اليرقات هي الطريقة الأولى التي تسمح للتصوير الحي المستمر ليرقات الدوزوفيليا السليمة لأكثر من 10 ساعات مع ارتفاع دقة الزمان والمكان. يتم استخدام هذه الطريقة للكشف عن العمليات الخلوية الديناميكية للخلايا العصبية الحسية الطرفية اليرقات ودراسة العديد من العمليات الخلوية الأخرى التي تحدث بالقرب من جدار جسم اليرقة. هذه الطريقة سهلة الاستخدام وأقل محدودية على حجم اليرقة.
يمكن تركيب ست إلى تسع يرقات في غرفة التصوير في نفس الوقت ، مما يجعل التجربة ممكنة. يمكن تصنيع غرفة التصوير في وحدات الـPMS cuboids بأقل تكلفة وقابلة لإعادة الاستخدام. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة آليات التنمية dendrite والانحطاط التشعب باستخدام الخلايا العصبية التخويل اليرقات drosophila.
يمكن أن تكشف القدرة على تصوير نفس الخلايا العصبية لساعات عن مدى التغيرات العالمية الطويلة في الأنماط التشعبية التي تنشأ من السلوكيات قصيرة الأجل على مستوى الفرع الفردي. سيؤدي استخدام التكعيبات PDMS التي تتطابق مع أحجام اليرقات إلى زيادة معدل نجاح اليرقات المُشلّة. الرجاء العثور على المزيد من الأشرطة المفيدة في قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
بعد بناء كتلة الألومنيوم من متجر آلة، وختم الجزء السفلي من الإطار المعدني باستخدام زلة غطاء طويل مع الغراء الأشعة فوق البنفسجية. علاج دليل الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة لمدة 30 ثانية. إرفاق طبقات من شريط التعبئة والتغليف إلى السطح الداخلي لطبق بيتري مستطيلة أو لوحة ثقافة الخلية جولة.
استخدم طبقة واحدة لليرقات الثانية في النجوم، أو طبقتين لليرقات الثالثة المبكرة في النجوم، أو ثلاث طبقات ليرقات الثلث المتأخرة في النجوم. قطع الشريط إلى رحلات من عرض معين مع شفرة الحلاقة، 1.5 ملليمتر لشريط طبقة واحدة واثنين ملليمترات لطبقتين أو ثلاثة طبقة الشريط. اترك على الأقل مساحة خمسة ملليمترات بين الشريطين.
إزالة طبقات الشريط التي تغطي الفضاء. إزالة الغبار من السطح الداخلي للصفيح باستخدام شريط لاصق. بعد ذلك، القالب جاهز للاستخدام.
لإعداد مزيج PDMS، مزيج سبعة غرامات قاعدة PDMS في 0.7 غرام من وكيل علاج بدقة في حاوية صغيرة. ضع الحاوية في جهاز التفريغ لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة الهواء من الخليط. صب ببطء حوالي 5.5 غرام خليط PDMS على القالب للوصول إلى سمك ملليمتر واحد إلى اثنين.
ضع خليط PDMS في الخليط فراغ مرة أخرى لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة فقاعات الهواء المتبقية من الخليط. كسر فقاعات القليلة الماضية مع طرف ماصة. علاج PDMS على سطح مستو في حاضنة الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة لتخفيف PDMS المعالجة على طول حافة القالب وفصله عن القالب. تخزين PDMS بين قطعتين من شريط لاصق كبير في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لليرقات الثالثة المبكرة والمتأخرة في النجوم ، قطع PDMS إلى ثمانية بمقدار اثنين بمقدار ملليمتر واحد من التكعيب عن طريق وضع الأخدود الذي تم إنشاؤه بواسطة شريط الشريط في وسط الجانب الطويل من التكعيب.
بالنسبة لليرقات الثانية في النجوم ، قطع التكعيب إلى ثمانية في واحد في ملليمتر واحد. لإعداد زلة الغطاء العلوي للتركيب ، اختر ستة مكعبات PDMS مع أخاغر مطابقة لأحجام اليرقات. إزالة الغبار من سطح PDMS مع شريط لاصق.
نعلق أربع قطع من الشريط من جانبين في حجم 12 في خمسة ملليمترات على زلة غطاء طويل من 22 في 50 ملليمتر لتحديد التكعيب PDMS في وقت لاحق. ضبط المسافات بين قطعتين من الشريط على الوجهين إلى نفس عرض الأخدود PDMS. تطبيق قطرة صغيرة من الغراء الأشعة فوق البنفسجية في الأخدود من كل كوبي PDMS وإضافة ست قطرات صغيرة من الغراء الأشعة فوق البنفسجية في الفضاء بين الأشرطة من جانبين على زلة الغطاء.
لإعداد اليرقات للتركيب ، باستخدام زوج من ملقط ، قم بتنظيف اليرقات في الماء لإزالة الطعام من سطح الجسم. ضع اليرقات النظيفة على قطعة صغيرة من ورق الأنسجة المبلل في طبق بيتري صغير بدون غطاء ووضع طبق بيتري الصغير في طبق بيتري كبير يحتوي على قطعة من ورق الأنسجة الجافة. في غطاء محرك السيارة الكيميائي، استخدم ماص نقل البلاستيك لتطبيق 160 إلى 240 ميكرولترات من الأيزوفلوران على ورق الأنسجة الجافة وإغلاق غطاء طبق بيتري الكبير.
انتظر من دقيقتين إلى ثلاث دقائق أثناء مراقبة اليرقات. بمجرد أن تتوقف خطاطيف الفم عن الحركة ، أخرج اليرقات من طبق بيتري الكبير. ضع اليرقات المُشلّة على الغراء فوق البنفسجي بين الأشرطة المزدوجة على زلة الغلاف مع بشرة الظهر التي تواجه زلة الغطاء.
غطي كل يرقة بغطاء PDMS وتناسب جذع اليرقة في أخدود PDMS. اترك الرأس وذيل اليرقة خارج أخدود PDMS. تجنب منع الأبراج من اليرقة من الغراء.
اضغط لأسفل على نهايات كتلة PDMS على الشريط مزدوج الوجه دون تطبيق القوة على الأخدود. سحب بلطف على ذيل اليرقة لتسطيح بشرة تحت PDMS. ارتداء نظارات السلامة واستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة لعلاج الغراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة أربع دقائق على الإعداد عالية.
الوجه الغطاء تنزلق رأسا على عقب واستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية لعلاج الغراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة أربع دقائق أخرى. ضع قطعة صغيرة من ورق العدسة بحجم 15 في 30 ملليمتر في قاع غرفة التصوير. ترطيب الورق مع 20 إلى 30 ميكرولترتر من الماء.
ضع زلة الغطاء على الغرفة بحيث تواجه اليرقات داخل الغرفة. استخدام الغراء الأشعة فوق البنفسجية للتمسك طرفي زلة الغطاء إلى السطح المعدني. الجانب الظهري لليرقات جاهز للتصوير تحت مجهر مشترك.
بعد التصوير، قم بإزالة الزيت على زلة الغطاء العلوي باستخدام ورق العدسة. فصل زلة الغطاء العلوي من الإطار المعدني عن طريق قطع في الفضاء بين زلة الغطاء والإطار المعدني مع شفرة حلاقة. غرفة التصوير جاهزة لإعادة الاستخدام.
فصل التكعيب PDMS من زلة الغطاء العلوي مع ملقط. لفة التكعيبات PDMS على شريط لزج لإزالة بقايا الغراء والغبار. التكعيب PDMS جاهزة لإعادة الاستخدام.
في هذا البروتوكول ، تم شل يرقات الدوزوفيا لمدة أطول من 10 ساعات للتصوير المستمر. يُظهر هذا الرقم ست يرقات متأخرة من الدرجة الثالثة مثبتة في الغرفة. تم إصلاح جذوع اليرقات بينما كانت رؤوسها وذيولها حرة في التحرك.
هنا، ونحن نبرهن على تطبيق LarvaSPA في دراسة ديناميات dendrite العصبية وانحطاط التشعب باستخدام الخلايا العصبية DA فئة أربعة كنموذج. لشل حركة اليرقات بنجاح باستخدام هذه الطريقة ، من المهم التوقف عن تعريض اليرقات لisoflurane بمجرد توقف خطاطيف الفم عن الحركة وعلاج الغراء فوق البنفسجي قبل أن تستيقظ اليرقات تمامًا. لدراسة انحطاط التشعب والتجدد ، يمكن إجراء إصابة الليزر عندما يتم شل حركة اليرقات في غرفة التصوير.
وقد ساعدتنا اليرقات على فهم كيف تفشل التشعبات المتنامية الديناميكية في اضمحلال الخلايا الجلدية مثل في بروتيوغليكان الخلايا الكبدية وكيف يتعرض فوسفاتيديلسيرين على dendrites المنحنية المنحنية المنحطة بعد إصابة الليزر. حماية العينين بنظارات السلامة أثناء استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. وينبغي أن يتم ضرب اليرقات باستخدام ايزوفلوران في غطاء الدخان.
