מערכת התרבות שלנו לוכדת את הפלסטיות הפנוטיפית של תאי קרצינומה של תאי קשקש ריאות בתגובה לאינטראקציות גידול-סטרומה וכיצד אינטראקציות אלה לווסת מורפולוגיה הגידול במהלך התקדמות קרצינומה של תאים קשקשיים ריאות. היתרון העיקרי של המערכת שלנו הוא היכולת שלה מודל ביולוגיה של תאים מים ריאות בהקשר 3D תוך שמירה על הפלסטיות של התאים הממאירים. coculture 3D זה מספק מערכת ייחודית לחקור אינטראקציות תאים סרטניים-סטרומה והוא יכול להיות מותאם כדי לפקח על התגובות של תאי קרצינומה של תאים קשקשיים ריאות פיברובלסטים הקשורים לסרטן לטיפול תרופתי.
כדי להתחיל, להפשיר בקבוקונים של מטריצת קרום מרתף במקרר ארבע מעלות צלזיוס לילה. מצננים פיפטיות פלסטיק שני מיליליטר וטיפים במינוס 20 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, לחמם את הריאגנטים המשמשים לנטרול תאי TUM622, חיץ HEPES, טריפסין / EDTA, ומאגר נטרול טריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
מוציאים את מטריצת קרום המרתף המופשרת מהמקרר ומכניסים את הבקבוקון לקרח. לקרר את לוחות תרבות הרקמה על מצנן פלטפורמת מתכת להציב על קרח. מניחים צינורות צנטריפוגה על מתלה קירור מתכת על קרח.
לחשב את כמות התאים הדרושים בהתבסס על מספר בארות ואת הריכוז של תאים בכל באר כדי להיות מוכן. להעביר TUM622 תא השעיה לתוך צינור צנטריפוגה מקורר להסתובב למטה ב 300 פעמים g בצנטריפוגה דלי תלוי בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. עם פיפטה שאפתנית המחוברת לקצה לא מסונן, שאפו את העל-טבעי בזהירות, והשאירו כ-200 מיקרוליטרים של המדיום בצינור.
הקש בעדינות על צד הצינור כדי לסלק ולנתק את גלולת הכדור ולאחר מכן להחזיר אותו אל מתלה הקירור. בעזרת הצנרת הממולעת מראש בשני מיליליטר, מערבבים בעדינות את המטריצה על הקרח על-ידי צינורות למעלה ולמטה מספר פעמים. פיפטה במהירות שווה ומתונה, כך שלא הוכנסו בועות למטריצה במהלך הליך זה.
מעבירים 1.1 מיליליטר של המטריצה לכל צינור צנטריפוגה. באמצעות טיפים צנום מראש, פיפטה מטריצה בכל צינור למעלה ולמטה על 10 פעמים כדי להפוך את ההשעיה תא אחיד. להעביר 310 microliters של ההשעיה מטריצת התא לתוך כל באר של צלחת 24 בארות מראש.
מניחים את הפיפסה בזווית של 90 מעלות למשטח הלוח ומוסיפים את המתלה למרכז הגם. ההשעיה מתפשטת ומכסה את כל באר. כדי להקל על ניתוח immunofluorescence במורד הזרם, להעביר 60 microliters של מתלים מטריצת תא למרכז הבאר של שקופית תא שתי בארות.
זה מאפשר למטריצה ליצור מבנה דמוי כיפה עם נפח הרבה יותר קטן. מחזירים את הצלחת ואת התא להחליק בחזרה לתוך החממה תרמת הרקמה ואת הדגירה במשך 30 דקות כדי לאפשר את המטריצה להתגבש. לאחר מכן, בדוק את הלוח והחליק תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שתאים בודדים יחולקו באופן שווה בתוך המטריצה.
הוסף מיליליטר אחד של תרבות תלת מימד מחוממת מראש להשלים מדיום לתוך כל באר של הצלחת ו 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות 3D לתוך כל באר של השקופית התאית, ואז להחזיר אותם לחממה. לאחר הכנת השעיות תאים של TUM622 ו CAFs כפי שתואר קודם לכן, לספור את צפיפות התא CAF על ידי ערבוב 10 microliters של השעיית תא עם 10 microliters של כחול trypan. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של התערובת לכל אחד משני התאים בהמוציטומטר כדי לספור ולחשב את צפיפות התאים.
כדי להטביע במשותף תאי TUM622 ו- CAF במטריצת קרום מרתף, חשב תחילה את מספר התאים הרצוי המשמש ל ציפוי בהתבסס על מידע צפיפות התאים. CAFs הם זרעים ביחס 2:1 של תאי TUM622. העבר את הנפח המחושב של TUM622s, כמו גם מתלי תא CAF לאותו צינור צנטריפוגה.
לסובב למטה ושוכם את כל בינוני. יש להתרסק במטריצת קרום המרתף ולצלחת 310 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר של צלחת של 24 בארות. לקבלת שפעת חיסונית, העבר 60 מיקרוליטרים של תערובות TUM622 ו- CAF לשקופיות קאמריות כמתואר קודם לכן.
כדי coculture TUM622 עם CAFs מכוסה במטריצת קרום מרתף, להגדיר תחילה מונוקולטורה TUM622 כפי שתואר קודם לכן, להעביר מספר כפול של השעיית CAF לתוך צינור צנטריפוגה, ולסובב למטה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את ה- CAFs העל-טבעיים והשקיעו מחדש את ה- CAFs במדיום התרבותי, העבר מספר כפול של תאי CAF שהיו מתווסכים מחדש במדיום התרבותי לכל אחת מה בארות המכילות את תאי TUM622 המוטבעים. תאי TUM622 טיפוסיים בתרבות דו-מימדית מעוגלים בגרעין גדול בעוד ש- CAFs שטוחים ומוארכים.
זרע בתרבות 3D, תאים TUM622 יחיד היו מסוגלים ליצור אורגנואידים עם morphologies acinarlike כאשר מוטבע. בין ימים 5 ל-7, לומן התברר במבנים דמויי האינארי ונשאר חלול לאחר מכן. כל acinus, מורכב monolayer של תאים המקיפים את לומן חלול, הפגין קוטביות בסיס אפיקלית נכונה דומה לזו של אפיתל ריאות ב vivo.
מבנים אלה דמויי acinarlike היו היפרפלסטיים והמשיכו לגדול עד 24 ימים לפני מטריצה חוץ תאית התפורר לחלוטין. ב Cocultures TUM622-CAF, או כיסוי או שיתוף הטבעה, הנוכחות של CAFs שיפרה מאוד את המספר והגודל של הכדורואידים שנוצרו. מעניין, כאשר TUM622 acini הגיע לקרבה עם CAFs, הם גרמו acini להיות פולשנית נודד לכיוון CAFs, יצירת מבנים דמויי דמעה.
כדי להבטיח היווצרות חזקה של מבנים דמויי acinarlike, זה קריטי כדי לשמור על מטריצת קרום המרתף בצורתו הנוזלית במהלך כל התהליך של הטבעת התאים. אורגנואידים TUM622 ניתן להשתמש עבור מגוון רחב של ניתוחים במורד הזרם, כולל אך לא מוגבל immunofluorescent, אימונוהיסטוכימיה, ציטומטריה זרימה, RNA והפקת חלבון, והוא יכול להיות גם שונה עבור הקרנת סמים. באמצעות מערכת זו כפלטפורמה, ניתן לחקור כיצד תא הגידול פנימי, כמו גם שינויים מהותיים בתא microenvironment הגידול יכול להשפיע על ארכיטקטורת אפיתל הגידול היווצרות קרצינומה.
