Mukociliale Epithel linien innere Organe unseres Körpers und bietet die erste Verteidigungslinie durch die Beseitigung von Fremdpartikeln. Dieses Protokoll ermöglicht es, embryonale Zell abgeleitete mukociliäre epitheliale Organoid in 24 Stunden zu erzeugen. Der Hauptvorteil unserer Methode ist, dass wir das live fortschreitende Fortschreiten von Zellübergängen auf der Oberfläche von Organoiden überwachen können.
Dieses reproduzierbare, skalierbare und schnelle Protokoll für das sich entwickelnde Organoid wird es den Forschern ermöglichen, grundlegende Fragen für die Biologie des mukociliären Epithels zu beantworten. Zunächst erhalten Sie X.Laevis-Embryonen, indem Sie eier von stimulierten weiblichen Fröschen manuell sammeln und eine In-vitro-Fertilisation durchführen. Entgelee die befruchteten Embryonen mit sanfter Erregung in 2%Cystein, in einem Drittel X-modifizierte Barth-Saline für etwa fünf Minuten.
Kultur die Embryonen in einem Drittel XMBS bei der bevorzugten Temperatur, bis die ersten Anzeichen von Stadium 10 erkannt werden, wie das Auftreten von dunkelpigmentierten Zellen um das Blastopor bei der gemüselichen Ansicht. Wählen und sammeln Sie Embryonen, wie sie früh Stufe 10 mit Haarwerkzeugen unter einem Stereoskop erreichen. Übertragen Sie die ausgewählten Embryonen in eine MIT DFA gefüllte Petrischale mit einer Einweg-Transferpipette.
Entfernen Sie dann die Vitelline-Membran der Embryonen mit scharfen Zangen von der gemüseseitigen Seite, ohne die tierische Seite des Embryos zu stören. Um die Tierkappe zu isolieren, positionieren Sie die tierische Seite des Embryos nach oben. Schätzen Sie visuell das Ausmaß der zu verbrauchenden Tierkappe und machen Sie den ersten Schnitt entlang der Kante mit einem Haarmesser, das Messer nach außen zu ziehen, um den Schnitt zu machen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine Kette von kleinen Schnitten zu erstellen, um die Tierkappe zu verbrauchen. Trimmen Sie die dickschichtige Kante der Tierkappe mit einem Haarmesser, um die Aufnahme von Mesoderm-Vorläufern zu verhindern. Um tiefe Ektodermzellen von der Tierkappe zu trennen, übertragen Sie die ausgeschnittenen Tierkappen auf eine mit Kalzium und Magnesium gefüllte Petrischale mit einer Einweg-Transferpipette.
Positionieren Sie die Tierkappen, um die Tierseite nach oben zu stellen, wobei sie einen großzügigen Abstand zu anderen Expflanzen halten. Warten Sie fünf bis zehn Minuten, und überwachen Sie dann die Explanten unter einem Stereoskop. Sobald die gelockerten tiefen Zellen vom Rand der dunkelpigmentierten oberflächlichen Schicht freigesetzt wurden, beginnen Sie, die oberflächliche Schicht von den hellen tiefen Ektodermzellen wegzuheben.
Lösen Sie die oberflächliche Schicht vorsichtig mit einem Haarmesser, beginnend am Rand. Dann sammeln Sie die tiefen Ektodermzellen mit so wenig Kalzium und Magnesium-freiem DFA wie möglich. Übertragen Sie gesammelte tiefe Ektodermzellen auf nicht klebende PCR-Röhren, die 200 Mikroliter DFA enthalten, und pipetten Sie das Medium zwei- bis dreimal, um die übertragenen Zellen zu dispergieren.
Schließen Sie die Rohre und halten Sie sie aufrecht, um eine spontane Aggregation am Boden zu induzieren. Überwachen Sie den Aggregationsprozess unter einem Stereomikroskop. Zellen sammeln sich in der Regel innerhalb einer Stunde am boden des PCR-Rohrs und fügen sich je nach Größe innerhalb von zwei bis drei Stunden zu kugelförmigen Aggregaten zusammen.
Um Live-Bildgebung oder Arzneimitteltests während der Entwicklung der mukociliären Epithel-Organoide durchzuführen, sammeln Sie Aggregate nach der Aggregation nach der Aggregation zwei Stunden nach der Aggregation mit einer 200-Mikroliter-Pipette, die mit vergrößerten Spitzen ausgestattet ist. Damit sich Aggregate in der Kultur zu mukociliären Epithelorganoiden entwickeln können, sammeln Sie sie nach der Aggregation fünf Stunden lang aus dem PCR-Rohr und übertragen sie in eine MIT DFA gefüllte Petrischale. Positionieren Sie die Aggregate weit voneinander entfernt, um eine Verschmelzung zu verhindern.
Innerhalb von 24 Stunden Kultur bei Raumtemperatur, ohne zusätzliche Faktoren, können reife mukociliäre Epithel-Organoide beobachtet werden, die sich aufgrund der schlagenden Zilien drehen, die die Oberfläche des differenzierten Epithels bedeckt. Bereiten Sie eine Glasboden-Bildgebungskammer vor, indem Sie ein Deckglas an eine benutzerdefinierte gefräste Acrylkammer mit Siliziumfett kleben, die Kammer fest versiegeln, um ein Auslaufen der Kulturmedien zu verhindern, und dann die Bildkammer mit DFA füllen. Nehmen Sie ein sechseckige Transmissionselektronenmikroskopie oder TEM-Raster mit Zangen auf und wenden Sie eine winzige Menge Fett an den Rand des Gitters an.
Drücken Sie leicht nach unten, um das TEM-Gitter an der Unterseite der Bildkammer zu befestigen. Übertragen Sie die Aggregate in die Bildkammer und positionieren Sie sie innerhalb des Rasters. Füllen Sie die Kammer mit DFA und versiegeln Sie sie mit einem Abdeckglas und Fett.
Um das Fortschreiten der mukociliären epithelialen Organoidbildung zu verfolgen, sammeln Sie zeitverstrichene Z-Stack-Bilder von Aggregaten mit einem konfokalen Mikroskop. Mukociliäre Epithel-Organoide wurden aus multipotenten Vorläufern des frühen Gastorulastadiums X.Laevis-Embryonen erzeugt. Die Organoide haben eine reife Epidermis, die nicht von der einer Kaulquappe zu unterscheiden ist, einschließlich eines vollständig differenzierten Epithels, Schleim, der Kelchzellen, multizerilizierte Zellen und kleine Sekretolezellen absondert.
Auf die Dynamik der organoiden Entwicklung folgte eine Live-Bildgebung. Um die Epithelisierung zu untersuchen, die im frühen Stadium der Organoidbildung entsteht, wurden die Embryonen mit fluoreszierend getaggten engen Knotenproteinen und Membranlokalisierungsproteinen gekennzeichnet. Mit der doppelten Beschriftung können die sequenziellen Schritte der ZO-1-positiven engen Knotenbildung während der Epithelisierung markiert und quantitativ analysiert werden.
Einige Regionen der Zellzelladhäsion haben Punktzeichen von ZO-1 in verschiedenen Stadien der Epithelisierung verstreut. Im Gegensatz dazu haben andere Bereiche einen vollständig zusammenhängenden ZO-1-Ausdruck. Im Laufe der Zeit verschmelzen die Puncta und verbinden sich zu zusammenhängenden engen Knoten, die ihre Morphologie auch während der Zellteilung beibehalten.
Wenn die engen Knoten reifen, bewegen sich Zellen dynamisch in und aus der Oberfläche entlang der apikalen Ebenen der Organoide. Multiskalenanalysen sind möglich, indem Zellen räumlich-zeitlich auf der Oberfläche differenzierender Organoide verfolgt werden. Denken Sie beim Versuch dieses Protokolls daran, die dunkelpigmentierte Seite der isolierten Tierkappe nach oben zu stellen und sie unter ein Stereoskop zu stellen.
Es ist wichtig, die oberflächliche Schicht der Tierkappe zum richtigen Zeitpunkt in Kalzium/Magnesium-freien DFA-Medien zu trennen. Dieses einfache Protokoll bietet praktische Möglichkeiten, dynamisches Zellverhalten sowie die molekularen und physikalischen Mechanismen zu untersuchen, die das mukociliäre Epithel regulieren.
