使用人基质促进转移的卵巢癌原位小鼠模型

卵巢癌细胞与人基质细胞混合的原位植入提供了一种小鼠模型，该模型表现出人卵巢癌特征的快速、弥漫性转移行为。该模型还允许研究肿瘤细胞和基质细胞的相互作用，以及它们在肿瘤进展和转移中的作用。

卵巢癌的特征是早期弥漫性转移，70% 的女性在诊断时患有转移性疾病。虽然存在优雅的卵巢癌转基因小鼠模型，但这些小鼠价格昂贵且需要很长时间才能发展出肿瘤。腹腔注射异种移植模型缺乏人基质，不能准确模拟卵巢癌转移。即使是患者来源的异种移植物 （PDX） 也不能完全概括人类基质微环境，因为连续的 PDX 传代显示人类基质的显着丢失。在生理相关的基质微环境中轻松模拟人类卵巢癌的能力是一个未满足的需求。在这里，该方案提出了一种原位卵巢癌小鼠模型，该模型使用人卵巢癌细胞与患者来源的癌相关间充质干细胞 （CA-MSCs） 相结合。CA-MSC 是基质祖细胞，驱动基质微环境的形成并支持卵巢癌的生长和转移。 该模型早期发展并弥漫转移，模拟临床表现。在该模型中，表达荧光素酶的卵巢癌细胞与 CA-MSC 以 1：1 的比例混合，并注射到 NSG 小鼠的卵巢滑囊中。使用生物发光成像随时间连续跟踪肿瘤生长和转移。所得肿瘤侵袭性生长，并在注射后 14 天形成腹部转移。小鼠体重显着下降，这是全身性疾病和疾病负担增加的标志物。到注射后第 30 天，小鼠达到体重减轻 >10% 的终点标准，尸检证实 100% 的小鼠腹腔内转移和 60%-80% 的肺和实质肝转移。总的来说，卵巢癌细胞和基质细胞的原位植入产生的肿瘤与人类卵巢癌的早期和弥漫性转移行为非常相似。此外，该模型提供了一种工具来研究卵巢癌细胞：基质细胞相互作用在转移进展中的作用。

卵巢癌是一种致命的疾病，在所有女性癌症中死亡率排名^第 5¹。大多数患有卵巢癌的女性在晚期被诊断出来，70% 的患者在诊断时存在转移扩散。早期转移和诊断时的晚期等因素导致这种疾病的高死亡率。此外，这些独特的疾病特征对建立卵巢癌小鼠模型构成了挑战，包括复制疾病快速迁移到腹膜腔 ^2,3,4。

卵巢癌的发病机制，包括腹膜扩散，是通过形成包含许多元素的支持性肿瘤微环境 （TME） 来促进的⁵。卵巢癌 TME 的一个关键组成部分是癌相关间充质干细胞 （CA-MSC）。CA-MSC 是基质祖细胞，可增强卵巢癌的发生、生长、化疗耐药性和转移 ^6,7。CA-MSC 还通过刺激肿瘤相关纤维化、诱导血管生成和改变免疫微环境来驱动卵巢癌 TME 的形成 ^6,8,9。鉴于 CA-MSC 在卵巢癌 TME 中的强大功能，在生理相关的基质微环境中对人类卵巢癌进行建模对于研究卵巢癌进展和转移至关重要。

最近，转基因小鼠模型在自发性卵巢癌转移的研究中获得了吸引力。然而，转基因小鼠成本高昂，并且转移性疾病的发展时间延长。虽然其他可用的小鼠模型，如腹膜内模型和患者来源的异种移植物 （PDX），具有相对较短的转移时间间隔，但由于缺乏相关的基质微环境，它们不能完全概括卵巢癌转移 10,11,12。为了克服这一挑战，本研究提出了一种使用人卵巢癌细胞结合患者来源的 CA-MSC 的原位卵巢癌小鼠模型。在此处描述的模型中，将 CA-MSC 与卵巢癌细胞结合会产生具有早期和弥漫性转移的肿瘤，注射后 30 天内 100% 的小鼠存在腹腔内转移证明了这一点。

根据匹兹堡大学 IRB （PRO17080326） 批准的方案获取患者样本。动物实验方法根据匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 患者来源的癌相关间充质干细胞 （CA-MSC） 的分离和验证

注意：CA-MSC 来源于手术切除的人卵巢癌组织（本研究使用高级别浆液性癌），包括输卵管、卵巢和/或网膜转移沉积物。CA-MSC 培养基由补充有 10% 热灭活 FBS、1x B27、20 ng/mL EGF、1 ng/mL 氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素、100 μM β-巯基乙醇、10 ng/mL β-FGF、1% 青霉素/链霉素和 20 μg/mL 庆大霉素的 MEBM（乳腺上皮细胞基础培养基）制备^7,13。

1. CA-MSC 分离
   1. 使用无菌手术刀和镊子，将组织样本分成大约 1 毫米³ 大小的块。将三块组织放入 6 孔细胞培养板的每个孔中。
      注：0.2 g 肿瘤组织可切成 12 块，可分配到 6 孔细胞培养板的 4 个孔中。
   2. 添加一层薄薄的 CA-MSC 培养基，每个孔约 1 mL。将细胞培养板置于 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中。
   3. 24 小时后，小心去除培养基，不要干扰组织块。向每个孔中加入大约 1 mL 的新鲜培养基。缓慢移液培养基，不要干扰组织附着物。将细胞培养板放回 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中。
      注：每天用倒置显微镜检查组织，并在培养基中观察到死细胞时按照步骤 1.1.3 中的说明更换培养基。
   4. 7 天后，使用无菌镊子拾取组织去除组织块，并用 PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺的 PBS，每孔 1 mL）洗涤贴壁细胞一次。然后，加入新鲜的 CA-MSC 培养基（每孔 2 mL），并将细胞培养板置于 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中。
2. CA-MSC 的扩展
   1. 当 CA-MSC 开始从 6 孔板内的组织中生长时，每隔一天用倒置显微镜检查细胞以确保细胞生长。一旦细胞达到 90% 汇合度，请继续执行以下步骤。
   2. 从细胞培养板中吸出培养基，然后用每孔 1-2 mL PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺的 PBS）洗涤细胞一次。
   3. 每孔添加 300 μL 的 0.05% 胰蛋白酶/0.02% EDTA 溶液（胰蛋白酶/EDTA）。旋转细胞培养板，用胰蛋白酶/EDTA 覆盖细胞，然后将细胞培养板放回培养箱中 2-3 分钟或直到细胞分离。
   4. 加入新鲜的 CA-MSC 培养基以灭活胰蛋白酶（每孔 1 mL）并重新悬浮细胞。以 300 x g 离心 5 分钟。去除上清液并用生长培养基重悬细胞。将重悬细胞转移至总体积为 5 mL 培养基的 25 cm² 培养瓶中。
      注：从 6 孔细胞培养板的三个孔中收集的细胞可以转移到 25 cm² 培养瓶中。应检测细胞是否存在支原体（遵循既定的支原体检测方案，如 PCR），因为它们来自手术切除的人体组织^14,15。
   5. 一旦细胞达到 70%-80% 汇合度，按照前面描述的步骤 1.2.2-1.2.4 将细胞从 25 cm² 培养瓶转移到 75 cm² 培养瓶中。每 5-7 天扩增一次细胞，以获得 CA-MSC 验证和原位接种程序所需的细胞数量。
      注：由于 CA-MSC 是患者来源的细胞，因此细胞系之间的细胞倍增时间不同。大多数 CA-MSC 需要 3-4 天才能增加一倍的数量。然而，一些 CA-MSC 需要 5-7 天才能增加一倍的数量。CA-MSC 可以传代 8-10 次。第 10 代后，CA-MSC 可能衰老或分化。
3. CA-MSC 验证
   1. CA-MSC 表面表达验证：使用 0.5 x 10⁶ 个 CA-MSC（在 75 cm² 培养瓶中约 70% 汇合）进行流式细胞术分析，以确保 CA-MSC 表达国际细胞治疗学会指南定义的适当表面标志物，如前所述（CD73/CD90/CD105 阳性;CD45/CD34/CD14 或 CD11b/CD79a 或 CD19/HLA-DR 阴性）^7,16。确认胰蛋白酶消化后的细胞数量，并使用血细胞计数器进行计数，台盼蓝排除死细胞。
      注：如果流式细胞术分析表明细胞纯度为 <90%，则对 CA-MSC 群体的细胞进行分类。
   2. CA-MSC 分化验证：为了验证谱系分化，在 2 mL MSC 培养基中，以 5 x 10⁴ 个细胞/孔的细胞密度将 CA-MSC 接种到 6 孔板的一个孔中（每个分化条件一个孔）。24 小时后，将培养基更换为适当的分化培养基，以诱导脂肪细胞 vs 软骨细胞 vs 骨细胞分化，如前所述 ^7,16。
      注意：根据 ISCT 指南，MSC 必须在体外分化为至少两条线（脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞）。
4. 在计划的小鼠注射程序当天，按照步骤 1.2.2 和 1.2.4 收集细胞。然后，使用排除台盼蓝的血细胞计数器对细胞进行细胞计数，并以 1 x 10⁸ 个细胞/mL（每次注射 0.5 x 10⁶ 个 CA-MSC）的密度将细胞重悬于 CA-MSC 培养基中。将悬浮细胞放在冰上。
   注意：通常，至少可以从一个肿瘤样本（0.2 g 组织）中获得 1 x 10⁷ 个 CA-MSC。这使得单个患者来源的 CA-MSC 细胞系可用于大多数小鼠实验。可以组合来自不同患者的 CA-MSC，但我们建议它们来源于相同的卵巢癌组织学亚型。大多数 CA-MSCs 系需要 2 个月和/或 6-7 次传代才能达到 1 x 10⁷ 个细胞。CA-MSC 可以使用标准细胞冷冻培养基进行冷冻，并无限期地储存在液氮中以备后用。

2. 卵巢癌细胞的制备

1. 将 OVCAR3-Luc 细胞维持在含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和青霉素/链霉素（青霉素：100 单位/mL，链霉素：0.1 mg/mL）的 DMEM 培养基中。在 37 °C 下在 5% CO₂ 加湿培养箱中培养细胞。
2. 在注射当天，使用以下步骤收集 OVCAR3-Luc 细胞。
   1. 首先，从细胞培养瓶中吸出培养基，每 75 cm² 培养瓶用 5-7 mL PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺的 PBS）洗涤细胞一次。吸出 PBS 并加入胰蛋白酶/EDTA 溶液（每 75 cm² 培养瓶 2 mL）。然后，将细胞培养瓶放回培养箱中 3-5 分钟或直到细胞分离。
   2. 使用显微镜检查，确保细胞完全胰蛋白酶消化（确保所有细胞都从培养瓶中分离）。为了终止胰蛋白酶消化，向培养瓶中加入新鲜的含血清 DMEM（每 75 cm² 培养瓶 2-3 mL）并重新悬浮细胞。使用移液器将细胞转移到 15 mL 锥形管中。
   3. 以 300 x g 离心 5 分钟。去除上清液并用生长培养基重悬细胞。然后，对细胞进行计数，并以 1 x 10⁸ 个细胞/mL（每次注射 0.5 x 10⁶ 个 OVCAR3-Luc 细胞）的密度重新悬浮在生长培养基中。将悬浮细胞放在冰上。

3. 原位接种

1. 细胞悬液的制备
   1. 以 1：1 的比例混合 CA-MSC 和 OVCAR-Luc 细胞。
   2. 在冰浴中解冻冷冻的基底膜基质。然后，将步骤 3.1.1 中制备的细胞悬液以 1：1 的比例（最终细胞浓度：1 x 10⁶/20 μL 培养基基底膜基质）添加到基底膜基质中，并充分混合。制备的细胞悬液应保存在冰浴中直至使用。
      注：此处描述的是基于以前使用上述模型的经验的 1：1 CA-MSC 与 OVCAR-Luc 比率。以前的工作表明，当直接从患者组织中定量时，CA-MSC 通常与肿瘤细胞的比例为 1：10。如下所述，从1：1的CA-MSC与肿瘤细胞比率开始，使用该模型，在实验终点的原发性和转移部位，CA-MSC与肿瘤细胞的比例约为1：10。
2. 手术
   注意：手术应在无菌条件下进行，并且必须使用无菌手术器械。建议将 8 周龄的雌性 NSG 小鼠用于这种原位模型。
   1. 用异氟醚（4% 用于诱导，2% 用于维持）和氧气（100%，流量计 0.5-1 L/min）吸入麻醉小鼠。将鼠标放在术前鼻锥系统上。要在整个手术过程中提供麻醉（请参阅下面的详细说明），请将小鼠的头部插入异氟醚蒸发器鼻锥系统。
   2. 用胰岛素注射器皮下注射小鼠 5 mg/kg 卡洛芬，一种术前镇痛药。
   3. 使用剪刀，剃掉肋缘和股骨之间的鼠标左尾部。用聚维酮碘溶液和酒精棉签对剃须区域进行消毒。然后，将鼠标转移到手术鼻锥系统并将异氟醚调节至 1.5% 以进行维持麻醉。
   4. 在肋缘下方约 2-3 厘米处做一个 1-2 厘米的水平皮肤切口。用镊子抓住壁层腹膜并抬高（腹膜会显得有光泽，并以脂肪组织沉积为特征）。在壁层腹膜上做一个 1 cm 的切口以打开腹腔。
   5. 观察进入腹膜时小鼠卵巢（卵巢滑囊）周围的脂肪组织聚集。使用弯曲的镊子抓住并露出卵巢滑囊。在用镊子牢牢抓住卵巢的同时，将 20 μL 在步骤 3.1.2 中制备的细胞悬液注入滑囊中。
   6. 小心地将卵巢放回腹腔。使用连接到针头的可吸收聚乙醇酸 6-0 缝合线，重新接近壁层腹膜切口的边缘。用伤口夹闭合皮肤切口。
   7. 将鼠标从鼻锥中取出，将鼠标放在单独的干净笼子里，在温暖的光线下，直到它恢复意识并保持胸骨斜躺。然后，将鼠标放回笼子里。
   8. 手术后 3-7 天每天监测小鼠。在小鼠笼中放置一杯卡洛芬凝胶以控制疼痛。术后 7-10 天取下伤口夹。

4. 每周监测肿瘤生长和小鼠体重

1. 体内成像系统 （IVIS）：从原位接种后的第一周开始，在接下来的 3-4 周内每周进行 体内 成像。
   1. 通过将 15 mg 溶解在 1 mL PBS 中并通过 0.22 μm 膜过滤进行灭菌来制备 D-荧光素（萤火虫荧光素酶的底物）的溶液。
   2. 按照制造商的说明作 IVIS。单击 Living Image Software 桌面图标。然后，在 IVIS 采集控制面板上，选择 初始化。此步骤最多可能需要 10-15 分钟。在此期间，准备小鼠进行成像。
   3. 使用连接到 IVIS 的异氟醚室（2%-4% 异氟醚和氧气流量计至 0.5-1 L/min）麻醉每只小鼠。使用胰岛素注射器通过腹膜内注射注射 D-荧光素（100 μL/10 g 体重）。
   4. 将注射荧光素的动物放回异氟醚室中。
      注意：记录注射时间非常重要，以便在整个研究过程中保持荧光素注射和成像性能之间的时间一致。
   5. 将麻醉的鼠标转移到成像室，并将成像系统设置为适当的设置。然后，在适当的时间获取图像。
   6. 保存图像后，将小鼠从成像室中取出并将它们放回各自的笼子中。
      注意：CA-MSC 也可以用荧光标签标记，并使用 IVIS 上的荧光通道在 体内 监测 CA-MSC 和 OVCAR3-Luc 细胞的迁移/共转移。

5. 评估 CA-MSC：肿瘤细胞转移沉积物

1. 在达到其预定义的终点（存在腹水、体重减轻 <10%、肿瘤溃疡、身体状况评分为 2 分或更低¹⁷ 分）时（体重增加 >20%），根据机构动物福利标准对小鼠实施安乐死。
2. 对每只鼠标单独进行尸检。将 18 G 无菌针头腹膜内放置以吸出任何腹水。接下来，暴露胸腔和腹腔。通过目视检查小鼠器官的肿瘤受累来量化大体转移性疾病¹⁸。
3. 使用无菌手术刀去除肿瘤组织，然后 i） 固定在多聚甲醛中以最终石蜡包埋，ii） 快速冷冻并包埋到 OTC 低温恒温器包埋培养基中，iii） 快速冷冻用于下游 DNA、RNA 或蛋白质分析，或 iv） 解离成单个细胞用于流式细胞术或 FACS 分离。
   注：CA-MSC 在此模型中仍然可行，并且可以重新分离用于下游应用。根据研究目标，可以通过免疫组织化学方法、流式细胞术方法或维持培养物中重新分离的细胞来研究 CA-MSC 与肿瘤细胞的相互作用。

所描述的方法通过将患者来源的间充质干细胞 （CA-MSC） 和卵巢癌细胞共同注射到卵巢滑囊中，与卵巢癌（特别是高级别浆液性癌）的支持微环境非常相似。首先，从涉及网膜的原发性手术切除的人高级别浆液性卵巢癌中分离 CA-MSC （本实验中使用的所有 CA-MSC 均来自同一患者）。对组织样品进行铺板 2 周后，检测 CA-MSC 是否符合国际细胞治疗学会 （ISCT） 为间充质干细胞/...

尽管在临床和研究方面做出了大量努力，但在卵巢癌的治疗和预防方面取得的进展微乎其微¹。虽然已使用多种小鼠模型来研究卵巢癌的进展和转移，但这些模型面临重大限制。特别是，以前的小鼠模型无法完全概括卵巢癌进展的自然史，包括早期弥漫性腹腔内转移的标志性特征^11,12。最近的研究表明，卵巢癌?...

作者声明没有利益冲突。

我们要感谢妇科肿瘤生物样本计划 - Promark 在组织采集方面提供的帮助。LGC 得到了 Tina's Wish Rising Star Grant 和 The Mary Kay Foundation 的支持。