ヒト腸内細菌叢におけるC-グリコシド代謝酵素の特性評価のための構造生物学および分析化学アプローチ。議定書。1つは、タンパク質の生産と精製です。表現ベクトルの構築。
NCBIから遺伝子クラスター配列GenBank LC422372.1を入手します。遺伝子を改変されたpET-28aベクターにクローニングします。プラスミドを大腸菌BL21 DE3コンピテントセルに形質転換します。
その後、LB培地で細菌を50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンで37度で培養します。細菌密度OD600が0.6に達したら、0.2ミリモルのIPTGを培地に加えます。バクテリアを16度で16時間培養します。
細菌培養物を4,000倍gで4度で遠心分離します。上清を捨て、バクテリアペレットを保持します。細菌ペレットをバッファーA.タンパク質の精製に再懸濁します。
細菌の再懸濁液に1ミリモルPMSFを追加します。.超音波セルブレーカーで細菌懸濁液を溶解します。細菌溶解物を48,000倍gで40分間4度で遠心分離します。
上清中のタンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーNTAカラムを用いて精製します。結合したタンパク質をバッファーBとグラジエントで溶出します。次のステップのために、SDS-PAGEから高UV 280ナノメートルの吸収と透明なタンパク質バンドのサンプルを収集します。
バッファーCに対してサンプルを透析し、イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して透析タンパク質を精製します。Buffer Cで標的タンパク質をカラムに結合し、結合したタンパク質をBuffer D成分で溶出します。次のステップのために、Buffer E.Collectタンパク質サンプルを含むサイズ排除カラムを使用してタンパク質を精製します。
タンパク質サンプルをミリリットルあたり20ミリグラムに濃縮し、分注し、液体窒素で急速に凍結します。将来の使用のために80度で保管してください。QuickDropとUV 280ナノメートルを使用してタンパク質濃度を測定します。
円二色性、CD、スペクトルデータ収集。タンパク質を1mmリットルあたり0.2ミリグラムに希釈し、1倍のPBSバッファー、pH 7.4で希釈します。装置のスキャン速度を毎分50ナノメートルに設定し、スペクトル帯域幅を1ナノメートルに設定します。
200〜260ナノメートルの波長範囲のCDスペクトルデータを収集します。PBSの背景を差し引き、3つの測定値から平均値を取ります。2つ目は、タンパク質結晶構造解析と構造化決定です。
タンパク質の結晶成長と最適化。48ウェル結晶プレート上のタンパク質結晶化キットを用いたシッティングドロップ法による結晶化初期スクリーニングを行います。沈殿剤とタンパク質濃度の勾配を設定し、ハンギングドロップ法を使用してタンパク質の結晶化を最適化します。
結晶をリザーバーバッファーとターゲット化合物を含む浸漬溶液に、成長完了後16°Cで30分間移します。結晶を25%グリセロールを添加した結晶化緩衝液を含む凍結保護剤溶液に移し、すぐに液体窒素で保存してデータ収集します。タンパク質結晶のデータ収集と構造化決定。
NFPSのSSRFのビームラインで、入射波長0.978オングストロームを使用してX線回折データの完全なセットを収集します。結晶回折データは、最初にプログラム結晶学データ処理ソフトウェアを使用して処理します。自動データ処理プログラムを使用してフェーズを実行します。
結晶構造決定ソフトウェアを使用して、構造モデルの自動改良と最適化を行います。3つ目は、反応活性のモニタリングと速度論的パラメータの決定です。HPLCによるDgpA/B/C活性のモニタリング。
C-グリコシド切断反応システムをPBS緩衝液、pH 7.4で組み立てます。これには、20マイクロモル/ミリリットル/ミリリットルのDgpA / B / C、1リットルあたり1ミリモルのマンガンイオン、1リットルあたり1ミリモルのNAD、1リットルあたり10ミリモルのDTT、および0.1ミリモル/リットルの基質、プエラリン、ダイジン、ゲニスチンが含まれています。ピペッティングで十分に混合し、37°Cで8時間インキュベートします。反応系に3倍の量のメタノールを加えて、反応を終了します。
反応溶液を16, 000倍gで15分間遠心分離し、沈殿物を除去します。0.22マイクロメートルのフィルターメンブレンを使用して上清をろ過します。1分あたり1ミリリットルの流量、UV265ナノメートルの検出波長、10マイクロリットルの注入量でグラジエント溶出でHPLC分析を行います。
2,6-ジクロロフェノールインドフェノール、DCPIP、アッセイによるDgpA活性のモニタリング。1リットルあたり0.8ミリモルのDCPIP、50マイクロモル/リットルのタンパク質、および1リットルあたり10ミリモルの基質を、1倍PBSバッファー、pH 7.4でインキュベートします。反応の20時間後、マイクロプレートリーダーを使用して600ナノメートルでのDCPIPの吸光度変化を記録します。
プエラリンのC-グリコシド結合切断反応におけるグルコースの阻害率の決定。セクション3.1に記載されているように、反応システムに対して異なる濃度のグルコースで、1倍のPBS緩衝液、pH 7.4で反応を実行します。37度で12時間反応を行います。
生成した製品の定量分析をHPLCで行います。運動学的パラメータの決定。DgpA/B/C C-グリコシド切断反応では、プエラリンの濃度は0.01〜4ミリモル/リットル、ダイジンとゲニスチンの濃度は0.01〜2ミリモル/リットルに設定されました。
セクション3.1に記載されている方法に従って、37度で8時間反応を実行します。Kmおよびkcat速度論パラメータを導出するには、計算された反応速度と基質濃度をPrismのMichaelise-Mentenモデルに当てはめます。4、反応中間生成物の調製と検出。
反応中間体の調製。ダイジンとゲニスチンを基質として使用して、セクション3.1に記載されている方法に従って90ミリリットルの反応システムで反応を行います。分取液体クロマトグラフィーカラムを備えた分取HPLCを使用して、中間製品を精製します。
精製した中間製品を真空遠心濃縮器で乾燥させ、将来の使用に備えます。LC-MSによる反応中間物の特性評価ダイジン反応とゲニスチン反応から精製された中間生成物の一部をメタノールに溶解して、各化合物の溶液を50マイクログラム/ミリリットルで調製します。
13、500回gで10分間遠心分離し、LC-MS / MS分析のためにuspernatitantsを収集します。注入量が 5 マイクロリットルの LC-MS 分析では、HPLC 分析と同じグラジエント溶出プログラムを使用します。NMRによる反応中間生成物の特性評価。
daidzin反応から精製された中間生成物の一部を、プロトンおよび炭素13 NMR分光法用のジメチルスルホキシド重水素化6に溶解します。陽子のNMRスペクトルをNMR装置で400メガヘルツで記録します。NMR装置で175メガヘルツのNMRスペクトルを炭素13について記録します。
代表的な結果。全体として、タンパク質の産生と精製、結晶化実験、活性アッセイ、および図1の反応生成物構造の同定を含む複合実験アプローチを設計しました。具体的には、図2の3段階精製クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーにより高純度タンパク質を得ました。
結晶化実験では、図3AからDに示すように、DgpAとDgpB/C錯体の結晶構造をそれぞれ2.7オングストロームと2.1オングストロームの分解能で決定しました。さらに、図3BとCではDgpAがヘキサマー型で自己抑制確認を採用していることを発見しました。これは、図3FのDCPIP還元アッセイを用いて検証されました。次に、図3EのDgpAの基質認識ポケットにおいて、グルコースが主要なアミノ酸と水素結合ネットワークを形成していることを発見しました。これに基づいて、変異体を設計し、図3Jの速度論的パラメータを用いてその基質切断活性を評価しました。
興味深いことに、O-グリコシドフラボノイドとDgpA/B/Cの切断中に、図4AおよびBの中間化合物の形成を観察しました.これらの中間体は、図4CからHのNMRおよびLC-MS分析を通じてC-グリコシドフラボノイドとして同定され、DgpA/B/CがO-グリコシドをC-グリコシドに変換できることを示しました。私たちは、化学とバイオテクノロジーの統合を開拓して、C-グリコシド代謝酵素の構造と機能特性を研究し、これが合理的で実用的な解決策であることを実証しています。このアプローチは、この分野の研究方法論のギャップを埋め、異なる代謝機能を持つ他の遺伝子に容易に適用できます。
したがって、他の腸内微生物機能タンパク質の構造的および機能的特性に関する将来の研究のための新しい参照モデルも提供します。
