إطلاق الفخاخ خارج الخلية من قبل العدلات والخلايا المناعية الأخرى مهم في المناعة الفطرية ولكن أيضا يرتبط بقوة مع الأمراض الالتهابية. لا يُعرف الكثير عن هذه العملية في الضامة على الرغم من أن هذه الخلايا تلعب دورًا حاسمًا في الاستجابة الالتهابية. يوفر هذا البروتوكول نموذج الإنسان الأساسي في المختبر من الضامة التراكب خارج الخلية أو إصدار الصاري.
فهو يوفر نموذجا لنا لدراسة النمو الفسيولوجية المحتملة لهذا الهيكل في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا من هذا البروتوكول هي الخلايا الأولية المعزولة عن الاستعدادات معطف بافي الإنسان. لا توجد أي خطوة فتيلة المطلوبة للتمييز أحادية في الضامة، وهو على النقيض مع خط الخلية أحادية أخرى مثل خط الخلية THP-1.
يتم تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع الخلايا المناعية الأخرى بما في ذلك العدلات المعزولة والميكروجليا. مصيدة خارج الخلية التي تنتجها الضامة هشة جدا، لذلك يجب أن تتخذ الرعاية بين خطوة للحفاظ على سلامة الفخاخ الملطخة. في ظل ظروف معقمة، وإعداد M1 فتيلة المتوسطة عن طريق إضافة إلى وسائل الإعلام كاملة 1640 1640 1640 ثقافة، إنترفيرون غاما إلى تركيز 20 نانوغرام لكل ملليلتر وlipopolysaccharide إلى تركيز ميكروغرام واحد لكل ملليلتر.
إعداد M2 فتيلة وسائل الإعلام عن طريق إضافة interleukin 4 إلى وسائل الإعلام ثقافة كاملة 1640- 1640 إلى تركيز 20 نانوغرام لكل ملليلتر. في ظل ظروف معقمة، تُشعّر الوسائط من آبار آبار زراعة الأنسجة المصنفة والمثقّلة التي تحتوي على HMDM. إضافة بعناية إلى كل بئر، ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة قبل الدفء إلى 37 درجة مئوية.
إزالة المخزن المؤقت PBS وغسل مرتين إضافية. أضف ملليلتر واحد من وسائط M1 أو M2 في كل بئر تحتوي على HMDM. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة الخلايا.
في ظل ظروف معقمة، وإعداد وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على محفزات مختلفة من الافراج MET إلى وسائل الإعلام كاملة 1640- 1640. للتجارب مع تحفيز حمض هيبوكلوروس، وإعداد 200 حمض هيبوكلوروس ميكرومولار في أنبوب فالكون مع HBSS التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية. بعد علاج الاستقطاب، الطامح وسائل الإعلام الخلية من كل بئر وغسل الخلايا بعناية ثلاث مرات مع aliquots ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة لPMA، TNF ألفا، وانترليوكين 8 التحفيز أو HBSS لتحفيز حمض هيبوكلوروس.
بعد إزالة برنامج تلفزيوني في الخطوة النهائية الغسيل، إضافة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام كاملة تحتوي على PMA، TNF ألفا، أو إنترلوكين 8. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة الخلية لمدة ست ساعات لتحفيز TNF ألفا و 24 ساعة لPMA أو interleukin 8 التحفيز. للتجارب مع حمض هيبوكلوروس، بعد إزالة HBSS في خطوة الغسيل النهائية، إضافة ملليلتر واحد من حمض هيبوكلوروس الطازجة المعدة.
ثم احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة الخلايا. بعد ذلك، بعناية التعرق الخلايا'ة ونغسل الخلايا ثلاث مرات مع aliquots ملليلتر واحد من HBSS. بعد إزالة HBSS من خطوة الغسيل النهائية، أضف ملليلتر واحد من وسائط الثقافة الكاملة لـ RPMI-1640.
ثم احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة الخلايا. إعداد صبغة خضراء SYTOX في HBSS بتركيز 40 ميكرومولار. إضافة مباشرة 25 ميكرولترات من الصبغة إلى كل بئر تحتوي HMDM.
احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام. ثم ضع HMDM في آبار زراعة الأنسجة على مرحلة المجهر من المجهر الفلوري المقلوب للتصوير. قم بتشغيل مصدر ضوء فلوري واسع الطيف، ومصدر ضوء حقل مشرق، ومجهر مقلوب مثبت بكاميرا رقمية ملونة عالية الدقة.
قم بتدوير عجلة التصفية إلى الموضع الثاني للفلورس الخضراء مع الإثارة عند 504 نانومتر والبعد في 523 نانومتر. باستخدام الهدف 5X ، والتركيز على الصورة مع التركيز الخشن ثم المقابض التركيز غرامة على المجهر حتى تظهر الصورة حادة وواضحة ، ومركزة. قم بتبديل المجهر إلى وضع الكاميرا.
بدء تشغيل البرامج المقترنة. انقر فوق زر التشغيل لمعاينة الصورة وضبط مقبض التركيز الدقيق على المجهر حتى تظهر الصورة حادة وواضحة ومركزة في نافذة معاينة البرنامج. انقر فوق الزر التقاط.
داخل البرنامج، انقر فوق ملف. حفظ كنوع ملف الصورة المطلوبة. على المجهر، قم بتدوير عجلة التصفية إلى الموضع رقم خمسة للتصوير في المجال الساطع، وكرر إجراءات الالتقاط للحصول على صورة المجال الساطع المقابلة.
تظهر هنا صور المجال المشرق التي تُظهر التغيرات المورفولوجية لـ HMDM استجابة للمحفزات. أظهرت الضامة M1 المستقطبة من التجارب التي أجريت مع HMDM المعرضة لتفيريرون غاما وليبوبوليسكاريد شكل خلية ممدود ومزكل. للمقارنة، كانت مورفولوجيا الضامة المستقطبة M2 بعد تعرض HMDM ل interleukin 4 لمدة 48 ساعة عادة مستديرة ومسطحة.
تم تصور قدرة الأنماط الظاهرية المتمايزة HMDM على إطلاق METs من خلال تصوير الفلورية في الخلايا الحية مع اللون الأخضر SYTOX. وأظهرت السيطرة التي تم الحصول عليها من كل نمط ظاهري HMDM المحتضنة لمدة 24 ساعة في غياب أي منبهات الموالية للالتهابات تلطيخ أخضر محدود جدا. تم تحقيق التلطيخ الإيجابي لـ METs ، كما يظهر كشرائط خضراء ، مع تعرض M1-HMDMs لحمض هيبوكلوروس ، PMA ، interleukin 8 ، أو TNF alpha.
وجود بعض تلطيخ أخضر واضح في الخلايا يعكس فقدان سلامة الغشاء الذي قد ينتج عن موت الخلايا التي هي مستقلة عن الافراج عن فخ خارج الخلية. ولم تظهر التجارب التي أجريت مع M2-HMDMs المعرضة للانترالوكين 4 أي إطلاق للحمض النووي من الخلايا، كما يدل على ذلك غياب خيوط أو شرائط الحمض النووي خارج الخلية. ومع ذلك، كان هناك بعض امتصاص الخلوية من صبغة الفلورسنت الخضراء مع حمض هيبوكلوروس و TNF ألفا.
من المهم تجنب الضوء الساطع المباشر الذي يمكن أن يفرط في تعريض التلطخ قبل التصوير. يمكن قياس الحمض النووي خارج الخلية من خلال تحليل qPCR على الحمض النووي والحمض النووي الميتوكوندريا الموجودة في الخلية الفائقة. مزيد من توصيف بنية الصاري وأدواره في التهاب مزمن باستخدام HMDM قد تكون أكثر أهمية سريريا بالمقارنة مع غيرها من الخلايا الخلية الخلية الضامة مخازن.
