私たちの培養システムは、腫瘍間質相互作用に応答して肺扁平上皮癌細胞の表皮形成性を捕捉し、これらの相互作用が肺扁平上皮癌の進行中の腫瘍形態を調節する方法を捉える。私たちのシステムの主な利点は、悪性細胞の可塑性を維持しながら、3Dコンテキストで肺扁平上皮細胞生物学をモデル化する能力です。この3Dの共培養は、腫瘍間質細胞相互作用を調査するためのユニークなシステムを提供し、肺扁平上皮癌細胞および癌関連線維芽細胞の薬物治療への応答を監視するために適応することができる。
まず、一晩4度の冷蔵庫で基膜マトリックスのバイアルを解凍します。2ミリリットルのプラスチックピペットとチップをマイナス20度で一晩冷やします。翌日、TUM622細胞、HEPESバッファー、トリプシン/EDTA、トリプシン中和バッファーを37°Cの水浴で解離するために使用される試薬を温めます。
解凍した基膜マトリックスを冷蔵庫から取り出し、バイアルを氷の上に置きます。氷の上に置かれた金属プラットフォームクーラーのティッシュ培養プレートを冷やします。金属冷却ラックの上に遠心管を氷の上に置きます。
準備するウェルの数と各ウェル内の細胞の濃度に基づいて必要な細胞の量を計算します。TUM622細胞懸濁液を冷却された遠心管に移し、吊り下げバケット遠心分離機で300倍gで5分間スピンダウンします。濾過されていない先端に取り付けられた吸引ピペットを使用して、上清を慎重に吸引し、約200マイクロリットルの培地をチューブに残します。
チューブの側面を軽くタップしてペレットを取り外し、解き放ち、冷却ラックに戻します。2ミリリットルのプレクールピペットを使用して、氷の上にマトリックスを数回上下にピペットで軽く混ぜます。この手順の間に気泡がマトリックスに導入されないように、均一かつ適度な速度でピペット。
マトリックス1.1ミリリットルを各遠心管に移します。予め冷却された先端を使用して、各チューブのマトリックスを上下に約10回ピペットし、均一な細胞懸濁液を作る。310マイクロリットルのセルマトリックス懸濁液を、予め冷却された24ウェルプレートの各ウェルに移します。
プレート表面に90度の角度でピペットを置き、ウェルの中央にサスペンションを追加します。サスペンションは広がり、井戸全体をカバーします。下流の免疫蛍光分析を容易にするために、60マイクロリットルの細胞マトリックス懸濁液を2ウェルチャンバースライドのウェルセンターに移します。
これにより、行列は、はるかに小さい体積でドーム状の構造を形成することができます。プレートとチャンバースライドを組織培養インキュベーターに戻し、30分間インキュベートしてマトリックスを固めます。その後、プレートを調べ、光顕微鏡下でスライドさせて、単一の細胞がマトリックス内に均等に分布していることを確認します。
プレートの各ウェルに完全な培地を1ミリリットル、チャンバースライドの各ウェルに3D培養培地1.5ミリリットルを加え、インキュベーターに戻します。先に説明したようにTUM622とCAFの細胞懸濁液を調製した後、10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルーと混合して、CAF細胞密度を計る。ヘモサイトメーターの2つのチャンバーのそれぞれに10マイクロリットルの混合物を加え、細胞密度を数え、計算します。
TUM622細胞とキャフを基部膜マトリックスに共存させるために、まず、細胞密度情報に基づいて、メッキに使用される細胞の所望の数を計算する。CAFはTUM622細胞の2:1の比率でシードされます。TUM622sの計算された容積およびCAF細胞懸濁液を同じ遠心管に移す。
スピンダウンし、すべての媒体を吸引します。24ウェルプレートの各ウェルに混合物の基部膜マトリックスおよびプレート310マイクロリットルで再懸濁する。免疫蛍光の場合、前に説明したように、TUM622およびCAF混合物の60マイクロリットルをチャンバースライドに移す。
基膜マトリックスに重ね合ったCAFを有するTUM622を共培養するには、先に述べたようにTUM622単培養を最初に設定し、CAF懸濁液の数を遠心管に2倍に移し、室温で5分間300倍gでスピンダウンする。上清を吸引し、培養培地中のCAFSを再懸濁し、培養培地中で再懸濁したCAF細胞の数を、埋め込まれたTUM622細胞を含む各ウェルに2倍の数の培養液を移す。2D培養における典型的なTUM622細胞は大きな核で丸められ、CAFsは平坦で細長い。
3D培養で播種した単一のTUM622細胞は、埋め込まれたときにアシナ様形態を有するオルガノイドを形成することができた。5日目から7日目の間に、内腔がアシナ様構造で明らかになり、その後中空のままであった。各アシヌスは、中空腔を囲む細胞の単層から構成され、生体内の肺上皮と同様の適切な円形状の基底極性を示した。
これらの起様構造は過形成的であり、細胞外マトリックスが完全に崩壊する24日前まで成長し続けた。TUM622-CAFの共培養物では、重ね合うか、または共存し、CAFの存在は形成されるスフェロイドの数およびサイズを大幅に増強した。興味深いことに、TUM622 aciniがCAFと近接すると、彼らはアキニを侵襲的になり、CFに向かって移動するように誘導し、涙のような構造を形成した。
アシナル状構造の強固な形成を確実にするためには、細胞を埋め込むプロセス全体の間に、その液体形態で基部膜マトリックスを維持することが重要です。TUM622オルガノイドは、免疫蛍光、免疫組織化学、フローサイトメトリー、RNAおよびタンパク質抽出を含むがこれらに限定されない様々な下流分析に使用でき、また、薬物スクリーニングのために改変することができる。このシステムをプラットフォームとして使用すると、腫瘍微小環境における細胞外因性変化と同様に、腫瘍細胞内組み込みがどのように腫瘍上皮アーキテクチャおよび癌腫形成に影響を及ぼすかを調べることができます。
