粘膜上皮は、私たちの体の内臓をラインし、外国の粒子をクリアすることによって防御の第一線を提供します。このプロトコルにより、24時間で胚細胞由来粘膜上皮オルガノイドを生成することができる。我々の方法の主な利点は、オルガノイドの表面上の細胞転移の生きた進行を監視できることである。
この開発オルガノイドのための再現性、スケーラブルで迅速なプロトコルは、研究者が粘膜上皮の生物学のための基本的な質問に対処することを可能にします。まず、刺激された雌のカエルから卵子を手動で採取し、体外受精を行うことによってX.Laevis胚を得る。受精胚を2%システインで穏やかな攪拌で脱ゼリーし、約5分間、3分の1のX修飾バースの生理食動物に入る。
ステージ10の最初の兆候が検出されるまで好ましい温度で3分の1のXMBSで胚を培養し、例えば、植生図でのブラストオレの周りの暗い色素細胞の出現など。ステレオスコープの下でヘアツールを使用して、初期段階10に達する胚を選択して収集します。選択した胚を使い捨て可能な移写ピペットでDFAで満たされたペトリ皿に移します。
次に、胚の動物側を破壊することなく、植物側から鋭い鉗子を使用して胚のビテリン膜を除去する。動物のキャップを分離するには、動物側の胚を上に置きます。切除する動物帽の程度を視覚的に推定し、ヘアナイフで縁に沿って最初の切開を行い、ナイフを外側に引っ張って切り取ります。
このプロセスを繰り返して、動物のキャップを切除するための小さな切り傷のチェーンを作成します。中皮前駆体の封入を防ぐために、ヘアナイフを使用して動物キャップの厚層のエッジをトリミングします。動物キャップから深い外因性細胞を分離するには、切除された動物のキャップを、使い捨て可能な移動ピペットでカルシウムとマグネシウムフリーのDFAを充填したペトリ皿に移します。
動物の帽子を上に向けて、他の外植から寛大な距離を維持するように置きます。5~10分待ってから、ステレオスコープの下で外植を監視します。緩んだ深部細胞が暗色色の表面層の端から放出されたら、明るい色の深い外層細胞から表面層を持ち上げ始める。
慎重にエッジから始めて、ヘアナイフで表面的な層を取り外します。その後、できるだけ少ないカルシウムとマグネシウムフリーDFAで深い外発性細胞を収集します。回収した深い外食細胞を、200マイクロリットルのDFAを含む非粘着性PCRチューブに移し、培地を2~3回静かにピペットして移写された細胞を分散させる。
チューブを閉じて、底部に自発的な凝集を誘発するために直立を保ちます。ステレオ顕微鏡で凝集プロセスを監視します。細胞は通常、1時間以内にPCRチューブの底部に集まり、サイズに応じて2〜3時間以内に球状の凝集体に組み立てられます。
粘液性上皮オルガノイドの開発中にライブイメージングまたは薬物検査を行うために、拡大された先端を取り付けた200マイクロリットルピペットを使用して2時間の凝集後の凝集体を収集する。凝集体が培養中の粘膜上皮オルガノイドに発展することを可能にするために、PCRチューブから5時間の凝集後に回収し、DFAで満たされたペトリ皿に移します。凝集体を互いに離して配置して、融合を防ぎます。
室温で培養した24時間以内に、因子を加えずに、分化した上皮の表面を覆う拍動繊毛による成熟粘膜上皮オルガノイドの回転が観察される。カバーガラスをシリコングリースでカスタムミルドアクリルチャンバーに接着し、チャンバーを密封して培養培地の漏れを防ぎ、イメージングチャンバーをDFAで満たして、ガラス底イメージングチャンバーを準備します。鉗子を使用して1つの六角形の透過電子顕微鏡またはTEMグリッドを拾い、グリッドの端に少量のグリースを適用します。
TEM グリッドを撮像チャンバの底面に固定するために軽く押し下げます。凝集体を撮像チャンバーに移し、グリッド内に配置します。チャンバーにDFAを充填し、カバーガラスとグリースで密封します。
粘膜上皮オルガノイド形成の進行に従うために、共焦点顕微鏡を用いて凝集体の時間経過zスタック画像を収集する。粘膜上皮オルガノイドは、初期の胃管ステージX.Laevis胚の多能性前駆体から生成された。オルガノイドは、完全に分化した上皮、粘液分泌性ゴブレット細胞、多分泌細胞および小さな分泌細胞を含むオタマジャクシの表皮と区別がつかない成熟した表皮を有する。
オルガノイドの発達のダイナミクスは、ライブイメージングが続いた。オルガノイド形成の初期段階で出現する上皮化を調べるために、胚は蛍光タグ付きのタイトな接合タンパク質および膜局所性タンパク質で標識された。二重標識により、ZO-1正の密接合形成のシーケンシャルステップをマークし、上皮化中に定量的に分析することができます。
細胞-細胞接着のいくつかの領域は、上皮化の異なる段階でZO-1の穿刺を散乱している。これに対し、他の領域では連続した ZO-1 式が完全に組み立てられています。時間が経つにつれて、パンクタは合体し、細胞分裂中でも形態を維持する連続したタイトなジャンクションを形成するために接続します。
タイトな接合が成熟すると、細胞はオルガノイドの有端面に沿って表面に動的に出入りします。多スケール解析は、分化オルガノイドの表面上で細胞を時空間的に追跡することによって可能である。このプロトコルを試みるとき、分離動物の帽子の暗色顔面を上に置き、ステレオスコープの下で監視することを忘れないでください。
カルシウム/マグネシウムフリーDFA培地において適切なタイミングで動物キャップの表面層を分離することが重要です。この簡単なプロトコルは、動的細胞の挙動だけでなく、粘液性上皮を調節する分子および物理的メカニズムを研究するための便利な方法を提供します。
