Approcci di biologia strutturale e chimica analitica per la caratterizzazione degli enzimi metabolici C-glicosidici nel microbiota intestinale umano. Protocollo. Uno, la produzione e la purificazione delle proteine. Costruzione del vettore di espressione.
Ottenere la sequenza del cluster genico GenBank LC422372.1 da NCBI. Clonare i geni in un vettore pET-28a modificato. Trasformare i plasmidi in cellule competenti per E.coli BL21 DE3.
Successivamente coltivare i batteri in terreno LB con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina a 37 gradi. Aggiungere 0,2 millimoli di IPTG al terreno quando la densità batterica OD600 raggiunge 0,6. Coltiva i batteri a 16 gradi per 16 ore.
Centrifugare la coltura batterica a 4.000 volte g a quattro gradi. Scartare il surnatante e conservare il pellet batterico. Risospendere il pellet batterico nel tampone A. Purificazione delle proteine.
Aggiungere un millimole di PMSF alla risospensione batterica. Lisi la sospensione batterica con un rompicella a ultrasuoni. Centrifugare il lisato batterico a 48.000 volte g per 40 minuti a quattro gradi.
Purificare la proteina nel surnatante utilizzando la colonna NTA per cromatografia di affinità al nichel. Eluire la proteina legata con il tampone B in un gradiente. Raccogli campioni con un elevato assorbimento UV 280 nanometrico e bande proteiche chiare da SDS-PAGE per il passaggio successivo.
Dializzare i campioni con il tampone C.Purificare la proteina dializzata utilizzando una colonna per cromatografia a scambio ionico. Legare la proteina bersaglio alla colonna con il tampone C.Eluire la proteina legata con l'ingrediente tampone D. Purificare la proteina utilizzando una colonna di esclusione dimensionale con Buffer E.Collect campioni di proteine per la fase successiva.
Concentrare i campioni di proteine a 20 milligrammi per millilitro, aliquotarli, congelarli rapidamente con azoto liquido. Conservalo a 80 gradi per un uso futuro. Misura la concentrazione di proteine utilizzando QuickDrop con UV 280 nanometri.
Dicroismo circolare, CD, raccolta dati spettrali. Diluire le proteine a 0,2 milligrammi per millilitro in un tampone PBS in una volta, pH 7,4. Impostare la velocità di scansione dello strumento a 50 nanometri al minuto e la larghezza di banda spettrale a un nanometro.
Raccogli dati spettrali CD nell'intervallo di lunghezze d'onda da 200 a 260 nanometri. Sottrai lo sfondo PBS e prendi il valore medio da tre misurazioni. Due, cristallografia proteica e determinazione strutturata.
Crescita e ottimizzazione dei cristalli proteici. Eseguire lo screening iniziale della cristallizzazione con il metodo sitting-drop utilizzando i kit di cristallizzazione delle proteine su piastre cristalline a 48 pozzetti. Impostare i gradienti di concentrazione del precipitante e delle proteine per ottimizzare la cristallizzazione delle proteine utilizzando il metodo della goccia sospesa.
Trasferire i cristalli in una soluzione di ammollo contenente il tampone serbatoio e i composti target a 16 gradi per 30 minuti dopo la completa crescita. Trasferire i cristalli in una soluzione crioprotettiva contenente tampone di cristallizzazione integrato con glicerolo al 25% e immediatamente conservati in azoto liquido per la raccolta dei dati. Raccolta dati e determinazione strutturata di cristalli proteici.
Raccogliere il set completo di dati di diffrazione dei raggi X alle linee di fascio dell'SSRF dell'NFPS utilizzando lunghezze d'onda incidenti di 0,978 angstrom. Elaborare i dati di diffrazione dei cristalli inizialmente utilizzando il software di elaborazione dei dati cristallografici. Eseguire la fasatura utilizzando un programma di elaborazione automatica dei dati.
Utilizza il software di determinazione della struttura cristallina per il perfezionamento e l'ottimizzazione automatici del modello di struttura. Tre, monitoraggio dell'attività di reazione e determinazione dei parametri cinetici. Monitoraggio dell'attività di DgpA/B/C mediante HPLC.
Assemblare il sistema di reazione di scissione del glicoside C in tampone PBS, pH 7,4, contenente 20 micromoli per millilitro di DgpA/B/C, un millimoli per litro di ione manganese, un millimoli per litro di NAD, 10 millimoli per litro di DTT e 0,1 millimoli per litro di substrato, puerarina, daidzin, genistina. Miscelare accuratamente pipettando e incubare a 37 gradi per otto ore. Aggiungere tre volte la quantità di metanolo al sistema di reazione per terminare la reazione.
Centrifugare la soluzione di reazione a 16.000 volte g per 15 minuti per rimuovere il precipitato. Filtrare il surnatante utilizzando una membrana filtrante da 0,22 micrometri. Esecuzione di analisi HPLC con eluizione a gradiente a una velocità di flusso di un millilitro al minuto, lunghezze d'onda di rilevamento di UV 265 nanometri e un volume di iniezione di 10 microlitri.
Monitoraggio dell'attività di DgpA con saggio 2,6-diclorofenolo indofenolo, DCPIP. Incubare 0,8 millimoli per litro di DCPIP, 50 micromoli per litro di proteine e 10 millimoli per litro di substrato in un tampone PBS una volta, pH 7,4. Dopo 20 ore di reazione, registrare la variazione di assorbanza del DCPIP a 600 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre.
Determinazione del tasso di inibizione del glucosio sulla reazione di scissione del legame C-glicosidico della puerarina. Effettuare la reazione in una sola volta tampone PBS, pH 7,4, a diverse concentrazioni di glucosio nel sistema di reazione come descritto nella sezione 3.1. Eseguire la reazione a 37 gradi per 12 ore.
Eseguire analisi quantitative dei prodotti generati utilizzando l'HPLC. Determinazione dei parametri cinetici. La concentrazione di puerarin è fissata da 0,01 a quattro millimoli per litro, e quella di daidzina e genistina era da 0,01 a due millimoli per litro nella reazione di scissione del glicoside C DgpA/B/C.
Effettuare la reazione a 37 gradi per otto ore secondo il metodo descritto al punto 3.1. Ricavare i parametri cinetici di Km e kcat adattando la velocità di reazione calcolata e la concentrazione del substrato a un modello di Michaelise-Menten in Prism. Quattro, preparazione e rilevamento del prodotto intermedio di reazione.
Preparazione del prodotto intermedio di reazione. Utilizzare daidzina e genistina come substrati per eseguire la reazione secondo i metodi descritti nella sezione 3.1 con un sistema di reazione di 90 millilitri. Purificare il prodotto intermedio utilizzando un'HPLC preparativa con una colonna per cromatografia liquida preparativa.
Essiccare i prodotti intermedi purificati con un concentratore centrifugo sottovuoto per un uso futuro. Caratterizzazione del prodotto intermedio di reazione con LC-MS. Sciogliere una parte dei prodotti intermedi purificati dalle reazioni daidzina e genistina in metanolo per preparare soluzioni di ciascun composto a 50 microgrammi per millilitro.
Centrifugare a 13, 500 volte g per 10 minuti e raccogliere gli ussurnanti per l'analisi LC-MS/MS. Utilizzare lo stesso programma di eluizione a gradiente dell'analisi HPLC per l'analisi LC-MS con un volume di iniezione di cinque microlitri. Caratterizzazione del prodotto intermedio di reazione con NMR.
Sciogliere una parte dei prodotti intermedi purificati dalla reazione daidzina in sei deuterati di dimetilsolfossido per la spettroscopia NMR di protoni e carbonio 13. Registra gli spettri NMR su uno strumento NMR a 400 megahertz per un protone. Registra gli spettri NMR su uno strumento NMR a 175 megahertz per il carbonio 13.
Risultati rappresentativi. Nel complesso, abbiamo progettato un approccio sperimentale combinato che include la produzione e la purificazione delle proteine, gli esperimenti di cristallizzazione, i saggi di attività e l'identificazione delle strutture dei prodotti di reazione nella prima figura. In particolare, abbiamo ottenuto proteine di elevata purezza attraverso una cromatografia di purificazione in tre fasi, una cromatografia a scambio ionico e una cromatografia con filtrazione su gel nella seconda figura.
Negli esperimenti di cristallizzazione, abbiamo determinato le strutture cristalline di DgpA e del complesso DgpB/C con risoluzioni di 2,7 angstrom e 2,1 angstrom, rispettivamente, in figura da 3A a D. Abbiamo inoltre scoperto che il DgpA adotta la conferma auto-inibita nella sua forma esamerica in figura 3B e C, che è stata convalidata utilizzando il saggio di riduzione DCPIP in figura 3F. Successivamente, abbiamo scoperto che il glucosio forma una rete di legami idrogeno con amminoacidi chiave nella tasca di riconoscimento del substrato di DgpA nella figura 3E. Sulla base di ciò, abbiamo progettato mutanti e valutato la loro attività di scissione del substrato utilizzando i parametri cinetici nella figura 3J.
È interessante notare che, durante la scissione dei flavonoidi O-glicosidici e DgpA/B/C, abbiamo osservato la formazione di composti intermedi nella figura 4A e B.Questi intermedi sono stati identificati come flavonoidi C-glicosidici attraverso l'analisi NMR e LC-MS nella figura da 4C a H, indicando che DgpA/B/C può convertire gli O-glicosidi in C-glicosidi. Siamo stati pionieri nell'integrazione di chimica e biotecnologia per studiare la struttura e le caratteristiche funzionali degli enzimi del metabolismo dei glicosidi C, dimostrando che questa è una soluzione ragionevole e pratica. Questo approccio colma le lacune nelle metodologie di ricerca nel campo e può essere facilmente applicato ad altri geni con diverse funzioni metaboliche.
Pertanto, fornisce anche un nuovo modello di riferimento per studi futuri sulle caratteristiche strutturali e funzionali di altre proteine funzionali microbiche intestinali.
