retirez lentement la canule d’injecteur et vissez la canule de guidage.
  9. Nettoyez l’équipement en aspirant et en éjectant de l’éthanol et de l’eau DI trois fois chacun.

3. LCR et prélèvement de tissus

  1. Transportez le rat dans une salle d’intervention.
  2. Placez le rat dans la chambre d’induction et induisez une anesthésie avec 5 % d’isoflurane dans 2 L/min d’oxygène jusqu’à ce que la respiration ait ralenti (~ 5 min).
  3. Déplacez le rat vers le cadre stéréotaxique et maintenez le même niveau d’anesthésie profonde à travers le cône nasal.
  4. Vérifiez le réflexe de la pédale. Une fois absent, fixez le crâne dans le cadre à l’aide des barres d’oreille.
    REMARQUE : Il peut s’agir d’un cadre stéréotaxique plus simple sans écran, barres d’oreille arrondies ou bras mobiles. Il s’agit d’une procédure de non-recouvrement ; La seule caractéristique nécessaire est toute barre d’oreille de rat.
  5. À l’aide du cône nasal, inclinez le nez du rat vers le bas à environ 45° pour exposer le cou à une bonne position de travail.
  6. À l’aide de petits ciseaux émoussés et incurvés, palpez le crâne et déplacez-vous vers l’arrière jusqu’à l’extrémité du crâne. À cette position, coupez la couche musculaire la plus externe à travers la ligne médiane du cou, d’environ 2 à 3 cm de longueur. Coupez soigneusement toutes les autres couches musculaires.
    1. Utilisez un petit écarteur à ressort pour maintenir la plaie ouverte et permettre une bonne visibilité. Coupez jusqu’à ce que la membrane de la citerne soit visible. Utilisez un coton-tige pour aider à enlever doucement toute autre peau.
  7. En cas de saignement, utilisez de la gaze pour nettoyer et arrêter le saignement.
  8. Si nécessaire, utilisez de petites bandes de tissu roulé et placez-les autour de la citerne pour éviter que le sang ne contamine le LCR.
    REMARQUE : Pour confirmer le succès de l’injection à l’aide d’un colorant, injectez 2 à 3 μL de colorant Evans Blue à 1,1 % (voir le tableau des matériaux) dans le rat anesthésié avant de prélever le LCR à l’aide de la canule ajustée et d’une seringue jetable de 1 mL.
  9. Pour préparer l’outil d’extraction du LCR, remplissez la seringue avec ~500 μL d’eau filtrée, fixez une aiguille d’aspiration de 23 G et tirez le tube sur l’aiguille. Fixez une pipette en verre tiré à l’autre extrémité du tube.
  10. Pour extraire le LCR, insérez lentement la pipette tirée dans la citerne magna exposée.
    REMARQUE : Le LCR s’écoulera lentement et passivement dans la pipette et sera activement aspiré à l’aide de la seringue. Si le colorant est injecté, le LCR serait de couleur bleue (Figure 1).
  11. Ajoutez le LCR dans un tube étiqueté et placez-le immédiatement sur de la glace sèche. Le LCR peut alors être stocké à -80 °C.
  12. Prélever tout autre tissu d’intérêt pour analyse. Pour le plasma, prélever au moins 3 mL de sang cardiaque.
    1. Placez le rat profondément anesthésié sur son dos et ouvrez la cavité thoracique pour exposer le cœur. Utilisez un hémostat pour serrer la cage thoracique et placez-le sur la gorge de l’animal pour faciliter la visibilité. À l’aide d’une pince à mouchoirs avec crochets, tenez le ventricule droit et insérez une seringue jetable de 5 ml avec une aiguille de 18 g dans le ventricule gauche, parallèlement au septum. Prélevez lentement le sang dans la seringue. Une fois que 3 à 5 ml de sang ont été prélevés, retirez l’aiguille du cœur.
  13. Retirez l’aiguille de la seringue et placez-la dans un récipient pointu. Transférez le sang dans des tubes héparinés et faites-le tourner à 2 739 x g et 4 °C pendant 15 minutes avant de prélever le surnageant à l’aide d’une pipette de 200 μL et de le congeler rapidement sur de la glace sèche.
  14. Euthanasiez le rat en enlevant le cœur avec des ciseaux. Coupez l’alimentation en isoflurane.
  15. Prélevez tout autre organe abdominal d’intérêt, comme le rein ou la rate. Identifiez l’organe, tenez l’organe d’intérêt avec des pinces à tissus avec des crochets, soulevez-le et coupez toutes les attaches. Placez l’organe dans un tube étiqueté et congelez-le sur de la glace sèche.
  16. Pour enlever la cervelle, décapitez l’animal à l’aide d’une paire de gros ciseaux tranchants en coupant à la base du crâne. Retirez le support de tête à la main. Coupez à travers la peau restante qui recouvre le crâne.
  17. À l’aide de ciseaux à dissecteur, coupez le crâne sur la ligne médiane de la base au lambda, c’est-à-dire coupez l’os supra-occipital en deux. Utilisez un hémostat pour en saisir une moitié et l’enlever. Répétez l’opération de l’autre côté pour exposer complètement le cervelet.
  18. Procédez à la coupe le long de la suture sagittale jusqu’à l’os frontal. Utilisez un hémostat pour enlever chacun des os pariétaux. Si nécessaire, coupez davantage l’os frontal et retirez plus d’os pour exposer les bulbes olfactifs.
  19. Tenez la tête à l’envers et soulevez soigneusement le cerveau avec une spatule, en le détachant des nerfs optiques et trijumeaux en les sectionnant avec la spatule. Récupérez le cerveau dans un tube et congelez-le sur de la glace sèche.
  20. Les ventricules cérébraux seront colorés en bleu si le colorant est injecté. À l’aide d’une lame jetable, coupez le cerveau au point d’injection (figures 2A, B) et à ~1 cm vers l’arrière (figure 2C) afin d’étudier la distribution du colorant dans les ventricules.
  21. Pour retirer la moelle épinière, exposez la colonne vertébrale en coupant la peau le long de la ligne médiane de la surface dorsale du rat. Excise la colonne vertébrale en faisant une incision bilatérale autour d’elle et en la coupant transversalement à l’extrémité caudale de la moelle épinière lombaire.
  22. Coupez le limbe bilatéralement le long de la colonne à l’aide de ciseaux jusqu’à ce que toute la moelle épinière soit exposée. Soulevez la moelle épinière d’une extrémité, par exemple l’extrémité rostrale, et extrayez-la en clivant les nerfs spinaux dans une direction caudale jusqu’à ce que tous les nerfs soient coupés. Prélevez la moelle épinière dans un tube et congelez-le sur de la glace sèche.
    REMARQUE : Pesez tous les tubes avant et après le prélèvement d’organes pour l’analyse des données. Si nécessaire et approprié, le système ventriculaire peut être lavé après le prélèvement du LCR et avant le prélèvement du cerveau pour éliminer les médicaments résiduels dans les compartiments ventriculaires. Utilisez une seringue de 1 mL remplie de solution saline attachée à la tubulure et à une canule d’injecteur et insérez-la dans la canule de guidage. Injecter 2 à 3 mL de solution saline. La solution saline doit sortir de l’ouverture dans la citerne magna. Les canules de guidage, les canules factices et les vis peuvent être réutilisées en les trempant dans de l’acétone pendant 24 heures, puis en les trempant et en les nettoyant avec un détergent médical et de l’eau. Une fois sec, le ciment dentaire résiduel peut être enlevé à l’aide d’une pince fine.

Résultats

Le protocole chirurgical présenté est très efficace, les chirurgiens formés atteignant un taux de survie de >99,8 % et les animaux montrant un poids corporel stable après l’opération le jour 1, par rapport à leur poids préopératoire le jour 0 (moyenne ± ET de 315,8 g ± 42,1 g pour le jour 0 et 314,1 g ± 43,0 g pour le jour 1, figure 3).

Avant de prélever le LCR, une injection de colorant Evans Blue à 1,1 % dans la ...

Discussion

Les chercheurs et les cliniciens utilisent des injections ICV pour contourner le mécanisme de protection de la BHE et administrer des médicaments directement dans le SNC 12,18,19,21,24. Le présent travail est un protocole ICV complet pour administrer efficacement des médicaments dans le SNC et extraire le LCR pour l’anal...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le Biomedical Science Animal Facility de l’Université de Melbourne pour la fourniture et les soins aux animaux. Cette recherche a été soutenue par une subvention de recherche de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses de l’Institut national de la santé (R01 AI146241, GR et TV). JL est chercheur principal du Conseil national australien de la recherche médicale en santé (NHMRC). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou de l’Institut national de la santé.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneTerumo, JapanSS+01T
5 mL syringesTerumo, JapanSS+05S
AcetoneMerck, Germany67641
Bench protector sheetsHalyard, USA2765-C
BetadineMundipharma, Netherlands1015695
Buprenorphine; TemgesicClifford Hallam Healthcare, Australia1238366
CarprofenZoetis, Australia10001132
ChlorhexidineTasman Chemicals, Australia890401
Chux superwipes (or equivalent)Chux, Australian/aautoclaved
Clippersn/an/a
Cotton swabsLP Italiana, Italy112191autoclaved
Dental cement powder (Vertex Self cure powder)Henry Schein, USAVX-SC500GVD5
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid)Henry Schein, USAVX-SC250MLLQ
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 GTerumo, JapanNN+2525RL
Disposable surgical bladesWestlab, Australia663-255
Dissector scissorsF.S.T.14082-09
Dummy cannulasBio Scientific, AustraliaC313DC/SPCcut to 4.05 to fit the guide cannula
Ethanol 80%Merck, Australia10107
Evan's blue dyeSigmaE2129 - 50G
Eye lubeClifford Hallam Healthcare, Australia2070491
Felt tip penSharpie, USAD-4236
Fibre optic light sourcen/an/a
Flattened needle (18 G) or similar to apply supergluen/an/a
Glass pipettes, pulledHirschmann Laborgeraete, Germany9100175
Glass syringe 10 uLHamilton, USA701 LT and 1701 LT
Guide cannulasBio Scientific, AustraliaC313G/SPC22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats
Haemostat
Heat bead steriliserInotech, SwitzerlandIS-250
Heat padn/an/a
Hydrogen peroxide 3%Perrigo, Australia11383
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm)n/an/a
Injector cannulaBio Scientific, AustraliaC313I/SPCcut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection
IsofluraneClifford Hallam Healthcare, Australia2093803
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging systemn/an/a
Medium size weighing boatsn/an/a
Metal spatulaMet-App, Australian/a
Micro syringe pumpNew Era, USANE-300
MicrodrillRWD Life Science Co, China87001
Polymyxin BBeta Pharma, China86-40302
Protein LoBind tubes, 0.5 mLEppendorf, GermanyZ666491
Ropivacaine 1%; NaropinAstraZeneca, UKPS09634
Scissors, largeF.S.T.14511-15
Scissors, smallF.S.T.14079-10
Screwdrivern/an/a
ScrewsMr. Specs, Australian/a
Stereotaxic frameRWD Life Science Co, Chinan/aNecessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder
Sterile saline 0.9%Baxter, USAAHB1323
Super etch (37% phosphoric acid) gelSDI Limited, Australia8100045
SuperglueUHU, Germanyn/a
Tissue forceps with hooksF.S.T.11027-12
Tubing, PE-50Bio Scientific, AustraliaC313CT

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