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Method Article
L’administration de produits thérapeutiques directement dans le système nerveux central est un moyen de contourner la barrière hémato-encéphalique. Le présent protocole démontre l’injection intra-ventriculaire pour le prélèvement ultérieur de liquide céphalo-rachidien et d’organes corporels. Cela facilite l’étude de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamique des médicaments dans des modèles animaux pour le développement de nouveaux traitements.
Bien que la barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le cerveau des entités étrangères, elle empêche également certains traitements de pénétrer dans le système nerveux central (SNC) pour améliorer les maladies ou les infections. Les médicaments sont administrés directement dans le SNC chez les animaux et les humains pour contourner la BHE. Le protocole actuel décrit une façon unique de traiter les infections cérébrales par l’administration intraventriculaire d’antibiotiques, c’est-à-dire les polymyxines, les antibiotiques de dernière intention pour traiter les bactéries à Gram négatif multirésistantes. Un protocole de chirurgie stéréotaxique simple a été mis au point pour implanter une canule guide atteignant le ventricule latéral chez le rat. Après une période de récupération de 24 h, les rats peuvent être injectés consciemment et à plusieurs reprises à travers une canule ajustée au guide. Les injections peuvent être administrées manuellement en bolus ou en perfusion à l’aide d’une pompe de micro-injection pour obtenir un débit lent et contrôlé. L’injection intraventriculaire a été confirmée avec succès avec le colorant Evans Blue. Le liquide céphalorachidien (LCR) peut être drainé, et le cerveau et d’autres organes peuvent être prélevés. Cette approche se prête tout particulièrement bien aux études impliquant l’administration de médicaments dans le SNC et l’évaluation ultérieure de l’activité pharmacocinétique et pharmacodynamique.
La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un mécanisme de protection crucial pour le système nerveux central (SNC). La barrière anatomique sélectivement perméable sépare le sang circulant et ses solutés du liquide extracellulaire du cerveau, empêchant ainsi la plupart des molécules de pénétrer dans le cerveau 1,2,3,4, en fonction de leur taille, de leur lipophilie 5 et de la disponibilité d’un mécanisme de transport actif 2.
Cette barrière protectrice est bénéfique pour la régulation efficace de l’homéostasie cérébrale complexe et la santé du SNC 4,6. Cependant, il est également difficile d’administrer des médicaments pour traiter les infections cérébrales ou d’autres maladies du SNC 4,7. Outre la perturbation de la BHE à l’aide de diverses méthodes 8,9, l’approche principale pour contourner la BHE consiste à administrer un médicament directement dans le cerveau en le libérant dans le liquide céphalo-rachidien (LCR)4. Bien qu’il s’agisse d’une pratique relativement invasive, elle a été utilisée avec succès pour administrer des traitements ciblés aux patients et aux animaux de laboratoire. Chez l’homme, les médicaments peuvent être administrés dans le système intraventriculaire ou LCR, puis échantillonnés à l’aide du réservoir d’Ommaya, un réservoir situé sous le cuir chevelu, attaché à un cathéter inséré dans le ventricule latéral10,11. Des techniques similaires ont été mises au point chez des animaux de laboratoire tels que les rongeurs pour atteindre des objectifs équivalents. Des pompes micro-osmotiques ont été implantées chez des souris 12,13,14,15 et des rats16,17 pour une administration continue de médicament dans le système ventriculaire ou le parenchyme cérébral. De plus, des injections intra-ventriculaires directes ont été effectuées chez des souris anesthésiées à l’aide d’une aiguille jetable18,19 et chez des rats conscients via une canule implantée chirurgicalement20,21,22,23. L’administration de médicaments dans le SNC a été une méthode inestimable pour améliorer la compréhension dans divers domaines 20,24,25,26,27,28.
Les infections du SNC sont l’un de ces domaines qui nécessite de toute urgence de nouvelles thérapies et une meilleure compréhension des thérapies anti-infectieuses existantes. Les infections du SNC causées par des bactéries à Gram négatif multirésistantes sont particulièrement préoccupantes7. Les polymyxines sont les antibiotiques de dernière intention de plus en plus utilisés pour traiter les infections dues à ces « superbactéries »29. Lorsque les polymyxines sont administrées par voie intraveineuse conformément aux directives posologiques actuelles30, leur pénétration dans le SNC est très faible, tandis que des doses plus élevées augmentent le risque de néphrotoxicité. Par conséquent, le traitement par polymyxine intraveineuse est peu utile pour traiter les infections du SNC7. L’établissement d’un schéma posologique sûr et efficace pour l’administration de polymyxines dans le SNC est un besoin médical urgent non satisfait 31,32,33. Par conséquent, le protocole actuel a été établi et est décrit en mettant l’accent sur l’injection d’antibiotiques directement dans le LCR des rats. Il peut toutefois être utilisé pour administrer tout médicament qui n’est pas neurotoxique et où des concentrations thérapeutiques peuvent être administrées en petits volumes (par exemple, jusqu’à 10 μL chez le rat). Les techniques décrites peuvent également être modifiées pour cibler différentes régions du cerveau et administrer plusieurs injections.
Le protocole actuel présente une technique simple de chirurgie et d’injection qui permet une pharmacocinétique et une distribution efficaces des médicaments après l’administration d’un VCI. La chirurgie consiste à implanter une canule de guidage. Comme il s’agit d’une procédure moins invasive que l’implantation d’une pompe micro-osmotique 12,13,14,15,16,17, il s’agit d’une option avancée adaptée à l’administration à court terme de médicaments dans le LCR. Ce protocole est simplifié et permet d’obtenir des taux de survie très élevés et des poids corporels stables 24 h après l’opération, ce qui représente une amélioration par rapport aux méthodes existantes34. Après l’opération, les rats conscients ont reçu soit une injection manuelle de bolus ICV, soit une administration plus lente à l’aide d’une micropompe pour abaisser les concentrations plasmatiques maximales. En même temps, ils pouvaient se déplacer librement dans leur cage. Afin d’établir des schémas posologiques sûrs et efficaces, des échantillons de LCR, de cerveau, de moelle épinière, de rein, de plasma, etc., ont ensuite été utilisés pour étudier la pharmacocinétique et la distribution du médicament après l’administration intra-ventriculaire (ICV). La distribution des médicaments peut également être étudiée visuellement, par exemple à l’aide de l’immunohistochimie ou de l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MSI). Si nécessaire, une canule bilatérale peut être implantée, par exemple pour injecter des médicaments qui se distribueraient autrement unilatéralement dans les deux hémisphères.
Toutes les expériences ont été menées conformément au code australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Les expériences ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université de Melbourne (demande #1914890). Des rats Sprague-Dawley mâles et femelles âgés de 8 à 14 semaines ont été utilisés pour les expériences.
1. Chirurgie stéréotaxique pour la canulation du ventricule latéral
2. Injections ICV
3. LCR et prélèvement de tissus
Le protocole chirurgical présenté est très efficace, les chirurgiens formés atteignant un taux de survie de >99,8 % et les animaux montrant un poids corporel stable après l’opération le jour 1, par rapport à leur poids préopératoire le jour 0 (moyenne ± ET de 315,8 g ± 42,1 g pour le jour 0 et 314,1 g ± 43,0 g pour le jour 1, figure 3).
Avant de prélever le LCR, une injection de colorant Evans Blue à 1,1 % dans la ...
Les chercheurs et les cliniciens utilisent des injections ICV pour contourner le mécanisme de protection de la BHE et administrer des médicaments directement dans le SNC 12,18,19,21,24. Le présent travail est un protocole ICV complet pour administrer efficacement des médicaments dans le SNC et extraire le LCR pour l’anal...
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Les auteurs remercient le Biomedical Science Animal Facility de l’Université de Melbourne pour la fourniture et les soins aux animaux. Cette recherche a été soutenue par une subvention de recherche de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses de l’Institut national de la santé (R01 AI146241, GR et TV). JL est chercheur principal du Conseil national australien de la recherche médicale en santé (NHMRC). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou de l’Institut national de la santé.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | Terumo, Japan | SS+01T | |
5 mL syringes | Terumo, Japan | SS+05S | |
Acetone | Merck, Germany | 67641 | |
Bench protector sheets | Halyard, USA | 2765-C | |
Betadine | Mundipharma, Netherlands | 1015695 | |
Buprenorphine; Temgesic | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 1238366 | |
Carprofen | Zoetis, Australia | 10001132 | |
Chlorhexidine | Tasman Chemicals, Australia | 890401 | |
Chux superwipes (or equivalent) | Chux, Australia | n/a | autoclaved |
Clippers | n/a | n/a | |
Cotton swabs | LP Italiana, Italy | 112191 | autoclaved |
Dental cement powder (Vertex Self cure powder) | Henry Schein, USA | VX-SC500GVD5 | |
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid) | Henry Schein, USA | VX-SC250MLLQ | |
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G | Terumo, Japan | NN+2525RL | |
Disposable surgical blades | Westlab, Australia | 663-255 | |
Dissector scissors | F.S.T. | 14082-09 | |
Dummy cannulas | Bio Scientific, Australia | C313DC/SPC | cut to 4.05 to fit the guide cannula |
Ethanol 80% | Merck, Australia | 10107 | |
Evan's blue dye | Sigma | E2129 - 50G | |
Eye lube | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 2070491 | |
Felt tip pen | Sharpie, USA | D-4236 | |
Fibre optic light source | n/a | n/a | |
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue | n/a | n/a | |
Glass pipettes, pulled | Hirschmann Laborgeraete, Germany | 9100175 | |
Glass syringe 10 uL | Hamilton, USA | 701 LT and 1701 LT | |
Guide cannulas | Bio Scientific, Australia | C313G/SPC | 22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats |
Haemostat | |||
Heat bead steriliser | Inotech, Switzerland | IS-250 | |
Heat pad | n/a | n/a | |
Hydrogen peroxide 3% | Perrigo, Australia | 11383 | |
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm) | n/a | n/a | |
Injector cannula | Bio Scientific, Australia | C313I/SPC | cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection |
Isoflurane | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 2093803 | |
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system | n/a | n/a | |
Medium size weighing boats | n/a | n/a | |
Metal spatula | Met-App, Australia | n/a | |
Micro syringe pump | New Era, USA | NE-300 | |
Microdrill | RWD Life Science Co, China | 87001 | |
Polymyxin B | Beta Pharma, China | 86-40302 | |
Protein LoBind tubes, 0.5 mL | Eppendorf, Germany | Z666491 | |
Ropivacaine 1%; Naropin | AstraZeneca, UK | PS09634 | |
Scissors, large | F.S.T. | 14511-15 | |
Scissors, small | F.S.T. | 14079-10 | |
Screwdriver | n/a | n/a | |
Screws | Mr. Specs, Australia | n/a | |
Stereotaxic frame | RWD Life Science Co, China | n/a | Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder |
Sterile saline 0.9% | Baxter, USA | AHB1323 | |
Super etch (37% phosphoric acid) gel | SDI Limited, Australia | 8100045 | |
Superglue | UHU, Germany | n/a | |
Tissue forceps with hooks | F.S.T. | 11027-12 | |
Tubing, PE-50 | Bio Scientific, Australia | C313CT |
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