好中球および他の免疫細胞による細胞外トラップの放出は、自然免疫において重要であるが、また、炎症病理と強く関連している。これらの細胞は炎症反応において重要な役割を果たしているが、マクロファージにおけるこのプロセスについてはほとんど知られていない。このプロトコルは、マクロファージ細胞外トラップまたはマスト放出の主要なヒトin vitroモデルを提供する。
これは、生体内でこの構造の潜在的な生理学的成長を研究するためのモデルを提供します。この技術の主な利点は、このプロトコルからの細胞がヒトバフィーコート製剤から単離された一次細胞であることである。単球をマクロファージに分化するために必要なプライミングステップはなく、THP-1細胞株などの他の単球細胞株とは対照的である。
このプロトコルは、単離された好中球およびミクログリアを含む他の免疫細胞に容易に適応される。マクロファージによって生成される細胞外トラップは非常に脆弱であるため、染色されたトラップの完全性を維持するために、ステップ間に注意を払う必要があります。滅菌条件下で、完全なRPMI-1640培地に添加してM1プライミング培地を調製し、インターフェロンガンマは1ミリリットル当たり20ナノグラム、リポ多糖の濃度は1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度にする。
ミリットル当たり20ナノグラムの濃度に完全なRPMI-1640培養培地にインターロイキン4を加えることによってM2プライミング培地を調製する。無菌条件下では、HMDMを含む播種および培養組織培養プレートウェルから吸引された培地。慎重に各井戸に追加, 37 摂氏に事前に温めた滅菌PBSの1ミリリットル.
PBSバッファーを取り出し、さらに2回洗います。HMDMを含む各ウェルにM1またはM2プライミングメディアの1ミリリットルを追加します。細胞インキュベーターに5%の二酸化炭素が存在する場合、セルを摂氏37度で48時間インキュベートする。
滅菌条件下で、完全なRPMI-1640培地にMET放出の異なる刺激剤を含む培養培地を調製する。次亜塩素酸刺激の実験では、摂氏37度に予め温めたHBSSを備えたファルコンチューブに200マイクロモル次亜塩素酸を調製します。偏光処理後、各ウェルから細胞培地を吸引し、PMA、TNFアルファ、およびインターロイキン8刺激または次亜塩素酸刺激のためのHBSSのいずれかの無菌PBSの1ミリリットルのアリコートで細胞を3回慎重に洗浄する。
最終洗浄工程でPBSを除去した後、PMA、TNFアルファ、またはインターロイキン8を含む完全な培地を1ミリリットル添加する。TNFアルファ刺激のために6時間、PMAまたはインターロイキン8刺激のために24時間、セルインキュベーターで37°Cと5%の二酸化炭素で細胞をインキュベートします。次亜塩素酸の実験では、最終洗浄工程でHBSSを除去した後、調製した次亜塩素酸を1ミリリットル添加する。
その後、細胞インキュベーターに5%の二酸化炭素が存在する場合、37°Cで15分間培養します。その後、細胞の上清を慎重に吸引し、HBSSの1ミリリットルのアリコートで細胞を3回洗浄する。最終洗浄工程からHBSSを取り外した後、完全なRPMI-1640培養培地を1ミリリットル加えます。
その後、細胞インキュベーターに5%の二酸化炭素が存在する場合、37°Cで24時間培養します。40マイクロモルの濃度でHBSSでSYTOXグリーン染料を調製します。HMDMを含む各ウェルに25マイクロリットルの染料を直接加えます。
暗い所で5分間室温で細胞をインキュベートする。次に、HMDMを組織培養井戸に配置し、蛍光顕微鏡を反転してイメージングします。高解像度カラーデジタルカメラを搭載した広域蛍光光源、明視野光源、反転顕微鏡をオンにします。
504ナノメートルで励起し、523ナノメートルで寸法を出して緑色蛍光のナンバー2の位置にフィルターホイールを回転させます。5Xの目的を使用して、画像がシャープ、クリア、および焦点が合うまで、顕微鏡上の細かい焦点ノブを粗い焦点で画像を焦点を合わせます。顕微鏡をカメラモードに切り替えます。
関連付けられているソフトウェアを起動します。[再生] ボタンをクリックして画像をプレビューし、イメージが鮮明で鮮明で、ソフトウェア プレビュー ウィンドウにフォーカスが合うまで、顕微鏡の細かいフォーカス つまみを調整します。[キャプチャ]ボタンをクリックします。
ソフトウェア内で、[ファイル] をクリックします。必要なイメージ ファイルの種類として保存します。顕微鏡上で、フィルターホイールを明視野イメージングの5番に回転させ、キャプチャ手順を繰り返して対応する明視野画像を得ます。
刺激に応答してHMDMの形態学的変化を示す明視野画像をここに示す。インターフェロンガンマおよびリポ多糖に曝露したHMDMの実験からM1偏光マクロファージは、細長く紡錘状の細胞形状を示した。比較のために、HMDMをインターロイキン4に48時間曝露した後のM2偏光マクロファージの形態は、典型的には円形および平坦であった。
METを放出するHMDMの分化されたタイプの能力を、SYTOXグリーンでの生細胞蛍光イメージングによって可視化した。いずれの炎症促進刺激も存在しない状態で24時間インキュベートされた各HMDM表現型から得られた対照は、極めて限られた緑色染色を示した。緑色の筋として示されるMETに対する陽性染色は、次亜塩素酸、PMA、インターロイキン8、またはTNFアルファへのM1-HMDMの曝露で達成された。
細胞内に明らかな緑色染色の存在は、細胞外トラップ放出とは無関係である細胞死から生じる膜完全性の喪失を反映している。インターロイキン4に曝露したM2-HMDMを用いて行った実験では、細胞外DNAの鎖または筋の欠如によって示されるように、細胞からのDNAの放出は示さなかった。しかし、次亜塩素酸とTNFアルファを用いた緑色蛍光色素の細胞化があった。
イメージングの前に染色を過度に露出させる可能性のある直接の明るい光を避けることは重要です。細胞外DNAは、細胞上清中に存在する核およびミトコンドリアDNAに関するqPCR解析により定量することができる。HMDMを用いた慢性炎症におけるマスト構造およびその役割のさらなる特徴は、他の不死化細胞系マクロファージストアと比較してより臨床的に関連し得る。
