幼虫は、高い時間的および空間分解能で10時間以上の無傷のショウジョウバ幼虫の連続的なライブイメージングを可能にする最初の方法です。この方法は、幼虫末梢感覚ニューロンの動的な細胞プロセスを明らかにし、幼虫の体壁の近くで起こる他の多くの細胞プロセスを研究するために使用されます。この方法は使いやすく、幼虫のサイズに関する制限は少ない。
6~9匹の幼虫を同時にイメージングチャンバーに取り付けることができ、実験が可能になります。PDMS立方体の撮像室は最低の費用で製造することができ、再利用可能である。この方法は、ショウジョウバ幼虫樹状承認ニューロンを用いた樹状突起発生および樹状変性のメカニズムを研究するのに特に有用である。
同じニューロンを何時間も画像化できることは、樹状パターンの長期的な世界的変化が個々の分岐レベルでの短期的な行動からどのように生じるかを明らかにすることができる。幼虫の大きさに合ったPDMS立方体を使用すると、幼虫を固定化する成功率が高まります。トラブルシューティングのセクションで、より役立つテープをご覧ください。
機械工場からアルミブロックを作った後、UV接着剤で長いカバースリップを使用して金属フレームの底部を密封します。30秒間、ハンドヘルドUVランプを使用してUVの手がかりを治してください。包装テープの層を、長方形のペトリ皿または丸い細胞培養プレートの内面に取り付けます。
2番目の星内幼虫に1つの層、初期の3番目の星内幼虫のための2つの層、または後期3番目の星内幼虫のための3つの層を使用してください。カミソリの刃で特定の幅のトリップにテープをカットし、1層テープの場合は1.5ミリメートル、2層または3層テープの場合は2ミリメートルに切ります。2つのストリップの間に少なくとも5ミリメートルのスペースを残します。
スペースをカバーするテープ・レイヤーを取り外します。粘着テープを使用してプレートの内面からほこりを取り除きます。その後、金型は使用する準備ができています。
PDMSミックスを調製するには、7グラムのPDMSベースを0.7グラムの硬化剤に十分に混ぜ合わせます。容器を真空デシケーターに少なくとも15分間置き、混合物から空気を取り除きます。約5.5グラムのPDMS混合物を金型にゆっくりと注ぎ、1〜2ミリメートルの厚さに達します。
PDMS混合物を真空デシケーターに再び15分間置き、残りの気泡を混合物から除去する。ピペットチップで最後のいくつかの泡を破ります。65°Cの熱インキュベーターで平らな表面にPDMSを2時間硬化させます。
次に、カミソリの刃を使用して、金型の端に沿って硬化したPDMSを緩め、金型から取り外します。PDMSを室温で2枚の大きな粘着テープの間に保管します。早期および後期の3番目の星内幼虫の場合は、テープストリップによって作成された溝を立方体の長い側の中央に配置して、PDMSを8に2mmずつ切ります。
2番目の星次幼虫の場合は、立方体を1ミリメートルずつ8に切ります。取り付け用の上部カバースリップを準備するには、幼虫のサイズに一致する溝を持つ6つのPDMS立方体を選択します。粘着テープでPDMSの表面からほこりを取り除きます。
後でPDMS立方体を固定するために22×50ミリメートルの長いカバースリップに12×5ミリメートルのサイズで両面テープの4枚を取り付けます。両面テープの2枚の間のスペースをPDMS溝の幅と同じに調整します。各PDMS立方体の溝にUV接着剤の小さな滴を適用し、カバースリップの両面テープの間のスペースにUV接着剤の6つの小さな滴を追加します。
幼虫を取り付けるための準備をするには、一対の鉗子を使用して、水中の幼虫を洗浄して体表面から食物を除去する。清潔な幼虫を湿らせたティッシュペーパーの小片に蓋をせずに小さなペトリ皿に置き、小さなペトリ皿を乾燥したティッシュペーパーを含む大きなペトリ皿に入れます。化学フードでは、プラスチックトランスファピペットを使用して、160〜240マイクロリットルのイオブルランを乾燥したティッシュペーパーに塗布し、大きなペトリ皿の蓋を閉めます。
幼虫を監視しながら2〜3分待ちます。彼らの口のフックが動かなくなったら、大きなペトリ皿から幼虫を取り出します。固定化した幼虫をカバースリップの両面テープの間のUV接着剤の上に置き、後側キューティクルをカバースリップに向けます。
各幼虫をPDMSブロックで覆い、幼虫の幹をPDMSの溝に収めます。PDMS溝の外に幼虫の頭部と尾部を残します。接着剤で幼虫のスパイクルをブロックしないでください。
PDMSブロックの端部を溝に力を加えずに両面テープに押し込みます。幼虫の尾をそっと引っ張ってPDMSの下のキューティクルを平らにします。安全メガネを着用し、ハンドヘルドUVランプを使用して、高い設定で4分間UV接着剤を硬化させます。
カバースリップを逆さまに反転し、UVランプを使用してさらに4分間UV接着剤を硬化させます。15×30ミリメートルのサイズの小さなレンズ用紙を撮像室の底に置きます。20~30マイクロリットルの水で紙を湿らせ。
幼虫がチャンバーの内側に向かるように、カバースリップをチャンバーに置きます。カバースリップの両端を金属表面に接着するには、UV接着剤を使用します。幼虫の後側は共焦点顕微鏡の下でイメージ作成する準備ができている。
イメージング後、レンズペーパーを使用して上部カバースリップのオイルを取り除きます。カバースリップと金属フレームの間のスペースにカミソリの刃で切り取って、金属フレームから上部カバースリップを取り外します。イメージの部屋は再利用の準備ができている。
PDMS立方体を鉗子で上部カバースリップから取り外します。粘着テープにPDMS立方体を転がして、糊残りやほこりを取り除きます。PDMSの立方体は再利用の準備ができています。
このプロトコルでは、ショウジョウバエ幼虫を10時間以上固定化し、連続的なイメージングを行った。この図は、チャンバーに取り付けられた6つの後期3番目の星内幼虫を示しています。幼虫の幹は、頭と尾が自由に動いている間に固定されました。
ここでは、クラス4のDAニューロンをモデルとして用いた神経樹状変性と神経変性の研究におけるLarvaSPAの応用を示す。この方法で幼虫を正常に固定化するには、口のフックが動かなくなったら幼虫をイソフルランにさらし、幼虫が完全に目を覚ます前に紫外線接着剤を治すことは重要です。樹状突起変性および再生を研究するために、幼虫がイメージングチャンバーに固定化されたときにレーザー傷害を行うことができる。
LarvaSPAは、肝細胞プロテオグリカンのような表皮細胞の内皮細胞に動的に成長する樹状突起がいかに不安定であるか、レーザー損傷後に変性樹状突起にホスファチジルセリンがどのように露出しているかを理解するのに役立ちました。UVランプを使用しながら、安全メガネで目を保護します。イオブルランを使用して幼虫をノックアウトすることは、ヒュームフードで行われるべきです。
