分化人类单细胞衍生巨噬细胞中细胞外陷阱释放的体外刺激与可视化

中性粒细胞和其他免疫细胞释放细胞外陷阱在先天免疫中很重要，但也与炎症病理密切相关。虽然这些细胞在炎症反应中起着关键作用，但对巨噬细胞的这个过程了解得很少。该协议提供了一个主人类体外模型的巨噬细胞外陷阱或桅杆释放。

它为我们研究这种结构在体内的潜在生理生长提供了一个模型。这项技术的主要优点是，从该协议的细胞是原细胞从人类的布衣制剂分离。无需启动步骤来区分单细胞到巨噬细胞，这是与其他单细胞细胞系，如THP-1细胞系的对比。

该协议很容易适应其他免疫细胞，包括分离的嗜中性粒细胞和微胶质。巨噬细胞产生的细胞外陷阱非常脆弱，因此必须在步骤之间小心，以保持染色陷阱的完整性。在无菌条件下，通过加入完整的RPMI-1640培养基，将干扰素伽马添加到每毫升20毫微克的浓度和每毫升1微克的浓度中，准备M1吸油介质。

通过将白细胞素 4 添加到完整的 RPMI-1640 培养基中，将 M2 启动介质添加到每毫升 20 毫微克的浓度中，准备 M2 启动介质。在无菌条件下，从含有HMDM的种子和培养组织培养板井中吸气培养介质。小心地加入每个井，一毫升无菌PBS预先加热到37摄氏度。

拆下 PBS 缓冲液并再洗两次。向包含 HMDM 的每个井中添加一毫升的 M1 或 M2 注水介质。在细胞培养箱中存在5%的二氧化碳的情况下，在37摄氏度下孵育细胞48小时。

在无菌条件下，将含有不同 MET 释放刺激器的培养基准备到完整的 RPMI-1640 介质。对于次氯酸刺激的实验，在具有HSS的猎鹰管中准备200微摩尔次氯酸，该管已预热至37摄氏度。极化治疗后，从每个井中吸出细胞介质，用一毫升的异同为一毫升的等同，用于PMA、TNFα和白细胞间8刺激，或HBSSs进行下氯酸刺激。

在最后的洗涤步骤中去除 PBS 后，添加一毫升包含 PMA、TNF alpha 或白细胞素 8 的完整介质。在37摄氏度和5%的细胞培养箱中孵育细胞，用于TNF alpha刺激6小时，为PMA或白细胞间8刺激24小时。对于次氯酸的实验，在最后的洗涤步骤中去除HSSS后，加入一毫升新鲜准备的次氯酸。

然后在37摄氏度下在细胞培养箱中存在5%的二氧化碳的情况下孵育细胞15分钟。之后，小心吸气细胞的上经剂，用一毫升的HSS等分液洗三次细胞。从最后的洗涤步骤中去除 HBSS 后，添加一毫升完整的 RPMI-1640 培养基。

然后在37摄氏度下在细胞培养箱中存在5%的二氧化碳的情况下孵育细胞24小时。在HSSS中以40微摩尔的浓度准备SYTOX绿色染料。将染料的25微升直接添加到每个含有HMDM的井中。

在黑暗中在室温下孵育细胞5分钟。然后将 HMDM 放在组织培养井中，放在倒置荧光显微镜的显微镜阶段进行成像。打开广谱荧光光源、亮场光源和带高分辨率彩色数码相机的倒置显微镜。

将滤芯轮旋转至绿色荧光的二号位置，在 504 纳米时激发，尺寸在 523 纳米。使用 5 倍目标，用粗焦对焦对焦图像，然后将精细对焦旋钮聚焦在显微镜上，直到图像看起来清晰、清晰和聚焦。将显微镜切换到相机模式。

启动关联的软件。单击"播放"按钮预览图像并调整显微镜上的精细对焦旋钮，直到图像在软件预览窗口中显示清晰、清晰和聚焦。单击"捕获"按钮。

在软件中，单击"文件"。保存为所需的图像文件类型。在显微镜上，将滤光轮旋转到五号位置进行亮场成像，并重复捕捉过程以获取相应的亮场图像。

此处显示了显示 HMDM 响应刺激的形态变化的亮场图像。M1极化巨噬细胞从HMDM实验暴露在干扰素伽马和脂质多糖显示一个拉长和主轴状的细胞形状。相比之下，HMDM暴露于白细胞间448小时后，M2极化巨噬细胞的形态通常是圆形和扁平的。

通过SYTOX绿色活细胞荧光成像，将分化HMDM表型释放MEX的能力可视化。在没有任何亲炎刺激的情况下，从每个HMDM表型中孵育24小时的对照显示绿色染色非常有限。M1-HMDMs 接触次氯酸、PMA、白细胞素 8 或 TNF alpha，实现了 MET 的正染色（显示为绿色条纹）。

细胞中明显的一些绿色染色的存在反映了膜完整性的丧失，这可能是由于细胞死亡而导致的，而细胞外陷阱释放。使用暴露于白细胞间4的M2-HMDM进行的实验表明，细胞中没有释放DNA，细胞外DNA的链或条纹的缺失就表明了这一点。然而，有一些细胞吸收绿色荧光染料与次氯酸和TNFα。

在成像前避免直接亮光会过度暴露污渍，这一点很重要。细胞外DNA可以通过qPCR对细胞上因的核和线粒体DNA进行分析进行量化。与其他不朽的细胞系巨噬细胞储存相比，使用HMDM对桅杆结构及其在慢性炎症中的作用的进一步表征可能更具有临床相关性。