このプロトコルは、特定の疾患状態の生細胞における炎症性カスパーゼ経路を分子レベルで視覚化および尋問するために使用することができるため、重要である。この技術の主な利点は、初代免疫細胞における炎症性カスパーゼ活性化複合体の成分、要件、および局在を同定するために使用することができることである。わずかな最適化により、この方法は、他の初代細胞およびオリゴマー化によって活性化された一連のタンパク質に適合させることができ、その適用可能性は顕微鏡的方法論に限定されない。
まず、完全に分化したマクロファージから10センチメートルの皿に培地を吸引し、温かい無血清RPMI-1640培地で細胞単層を洗浄し、すべての培地を完全に除去する。10センチメートルディッシュあたり2ミリリットルの0.25%温かいトリプシン-EDTA溶液を加えて細胞を回収する。トリプシン−EDTAをP−1000マイクロピペットでディッシュ全体に上下に穏やかにピペットし、次いで懸濁液を5ミリリットルの温かい完全培養培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに移す。
明視野顕微鏡下で細胞の剥離を確認し、必要に応じて再度剥離する。培地を吸引し、摂氏37度に予め加温した10ミリリットルの1倍滅菌PBSに細胞を再懸濁する。その後、20マイクロリットルのアリコートを取り、血球計数器を用いて細胞数を決定した。
トランスフェクションごとに 10 ~ 5 番目の細胞を 1 ~ 2 回取り、15 ミリリットルのチューブに入れます。予め加温した1X滅菌PBSで15ミリリットルの最終容量にする。PBSを吸引し、250 x gで1分間もう一度遠心分離します。
P-200マイクロピペットを用いて細胞ペレットから残留PBSを除去する。トランスフェクションごとに 1.5 ミリリットルの滅菌マイクロチューブを取り、適切なレポータープラスミドとカスパーゼ BiFC プラスミドをフードに加えます。ピペットステーション、装置、チップ、エレクトロポレーションチューブ、およびピペットを滅菌層流フード内に置く。
ヌクレオフェクション装置を接続して電源を入れます。表示された起動画面に断面パラメータを入力します。電圧を押し、1000と入力し、Doneを押して1000ボルトに設定します。
「幅」を押し、「40」と入力し、「完了」を押してパルスを 40 ミリ秒に設定します。最後に、パルスを押し、2と入力し、完了を押して電気パルスの数を2に設定します。エレクトロポレーションチューブの1つを取り、室温で3ミリリットルの電解バッファーEで満たします。
エレクトロポレーションチューブをピペットステーションのピペットホルダーに挿入し、チューブ側面の電極が内側を向いており、チューブを挿入するとカチッという音が聞こえることを確認します。細胞ペレットを取り、5番目の細胞にそれぞれ1〜2回ずつ10〜2回ずつ10マイクロリットルの予め加温した再懸濁R緩衝液を加え、P−20マイクロピペットで穏やかに混合する。10マイクロリットルの細胞懸濁液を各トランスフェクションチューブに加え、P-20マイクロピペットで穏やかに混合する。
プッシュボタンを2番目のストップに押してチップをピペットに挿入し、クランプが先端のピストンの取り付けステムを完全に持ち上げていることを確認します。次に、ピペットのプッシュボタンを押して最初の停止し、細胞またはプラスミドDNA混合物を含む第1のチューブに浸漬してサンプルを吸引します。サンプルを含むピペットをピペットホルダーに慎重に挿入し、ピペットがカチッと音を立てて適切に配置されていることを確認します。
タッチスクリーンでStartを押し、電気パルスが届くまで待ちます。ステーションからピペットをゆっくりと取り外し、プッシュボタンをゆっくりと押して最初の停止まで押して、トランスセクトされた細胞懸濁液を、予め加温された抗生物質を含まない培地で対応するウェルに直ちに加える。プレートを形質移入細胞で穏やかに揺らし、加湿組織培養インキュベーター内で1〜3時間インキュベートし、次いで200マイクロリットルの予め加温した培養培地を各ウェルに加える。
ディッシュをインキュベーターに入れ、遺伝子発現のために少なくとも24時間放置する。翌日、落射蛍光顕微鏡を用いて細胞生存率およびトランスフェクション効率を検査する。P-1000マイクロピペットで細胞から培地を慎重に取り出し、ウェルの側面に500マイクロリットルの刺激溶液を加えます。
未処理のコントロールウェルを稼働させるには、刺激を与えずにイメージング培地を加える。落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞を視覚化するには、指示に従って顕微鏡と蛍光光源をオンにします。10回または20回対物レンズを選択し、培養皿を顕微鏡ステージ上に置きます。
アイピースで568ナノメートルフィルターの下の細胞を見つけます。レポーター赤血球を発現する細胞に着目した。視野内のすべての赤いセルを数えます。
同じ視野で、488 または 512 フィルターに変更し、緑色の赤いセルの数を数えます。少なくとも 3 つのフィールドの赤セルを少なくとも 100 個数えます。視野あたりの金星陽性形質移入細胞の割合を計算し、得られたパーセンテージを各処理ウェルの平均化して標準偏差を求めます。
落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化するには、カメラによって取得されたコンピュータ画面上の細胞のライブ画像を視覚化する。ジョイスティックコントロールとフォーカスホイールを使用して、セルのフォーカスと位置を微調整します。512 ナノメートルまたは 488 ナノメートルおよび 568 ナノメートルのレーザーのレーザー出力と露光時間の割合を設定して、画像内の信号が飽和せずに良好に見えるようにします。
ライブキャプチャをオンにして、結果の画像を調べて、両方のチャンネルの表示ヒストグラムで各フロアに明確なピークが見られることを確認します。細胞のライブ画像を視覚化しながら、プレートの各ウェルについてmCherryまたはdsRedmitoレポーターを発現する1つ以上の細胞を含むフィールドの複数の代表画像を撮影する。GM-CSFと共に7日間インキュベートした選択されたCD-14陽性単球は、分化期間の経過にわたって細胞形態の変化を示し、球状の浮遊細胞からスピン状かつ完全に付着し、最後に、完全に分化するとより広がった細胞へと変化した。
完全に分化した細胞を、レポータープラスミドdsRedmitoと共にカスパーゼBiFC対VCおよびVNで形質移入し、これを形質移入細胞を標識するために使用した。未処理の細胞は金星蛍光を示さなかった。そしてニゲリシン処理された細胞では、カスパーゼ-1 BiFCはASC斑点の典型的な形状を有する単一の穿刺として現れた。
金星陽性MDMの定量は、LPSプラスニゲリシン治療群においてカスパーゼ−1 BiFCの最も高い割合が見られることを示した。カスパーゼ-1、4、および5つのpro-BiFCペアのプラスミド滴定では、金星陽性細胞の割合が最も高かったのは、それぞれ400、500、および1,000ナノグラムのトランスエクトプラスミドから生じました。細胞のフィールドを24時間後切除して得られた共焦点画像は、未処理の経流細胞がミトコンドリアが無傷であるように生存可能であることを示した。
ヘムで処理した後、カスパーゼ-1複合体は、ニゲリシンによって誘導されるものと同様の単一の緑色の穿刺として現れる。分化、トランスフェクション、および治療中に細胞の過酷な条件や過度の操作は、自発的な活性化とカスパーゼ活性化の高いバックグラウンドレベルをもたらす可能性があるため、避けてください。
