Xenopus胚胎细胞的粘膜异体器官:生成、培养和高分辨率实时成像

粘膜上皮线内脏器官我们的身体，并提供第一线通过清除异物颗粒。该协议使得在24小时内产生胚胎细胞衍生的上皮器官成为可能。我们方法的主要优点是，我们可以监测细胞在器官表面的活进展。

这种可重复的、可扩展的、快速的器官发育方案将使研究人员能够解决粘膜上皮生物学的基本问题。首先，通过手动收集受刺激的雌性青蛙的卵子并进行体外受精来获得X.Laevis胚胎。在三分之一X修饰的巴特盐水中，用2%半胱氨酸温和搅拌的受精胚胎去搅拌约5分钟。

在首选温度下以三分之一 XMBS 培养胚胎，直到检测到第 10 阶段的第一个迹象，例如在植物视图处的胚胎周围出现深色色素细胞。选择和收集胚胎，因为他们到达早期阶段10使用头发工具下的立体镜。用一次性转移移液器将选定的胚胎移植到充满 DFA 的培养皿中。

然后，用锋利的钳子从植物方面取出胚胎的葡萄线膜，而不会破坏胚胎的动物侧。要分离动物帽，请将胚胎的动物侧向上放置。目视估计要切除的动物帽的程度，用发刀沿着边缘进行第一个切口，向外拉刀进行切割。

重复此过程，创建一系列小切口，以切除动物帽。使用发刀修剪动物帽的厚层边缘，以防止包括中皮前体。要将深层异体细胞与动物帽分离，请将切除的动物帽转移到含有钙和无镁的 DFA 的 Petri 盘中，并配有一次性转移移液器。

将动物帽朝向动物的一面，与其他外植动物保持宽阔的距离。等待五到十分钟，然后在立体镜下监控外植。一旦松动的深细胞从暗色素表面层的边缘释放，开始将浅层从浅色深皮细胞中抬离。

小心地用发刀分离表面层，从边缘开始。然后收集深皮细胞与尽可能少的钙和无镁DFA。将收集的深层异体细胞转移到含有200微升DFA的非粘性PCR管中，并轻轻移液介质两到三次，以分散转移的细胞。

关闭管子并保持直立，以诱导底部的自发聚集。在立体显微镜下监控聚合过程。细胞通常在一小时内聚集在PCR管的底部，并在两到三个小时内组装成球形聚集体，具体取决于大小。

在粘膜上皮器官的发育过程中进行活体成像或药物测试，使用装有放大尖端的 200 微升移液器在聚合后两小时采集集料。为了让聚合体在培养中发展成粘液上皮器官，在聚合后五小时从PCR管中收集它们，并转移到充满DFA的培养皿中。将聚合位置彼此相距甚远，以防止引团。

在室温下培养的24小时内，没有任何添加因素，成熟的粘膜上皮器官可以观察到旋转，由于跳动的西莉亚覆盖分化上皮的表面。通过将盖玻璃粘合到带硅润滑脂的定制磨碎丙烯酸腔室中，将密封室以防止培养介质泄漏，然后用 DFA 填充成像室，从而准备玻璃底成像室。使用钳子拾取一个六角透射电子显微镜或 TEM 网格，并在网格边缘涂抹少量润滑脂。

轻轻按下，将 TEM 网格固定到成像室的底部。将聚合转移到成像室，并将它们定位在网格中。用 DFA 填充腔室，用盖玻璃和润滑脂密封。

要跟踪粘膜上皮器官形成的进展，使用共体显微镜收集聚合的时圈 z 堆栈图像。粘膜上皮器官是由早期胃膜阶段X.Laevis胚胎的多能祖体产生的。器官具有成熟的表皮，与小虫无法区分，包括完全分化的上皮、粘液分泌杯状细胞、多细胞和小分泌细胞。

器官发育的动力学之后是活成像。为了检查在器官形成的早期阶段出现的上皮化，胚胎被标记为荧光标记的紧密结蛋白和膜本地化蛋白。通过双标记，可以在上皮化过程中标记和定量分析ZO-1正紧结形成的连续步数。

细胞粘附的一些区域在上皮化的不同阶段分散了ZO-1的庞塔。相比之下，其他区域已完全组装连续的 ZO-1 表达式。随着时间的推移，puncta会汇并连接形成连续的紧密交汇点，即使在细胞分裂期间，这些结也保持其形态。

当紧密的结点成熟时，细胞沿着器官的平面动态地移出表面。通过跟踪区分器官表面的细胞，可以进行多尺度分析。尝试此协议时，请记住将隔离动物帽的深色侧朝上，并监控其下立体镜。

在无钙/镁的 DFA 介质中，在正确的时间下分离动物帽的表层至关重要。这个简单的协议提供了研究动态细胞行为以及调节粘膜上皮的分子和物理机制的方便方法。