전이를 촉진하기 위해 인간 기질을 사용하는 난소암의 정소성 마우스 모델

인간 기질 세포와 혼합된 난소암 세포의 orthotopic enphytment는 인간 난소암의 특징인 빠르고 확산된 전이성 행동을 보이는 마우스 모델을 제공합니다. 이 모델은 또한 종양 세포와 기질 세포의 상호 작용뿐만 아니라 종양 진행 및 전이에서의 역할에 대한 연구를 가능하게 합니다.

난소암은 조기 확산성 전이가 특징이며, 진단 당시 여성의 70%가 전이성 질환을 가지고 있습니다. 난소암의 우아한 형질전환 마우스 모델이 존재하지만, 이 마우스는 가격이 비싸고 종양이 발생하는 데 오랜 시간이 걸립니다. 복강내 주사 이종이식 모델은 인간 기질이 없으며 난소암 전이를 정확하게 모델링하지 않습니다. 환자 유래 이종이식편(PDX)조차도 연속 PDX 계대가 인간 기질의 상당한 손실을 보여주기 때문에 인간 기질 미세환경을 완전히 재현하지 못합니다. 생리학적으로 관련된 기질 미세환경 내에서 인간 난소암을 쉽게 모델링할 수 있는 능력은 충족되지 않은 요구입니다. 여기서, 프로토콜은 환자 유래 암종 관련 중간엽 줄기세포(CA-MSC)와 결합된 인간 난소암 세포를 사용하는 정형소성 난소암 마우스 모델을 제시합니다. CA-MSC는 기질 전구 세포로, 기질 미세환경의 형성을 주도하고 난소암의 성장과 전이를 지원합니다. 이 모델은 조기에 발생하고 임상 증상을 모방하여 전이를 확산시킵니다. 이 모델에서는 난소암 세포를 발현하는 루시퍼라아제를 CA-MSC와 1:1 비율로 혼합하여 NSG 마우스의 난소 윤활낭에 주입합니다. 종양의 성장과 전이는 생물발광 이미징을 사용하여 시간이 지남에 따라 연속적으로 추적됩니다. 그 결과 종양이 공격적으로 성장하고 주사 후 14일까지 복부 전이를 형성합니다. 생쥐는 전신 질환의 지표로서 체중이 현저히 감소하고 질병 부담이 증가하는 것을 경험했습니다. 주사 후 30일째까지 마우스는 >10%의 체중 감소 및 부검의 종점 기준을 충족하여 마우스의 100%에서 복강 내 전이가 확인되고 60%-80%의 폐 및 실질 간 전이가 확인되었습니다. 총체적으로, 난소암 세포와 기질 세포의 정소성 생착은 인간 난소암의 초기 및 확산성 전이성 행동을 밀접하게 모방하는 종양을 생성합니다. 또한 이 모델은 전이성 진행에서 난소암 세포의 역할, 즉 기질 세포 상호 작용을 연구할 수 있는 도구를 제공합니다.

난소암은 여성의 사망률이 5^번째로 높은 치명적인 질병이다¹. 난소암을 앓고 있는 대부분의 여성은 진행된 단계에서 진단을 받으며, 진단 당시 환자의 70%에서 전이성 전이가 진행되어 있습니다. 조기 전이 및 진단 시 진행된 단계와 같은 요인은 이 질병에서 볼 수 있는 높은 사망률에 기여합니다. 더욱이, 이러한 독특한 질병 특성은 복막강으로의 빠른 질병 이동을 재현하는 것을 포함하여 난소암 마우스 모델을 확립하는 데 어려움을 제기했습니다 ^2,3,4.

복막 전이를 포함한 난소암 발병은 많은 요소로 구성된 지지 종양 미세환경(TME)의 형성에 의해 촉진된다⁵. 난소암 TME의 중요한 구성 요소 중 하나는 암종 관련 중간엽 줄기세포(CA-MSC)입니다. CA-MSC는 난소암 시작, 성장, 화학요법 저항성 및 전이를 향상시키는 기질 전구 세포입니다 ^6,7. CA-MSC는 또한 종양 관련 섬유증을 자극하고, 혈관 신생을 유도하며, 면역 미세환경을 변화시켜 난소암 TME의 형성을 촉진합니다 ^6,8,9. 난소암 TME 내에서 CA-MSC의 강력한 기능을 감안할 때, 생리학적으로 관련된 기질 미세환경 내에서 인간 난소암을 모델링하는 것은 난소암 진행 및 전이를 연구하는 데 매우 중요합니다.

최근에는 형질전환 마우스 모델이 자발적 난소암 전이 연구에서 주목을 받고 있습니다. 그러나 형질전환 마우스는 비용이 많이 들고 전이성 질환의 발병이 장시간 진행됩니다. 복강내 모델 및 환자 유래 이종이식편(PDX)과 같은 다른 사용 가능한 마우스 모델은 전이성 시간 간격이 상대적으로 짧지만, 관련 기질 미세환경이 없기 때문에 난소암 전이를 완전히 재현하지는 못합니다 10,11,12. 이러한 문제를 극복하기 위한 시도로, 본 연구에서는 환자 유래 CA-MSC와 결합된 인간 난소암 세포를 사용하는 정형외과성 난소암 마우스 모델을 제시합니다. 여기에 설명된 모델에서, CA-MSC와 난소암 세포를 결합하면 주입 후 30일 이내에 100%의 마우스에서 복강 내 전이가 존재하는 것으로 입증된 바와 같이 조기 및 미만성 전이가 있는 종양이 생성됩니다.

환자 샘플은 University of Pittsburgh의 IRB(PRO17080326)에서 승인한 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 동물 실험 방법은 피츠버그 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 환자 유래 암종 관련 중간엽 줄기세포(CA-MSC)의 분리 및 검증

참고: CA-MSC는 나팔관, 난소 및/또는 난소 전이성 침전물을 포함하여 외과적으로 절제된 인간 난소암 조직(이 연구에서는 고급 장액성 암종을 사용함)에서 파생됩니다. CA-MSC 배지는 10% 열 비활성화 FBS, 1x B27, 20ng/mL EGF, 1ng/mL 하이드로코르티손, 5μg/mL 인슐린, 100μM β-메르캅토에탄올, 10ng/mL β-FGF, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 20μg/mL 겐타마이신 ^7,13이 보충된 MEBM(유방 상피 세포 기저 배지)으로 제조됩니다.

1. CA-MSC 절연
   1. 멸균 메스와 집게를 사용하여 조직 샘플을 약 1mm³ 인치 크기의 조각으로 나눕니다. 6-well cell culture plate의 각 well에 조직 조각 3개를 놓습니다.
      참고: 0.2g의 종양 조직을 12개의 조각으로 절단할 수 있으며 6웰 세포 배양 플레이트의 4웰로 분배할 수 있습니다.
   2. 각 웰에 대해 약 1mL의 CA-MSC 배지를 얇게 층을 추가합니다. 세포 배양 플레이트를 37°C의 5% CO₂에 가습된 인큐베이터에 넣습니다.
   3. 24시간 후 조직 조각을 방해하지 않고 미디어를 조심스럽게 제거하십시오. 각 웰에 약 1mL의 새 배지를 추가합니다. 조직 부착물을 방해하지 않고 미디어를 천천히 피펫팅합니다. 세포 배양 플레이트를 37°C의 5% CO₂로 가습된 인큐베이터에 다시 넣습니다.
      참고: 매일 도립 현미경으로 조직을 검사하고 배양 배지에서 죽은 세포가 시각화될 때마다 1.1.3단계에 설명된 대로 배지를 교체하십시오.
   4. 7일 후, 멸균 집게를 사용하여 조직을 집어 조직 조각을 제거하고 부착 세포를 PBS(Ca²⁺/Mg²⁺가 없는 PBS, 웰당 1mL)로 한 번 세척합니다. 그런 다음 새로운 CA-MSC 배지(웰당 2mL)를 추가하고 세포 배양 플레이트를 5%_CO2에서 37°C의 가습 인큐베이터에 넣습니다.
2. CA-MSC의 확장
   1. CA-MSC가 6-well 플레이트 내 조직에서 성장하기 시작하면 격일로 도립 현미경으로 세포를 검사하여 세포 성장을 확인합니다. 세포가 90% 농도에 도달하면 다음 단계를 진행합니다.
   2. 세포 배양 플레이트에서 배지를 흡입한 다음 웰당 1-2mL의 PBS(Ca²⁺/Mg²⁺가 없는 PBS)로 세포를 한 번 세척합니다.
   3. 0.05% 트립신/0.02% EDTA 용액(트립신/EDTA)을 웰당 300μL씩 추가합니다. 세포 배양 플레이트를 회전시켜 세포를 트립신/EDTA로 덮고 세포 배양 플레이트를 2-3분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   4. 새로운 CA-MSC 배지를 추가하여 트립신(웰당 1mL)을 비활성화하고 세포를 다시 현탁시킵니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상등액을 제거하고 성장 배지로 세포를 다시 현탁시킵니다. 재부유 세포를 총 부피 5mL의 배양 배지를 가진 25cm² 플라스크로 옮깁니다.
      참고: 6웰 세포 배양 플레이트의 3개 웰에서 수집된 세포는 25cm² 플라스크로 이동할 수 있습니다. 세포는 외과적으로 절제된 인체 조직에서 유래하기 때문에 마이코플라스마의 존재 여부를 검사해야 합니다(PCR과 같은 확립된 마이코플라스마 검출 프로토콜에 따름) ^14,15.
   5. 세포가 70%-80% 농도에 도달하면 앞서 설명한 단계 1.2.2-1.2.4에 따라 25cm² 플라스크에서 75cm² 플라스크로 세포를 이동합니다. 5-7일마다 세포를 확장하여 CA-MSC 검증 및 정소성 접종 절차에 필요한 세포 수를 얻습니다.
      참고: CA-MSC는 환자 유래 세포이기 때문에 세포 배가 시간은 세포주마다 다릅니다. 대부분의 CA-MSC는 그 수가 두 배로 늘어나는 데 3-4일이 걸립니다. 그러나 일부 CA-MSC는 숫자가 두 배로 늘어나는 데 5-7일이 걸립니다. CA-MSC는 8-10회 통과할 수 있습니다. 통과 10 이후에는 CA-MSC가 노화되거나 구별될 수 있습니다.
3. CA-MSC 검증
   1. CA-MSC 표면 발현 검증: 유세포 분석을 위해 0.5 x 10⁶ CA-MSC(75cm² 플라스크에서 약 70% 포화도)를 사용하여 CA-MSC가 앞서 설명한 바와 같이 국제 세포 치료 학회(International Society for Cellular Therapy) 가이드라인에 정의된 대로 적절한 표면 마커를 발현하도록 합니다(CD73/CD90/CD105 양성; CD45/CD34/CD14 또는 CD11b/CD79a 또는 CD19/HLA-DR 음성)^7,16. 트립신화(trypsinization) 후 세포 수를 확인하고 죽은 세포를 트리판-블루(trypan-blue)로 배제한 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
      참고: 유세포 분석 분석에서 세포의 순도가 <90%인 것으로 입증되면 CA-MSC 집단에 대해 세포를 분류합니다.
   2. CA-MSC 분화 검증: 계통 분화를 검증하기 위해 2mL의 MSC 배지(분화 조건당 1개의 웰)에서 5 x 10⁴ cells/well의 세포 밀도로 CA-MSC를 6-well 플레이트의 1개의 well에 시딩합니다. 24시간 후, 앞서 설명한 바와 같이 지방 세포 대 연골 세포 대 골세포 분화를 유도하기 위해 배지를 적절한 분화 매체로 변경합니다 ^7,16.
      참고: ISCT 지침에 따라 MSC는 최소 두 가지 라인(지방 세포, 연골 세포 또는 골 세포)으로 체외 분화를 입증해야 합니다.
4. 계획된 마우스 주입 시술 당일에 1.2.2 및 1.2.4 단계에 따라 세포를 수집합니다. 그런 다음 생존율을 위해 트리판-블루 배제와 함께 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 1 x 10⁸ cell/mL(주입당 0.5 x 10⁶ CA-MSC)의 밀도로 CA-MSC 배지에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 부유 세포를 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 일반적으로 하나의 종양 샘플(조직 0.2g)에서 최소 1 x 10⁷ CA-MSC를 파생할 수 있습니다. 이를 통해 대부분의 마우스 실험에 단일 환자 유래 CA-MSC 라인을 사용할 수 있습니다. 다른 환자의 CA-MSC를 결합하는 것이 가능하지만 동일한 난소암 조직학적 아형에서 유래하는 것이 좋습니다. 대부분의 CA-MSC 라인은 1 x 10⁷ 세포에 도달하는 데 2개월 및/또는 6-7 계대가 걸립니다. CA-MSC는 표준 세포 동결 매체를 사용하여 동결하고 나중에 사용할 수 있도록 액체 질소에 무기한 보관할 수 있습니다.

2. 난소암 세포의 준비

1. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(페니실린: 100 units/mL, 스트렙토마이신: 0.1 mg/mL)이 포함된 DMEM 배지에서 OVCAR3-Luc 세포를 유지합니다. 37°C에서 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
2. 주사 당일에는 다음 단계를 사용하여 OVCAR3-Luc 세포를 수집합니다.
   1. 먼저 세포 배양 플라스크에서 배지를 흡인하고 75cm² 플라스크당 5-7mL의 PBS(Ca²⁺/Mg²⁺가 없는 PBS)로 세포를 한 번 세척합니다. PBS를 흡인하고 트립신/EDTA 용액(75cm² 플라스크당 2mL)을 추가합니다. 그런 다음 세포 배양 플라스크를 3-5분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   2. 현미경 검사를 사용하여 세포의 완전한 트립신화를 확인합니다(모든 세포가 배양 플라스크에서 분리되었는지 확인). 트립신화를 중단하려면 플라스크에 새로운 혈청 함유 DMEM(75cm² 플라스크당 2-3mL)을 추가하고 세포를 다시 현탁시킵니다. 피펫을 사용하여 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   3. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상등액을 제거하고 성장 배지로 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 계수하고 1 x 10⁸ cell/mL(주입당 0.5 x 10⁶ OVCAR3-Luc 세포)의 밀도로 성장 배지에 다시 현탁합니다. 부유 세포를 얼음 위에 놓습니다.

3. 정소성 접종

1. 세포 현탁액의 준비
   1. CA-MSC와 OVCAR-Luc 셀을 1:1 비율로 혼합합니다.
   2. 얼어붙은 기저막 매트릭스를 얼음 욕조에서 해동합니다. 그런 다음 3.1.1단계에서 준비한 세포 현탁액을 1:1의 비율로 기저막 매트릭스에 첨가하고(최종 세포 농도: 1 x 10⁶/ 20 μL의 중기저막 매트릭스) 철저히 블렌딩합니다. 준비된 세포 현탁액은 사용할 때까지 얼음 수조에 보관해야 합니다.
      참고: 여기에 설명된 것은 언급된 모델에 대한 이전 경험을 기반으로 한 1:1 CA-MSC 대 OVCAR-Luc 비율입니다. 이전 연구에서는 CA-MSC가 환자 조직에서 직접 정량화할 때 일반적으로 종양 세포와 1:10 비율임을 보여주었습니다. 아래에서 논의된 바와 같이, 1:1 CA-MSC 대 종양 세포 비율로 시작하면 이 모델을 사용하여 실험 종료 지점에서 원발성 및 전이성 부위 모두에서 CA-MSC와 종양 세포의 비율이 대략 1:10 됩니다.
2. 외과
   참고: 수술은 멸균 상태에서 수행해야 하며 멸균 수술 기구를 사용해야 합니다. 이 orthotopic 모델에는 생후 8주령의 암컷 NSG 마우스를 사용하는 것이 좋습니다.
   1. 이소플루란(유도용 4%, 유지용 2%)과 산소(100%, 유량계 0.5-1L/min)를 흡입하여 마우스를 마취합니다. 수술 전 노즈콘 시스템에 마우스를 놓습니다. 수술 내내 마취를 전달하려면(아래 세부 지침 참조) 마우스의 머리를 이소플루란 기화기 노즈콘 시스템에 삽입합니다.
   2. 인슐린 주사기와 함께 수술 전 진통제인 카프로펜 5mg/kg을 마우스에 피하 주사합니다.
   3. 클리퍼를 사용하여 늑골 가장자리와 대퇴골 사이에 있는 마우스의 왼쪽 꼬리 부분을 면도합니다. 포비돈 요오드 용액과 알코올 면봉으로 면도한 부위를 소독합니다. 그런 다음 마우스를 수술용 콧방울 시스템으로 옮기고 유지 마취를 위해 이소플루란을 1.5%로 조정합니다.
   4. 늑골 가장자리에서 약 2-3cm 아래 1-2cm 수평 피부 절개를 만듭니다. 겸자로 두정엽을 잡고 들어 올립니다(복막은 광택이 나고 지방 조직의 침전물이 특징임). 복막을 1cm 절개하여 복강을 엽니다.
   5. 복막 진입 시 쥐의 난소(난소 윤활낭)를 둘러싼 지방 조직의 수집을 관찰합니다. 구부러진 집게를 사용하여 난소 점액낭을 잡고 노출시킵니다. 겸자로 난소를 단단히 잡으면서 3.1.2단계에서 준비한 세포 현탁액 20μL를 윤활낭에 주입합니다.
   6. 조심스럽게 난소를 복강으로 되돌립니다. 바늘에 부착된 흡수성 폴리글리콜산 6-0 봉합사를 사용하여 두정엽 복막 절개 부위의 가장자리를 다시 그립니다. 상처 클립으로 절개 부위를 닫습니다.
   7. 콧방울에서 마우스를 제거하고 의식을 회복하고 흉골 누운 상태를 유지할 때까지 따뜻한 빛 아래에서 별도의 깨끗한 케이지에 마우스를 넣습니다. 그런 다음 마우스를 케이지로 되돌립니다.
   8. 수술 후 3-7일 동안 매일 생쥐를 모니터링하십시오. 통증 조절을 위해 마우스 케이지에 카프로펜 젤 한 컵을 놓습니다. 수술 후 7-10일 후에 상처 클립을 제거합니다.

4. 매주 종양 성장 및 마우스 체중 모니터링

1. 생체 내 이미징 시스템(IVIS): 정소성 접종 후 첫 주부터 시작하여 다음 3-4주 동안 매주 생체 내 이미징을 수행합니다.
   1. 15mg을 1mL PBS에 용해시키고 0.22μm 멤브레인을 통해 여과하여 멸균하여 D-루시페린(반딧불이 루시페라아제의 기질) 용액을 준비합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 IVIS를 작동하십시오. Living Image Software 바탕 화면 아이콘을 클릭합니다. 그런 다음 IVIS Acquisition Control Panel에서 Initialize를 선택합니다. 이 단계는 최대 10-15분이 소요될 수 있습니다. 이 시간 동안 이미징을 위해 마우스를 준비합니다.
   3. IVIS에 연결된 이소플루란 챔버(2%-4% 이소플루란 및 산소 유량계를 0.5-1L/min)에 사용하여 각 마우스를 마취합니다. 인슐린 주사기를 사용하여 복강내 주사를 통해 D-루시페린(체중 100μL/체중 10g)을 주사합니다.
   4. 루시페린을 주입한 동물을 이소플루란 챔버에 다시 넣습니다.
      참고: 연구 전반에 걸쳐 루시페린 주입과 이미징 성능 사이의 시간을 일관되게 유지하기 위해 주입 시간을 기록하는 것이 중요합니다.
   5. 마취된 마우스를 이미징 챔버로 옮기고 이미징 시스템을 적절한 설정으로 설정합니다. 그런 다음 적절한 시간에 이미지를 획득합니다.
   6. 이미지를 저장한 후 이미징 챔버에서 마우스를 제거하고 해당 케이지에 다시 넣습니다.
      참고: CA-MSC는 IVIS의 형광 채널을 사용하여 생체 내에서 모니터링된 CA-MSC 및 OVCAR3-Luc 세포의 형광 태그 및 이동/공동 전이로 표지할 수도 있습니다.

5. CA-MSC: 종양 세포 전이 침착물 평가

1. 사전 정의된 종점(복수가 있는 경우 체중 증가>20%, 체중 감소<10%, 종양 궤양, 신체 조절 점수^{2 이하 17})에 도달하면 제도적 동물 복지 기준에 따라 마우스를 안락사시킵니다.
2. 각 마우스에 대해 개별적으로 부검을 수행합니다. 18G의 멸균 바늘을 복강 내부에 삽입하여 복수를 흡인합니다. 다음으로 흉강과 복강을 노출시킵니다. 쥐 기관의 종양 침범에 대한 육안 검사를 통해 전체 전이성 질환을 정량화한다¹⁸.
3. 멸균 메스를 사용하여 종양 조직을 제거하고 i) 파라포름알데히드를 고정하여 파라핀 포매링을 수행하거나, ii) OTC 저온 유지 물질 포매 매체에 급속 동결 및 내장하거나, iii) 다운스트림 DNA, RNA 또는 단백질 분석을 위해 급속 동결하거나, iv) 유세포 분석 또는 FACS 분리를 위해 단일 세포로 해리합니다.
   참고: CA-MSC는 이 모델에서 계속 사용할 수 있으며 다운스트림 애플리케이션을 위해 다시 분리할 수 있습니다. 연구의 목표에 따라 면역조직화학적 접근법, 유세포 분석 접근법 또는 배양에서 재분리된 세포 유지를 통해 CA-MSC와 종양 세포의 상호 작용을 조사할 수 있습니다.

설명된 접근 방식은 환자 유래 중간엽 줄기세포(CA-MSC)와 난소암 세포를 난소 윤활낭에 동시 주입하여 난소암(특히 고급 장액성 암종)의 지지적인 미세환경을 밀접하게 모방합니다. 먼저, CA-MSC는 오멘텀을 포함하는 원발성 외과적 절제 인간 고급 장액 난소암에서 분리되었습니다(이 실험에 사용된 모든 CA-MSC는 동일한 환자에서 유래했습니다). 조직 샘플을 도금한 지 2주 ?...

상당한 임상 및 연구 노력에도 불구하고 난소암의 치료 및 예방에 있어 진전은 거의 이루어지지 않았다¹. 난소암 진행과 전이를 연구하기 위해 다양한 마우스 모델이 사용되었지만, 이러한 모델은 상당한 한계에 직면해 있습니다. 특히, 이전의 마우스 모델은 초기의 미만성 복강 내 전이의 특징을 포함하여 난소암 진행의 자연사를 완전히 요약할 수 없?...

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

조직 수집에 도움을 주신 Gynecologic Oncology Biospecimen Program-Promark에 감사드립니다. LGC는 Tina's Wish Rising Star Grant와 Mary Kay Foundation의 지원을 받습니다.