We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

方法は、ここで油中水型エマルジョンの液滴中の基本的な紡錘体を再構成することが、本の最近の取り組みを説明しました。幾何学的境界内にスピンドル・アセンブリを研究することは、多数の利点を提供します。重要なフィードバック機構は、有糸分裂紡錘体の微小管と、それらが組み立てられた幾何学的制約の間に存在します。微小管は、それらが、紡錘体の変位をもたらすことができる幾何学的境界に成長時に力を押し生成することができます。また、物理的な障壁に成長する微小管災害を誘発することができます。また、制限された形状内のスピンドル・アセンブリは、順番に直接微小管の成長率36に影響を与えるようなチューブリンなどの個々のコンポーネント、の漸進的な枯渇につながることができます。これらは、ここに記載のアッセイを用いて研究することができるスピンドル・アセンブリの全ての必須の決定要因です。 記載のアッセイは、低濃度のdiffereに非常に敏感です液滴コンポーネントのNCES。これは、マイナーな濃度差がいずれか遅すぎるか、あまりにも急速な微小管の成長をもたらすことができるチューブリン、の場合です。この場合には、微小管の成長率は、多くの場合、依然として実験の最初の約30分の間に温度を調整することによって補正することができます。有糸分裂紡錘体の組み立て及び位置合わせは、（皮質）力発生の濃度の変化に非常に敏感です。これは、精製された成分の濃度、純度および活性に依存する可能性があり、すべての新たに精製されたタンパク質のために慎重に滴定される必要があります。 また、特定のトレードオフは、アッセイの性質に応じて、撮像設定で行われなければなりません。最初は、水溶性の蛍光チューブリン二量体の高レベルは、画像の個々の微小管にそれを困難にします。微小管が長く成長し、可溶性チューブリンを徐々に枯渇しているように、信号対雑音比が徐々に高くなり、individuのイメージングを可能にしますアル微小管。オープンシステムでセットアップとは対照的に、幾何学的な閉じ込めは重要漂白が得られ、バルクリザーバ内の蛍光分子及び酸素スカベンジャー系の成分の交換を防止します。特に経時スピンドルアセンブリと位置を監視するために、それがあっても強力な酸素スカベンジャー系の存在下で、低い光強度で画像に必要とされます。 これらの方法には、in vitroでの簡素化紡錘状構造のボトムアップ再構成を可能にします。ここで紹介成分に加えて、他の多くの要因は、双極紡錘体形成、位置決め、方向付け、成形、 等 3に影響を与えることが記載されています。このシステムは、さらに、追加の力発生器の個々の及び組み合わせの効果を研究するために拡張することができます。このシステムから、現在存在しない紡錘体形成に重要な貢献者は、有糸分裂染色体です。有糸分裂クロマチンに示されていますいわゆる「極性吐出軍3 &#39; を生成することができます （1）chromokinesins、クロマチン結合RanGEF RCC1 38によってRanGTPと勾配の（2）の形成、（脱重合と相互作用することができる（3）動原体による直接紡錘体形成）微小管39及び（4）の対向する微小管40との間における機械的バネとして機能することができるクロマチン自体。 最後に、記載されたシステムは、現在、限られた時間的・​​空間的な活動を制御し、導入力発電機の局在を提供します。細胞では、多数のスピンドル・アセンブリの要素は、特定のコンパートメントに局在化または制限された時間ウィンドウ内で活性です。顕著な例は、具体的にはCの後側に濃縮されるダイニンの活動であり、非対称の主軸位置と細胞分裂を促進する1細胞期胚をエレガンス 。このシステムでは、我々は現在、トンを模倣する可能性を模索しています光遺伝学的手法から借用した方法を用いてemporalと非対称活動。また、Cの場合と同様エレガンス胚と剛性細胞壁を有する細胞は、多くの細胞が有糸分裂に切り上げていません。幾何学的な閉じ込めの形状は、スピンドル41に作用する力の基礎影響を与えることになります。したがって、潜在的に整形し、エマルジ ​​ョン液滴42,43の記憶許可より複雑なマイクロ流体システムを使用して、同様に非球形の小滴にスピンドル・アセンブリと位置を再構成することが重要であろう。最後に、組織において、細胞 - 細胞および細胞 - 基質シグナリングおよび付着は、多くの場合、上皮細胞において観察されるように、指向軸方向に変換することができる外部の手がかりを提供し、幹細胞。これらの特殊な側面のすべては、この現在の研究では考慮されておらず、紡錘体assembのin vivo様より再構成は向かって構築するための今後の課題を提供するかもしれませんLYとポジショニング。

有糸分裂の間、複製されたゲノムの染色体は新たに形成された娘細胞の上に姉妹染色分の平等な分配を確保するために、セル赤道で編成されています。染色体の位置および分離は、二つの対向の中心体から発するスピンドル微小管への結合によって媒介されます。忠実な染色体分配を確保することに加えて、有糸分裂紡錘体の配向は、細胞分裂面1を決定します 。細胞分裂の協調姿勢は、開発の多くの段階中および組織の恒常性2に必須です。具体的には、規制紡錘体の位置は、細胞内容の非対称分布が生じ、あるいは異なるサイズ2の娘細胞を生成することができます。紡錘体アセンブリおよび向きは、前期に開始し、協力し力発電機3,4に拮抗するとの間の複雑な相互作用によって編成されています。発生する力は、Bから構成されOTH引っ張り、押す力。これらの力は、細胞の皮質とスピンドルの連絡先からだけでなく、スピンドル内の両方から発信され、微小管ダイナミクスによってだけでなく、分子モーターとクロスリンカー（ 図1）によって生成することができます。 微小管は、細胞皮質のような剛性の構造に対して成長時押圧力を発生させることができます。システム内で発生する総抵抗力に応じて、これは、有糸分裂紡錘体（低力）の再配置をもたらすか、微小管の座屈や大惨事（強い力）5-8をトリガすることができます 。長さは、微小管座屈9の強力な決定因子であるので、押すことによって発生させることができる力の量は、微小管の長さに依存します。さらに、1つの中心体に由来微小管は、他の中心体に対して早期前期3,10に中心体分離を駆動するために提案された機構を押すことができます。 広告で成長している微小管によって発生した力を押す、微小管が接触し末端細胞表層へのditionも力11を引っ張っ媒介することができます。複数の研究室からの研究は、皮質力発電機の制御された活性は、インビボ 1 で紡錘体の非対称の位置決めのために必要であることを示しています。これらの引っ張り力にエッセンシャル（以下「ダイニン」という）皮質局在細胞質ダイニン、マイナスエンド向かう微小管モーター蛋白質8,12,13です。例えば、酵母、皮質14に沿ってスライドモーター依存微小管における微小管の格子結果に皮質ダイニンの横方向の相互作用を出芽インチしかし、皮質引っ張り力はまた、微小管8を解重合する末端にアタッチメントを形成するダイニンの機能によって生成することができます。微小管収縮によって発生するエネルギーは、一般的により高い一桁力につながる可能性があり（〜50 PN（15を参照</s個々のモータータンパク質（〜7-8 PN（参考文献16））によって生成される力より））&gt;アップ。脱重合微小管への皮質ダイニンのエンド上の結合は出芽酵母17およびCで主軸の位置決めを促進しますエレガンス 13。モーター依存スライドおよび微小管脱重合駆動の両方皮質引っ張る力が協力またはin vivoで相互に排他的であることができるかどうかを現在不明です。 微小管押圧力とダイニン媒介皮質引っ張り力に加えて、中心体の位置決めは、多くの他のタンパク質によって有糸分裂紡錘体の中から制御されます。キネシン-5モータは、例えば、外側にスライド力18-20の生成をもたらす、逆平行極間微小管を架橋することができる四量体として存在します。キネシン-5モーターファミリーのメンバーは、Cの例外を除いて、研究した全ての真核生物における中心体分離およびバイポーラスピンドルアセンブリのために必要とされますエレガンス<html> （参照21に概説されています）。 また、ASE1 / PRC1ファミリーの拡散性架橋剤はまた、 インビボおよびインビトロ 22-27 に極間微小管の微小管重複領域に局在することが知られています。重複微小管領域のASE1主導の展開によって発生する力は、in vitro 28,29 にキネシン-14媒介スライディング力を相殺するのに十分な大きさです。細胞では、ASE1 / PRC1は、スピンドル中間帯25-27,30で微小管の重複領域を拡散性架橋剤によって発生する力が大幅にスピンドル組織に貢献できることを示唆しているの安定形成に必要です。最後に、有糸分裂クロマチンからの力および動原体は、種々の経路3を介して紡錘体のアセンブリおよび位置決めに影響を与えます。これらのコンポーネントは、ここで説明する再構成アッセイの一部ではないので、詳細には説明しません。 jove_content &quot;&gt;別の理論は、異なる分子成分と力がスピンドルアセンブリと位置決めに協力、私たちはまだ遠い定量的理解からである上記の方法に存在する。生細胞での実験に加えて、精製された成分を用いたin vitroの実験の強力なを提供しますこの目標を達成するのに役立つルート。ここでは、最近公開された方法（ロスら 31）の適応と拡張版の視覚ガイドを提示し、基本的なスピンドルが始まる、油中水型エマルジ ​​ョン液滴中で再構成されていますマイクロ流体技術を使用してコンポーネントの最小数は、球状液滴が分裂細胞に匹敵するサイズで生成される。これらの液滴内で、精製された中心体およびチューブリンは、微小管アスター動態を研究発生及びアスター・アスター相互作用を強制するために組み合わせることができる。で皮質（例えば、ダイニンなど）およびインター極性（例えば、キネシン5 / ASE1）力発電機を導入し、我々in vivoの状況に似ていると起動し、ますます複雑紡錘状の構造を再構成します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Preparation of microfluidic chips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask on film substrate)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &amp;lt;1-0-0&gt;10-20 &amp;Omega;-cm, 500-550 &amp;mu;m, SSP, with 2 flats)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&amp;nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Microfluidic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Kartell</td><td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, thickness 1.5</td></tr><tr><td>Glass-slides</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Puncher</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory sealing film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td><td></td><td></td><td>Home made</td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Leica</td><td>PMIRB&amp;nbsp;</td><td>Any inverted brightfield would suffice</td></tr><tr><td>Pressure controler</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td><td>VWR, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Reconstituting spindle formation and positioning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine-&#039;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;kappa;-casein (&amp;kappa;-casein from bovine serum milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. Introducing spindle-assembly factors&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine-&#039;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &amp;ge;97% (enzymatic))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

前のセクションで提示される方法は、油中水型エマルジョン液滴の幾何学的な閉じ込めを使用して複雑さを増加させると、スピンドル状構造の再構成を可能にします。このセクションでは、質的にこれらのアッセイの能力を実証する代表的な結果を説明しています。 バイポーラスピンドルが組み立てられたとき、有糸分裂の間、細胞はヒト細胞のために測定されるように、約15ミクロンの直径を有する球を形成するために切り上げます。この特性有糸分裂細胞の形状が制限され、両方がスピンドルサイズや向き35,36を指示する幾何学的境界を提供します。マイクロ流体技術は、正確に生きた細胞で観察された状況に似ているため、in vitroでの紡錘体のボトムアップ再構成を可能にする幾何学的封じ込めのレベルを提供します。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-微小管の成長は、幾何学的境界によって制限されているときにページ= &quot;1&quot;&gt;微小管アスターは既にそれ自体で複雑な動作が可能です。微小管が成長するにつれ、新たなチューブリン二量体を組み込むことにより生成された押し込み力はエマルジョン液滴の両側に2中心体を駆動します。最初は、中心体が自由に閉じ込められたボリューム（ 図4a、左パネル）内に拡散します。約20〜30分後、最初の微小管は微小管がすべての方向に皮質に対して成長するにつれて拡散が制限となり、可視および中心体になります。中間の長さ（液滴直径の約50％）の微小管とアスターは、（立体的に）、他の中心体および皮質互いに押し微小管と、それぞれ別のを撃退することができます。これは、互いに（ 図4a、中央のパネル）二つの対向中心体を有する典型的な「バイポーラ」紡錘状の配置になります。微小管は、液滴直径の〜50％以上成長するとメーターは、中心体を液滴皮質（ 図4a、右パネル）に沿って成長している微小管と、液滴の対向する境界にさらにプッシュされます。これらのアッセイにおける微小管の成長率は温度とチューブリン濃度の両方に非常に敏感であることに注意することが重要です。これらのパラメータは、したがって、強く核生成が最初に観察され、定常状態のアスター位置に達したときの時間に影響します。 細胞では、皮質引っ張る力が微小管プラス端と皮質関連ダイニンとの間に耐荷重添付ファイルの形成を介して生成されます。動物細胞では、この関連はのGαi1のN末端 ​​ミリストイル化を経由して、原形質膜を標的とするのGαi/ LGN / NuMAの複合体に依存します。これらの再構成アッセイでは、のGαi/ LGN /のNuMA複合体の要件を直接介して、ビオチン化脂質とダイニンを結合させることによりバイパスされますビオチン - ストレプトアビジン - ビオチン複合体の形成。これらの結合は比較的安定（K D〜10 -14 M）37であり、急速に形成する（通常は微小管の核形成が明らかになる前に、エマルション滴形成後10分以内）（ 図4b）。ダイニンの非存在下で、中心体を液滴皮質（ 図4c）の反対側に押され、一方の皮質ダイニンの存在下では、中心体は、典型的には、複数の中央位置を保持します。私たちは、これを防止し、微小管押す力に対抗する二つの効果の結果である理由。 （1）ダイニンは直接それによって微小管の長さを制限し、過度の微小管の座屈を防止し、微小管の大災害を促進し、（2）皮質引っ張る力は、アスター、アスター反発力に対抗個々アスター8、上の正味のセンタリング力につながります。 拡散性架橋剤ASE1がfを誘導します逆平行微小管29の重なり領域を増大させる傾向があるorces。これと一致し、ASE1の存在（とダイニンの不在）で中心体は、ASE1がバンドルさ極間微小管（ 図4d）にローカライズと密接一緒に発見されました。キネシン-5ファミリーのメンバーは、（導入を参照）スピンドル内から押し出す力を提供することにより、中心体の分離を駆動します。 Cut7（S.ポンベキネシン5オルソログ）の存在下では、中心体であってもASE1（ 図4e）の存在下で、エマルション液滴の反対側に押し出されます。皮質およびインター極性力発生器を組み合わせることによって、複雑さのレベルは、さらに最終的には双極性有糸分裂紡錘体の包括的な理解をもたらす、これらの実験で増加させることができます。これらの結果の詳細な定量的記述は、将来的に利用できるようになります（ロスら、原稿準備中）。 <p class="jove_content" fo:keeP-together.withinページ= &quot;1&quot;&gt;時点で固定瞬間中心体の位置を観察し、そして微小管の観察された長さに彼らの行動に関連することに加えて、有益な情報が渡って測位処理を以下により得ることができます時間。露光時間及びレーザ強度​​を低減することにより、それだけで約30％の漂白剤を有する少なくとも1時間、2分間隔でアスター位置に追従することが可能です。これは、集中介して自由に拡散する中心体からアスターアセンブリおよび位置決めの監視（0分）ことができます（12分）分散型アスター（36分、さらに）（ 図5c）に。これは、両方の定常状態の挙動とスピンドルアセンブリ動態の研究を促進します。同一試料中の異なる内容の小滴を組み合わせることによって、そのままでおよび皮質力発生器（ 図5b）なしで小滴に中心体の位置決め及びスピンドルアセンブリ動態を比較するために、例えば、可能です。 図1： 紡錘体に作用する力 、いくつかの力を発生する分子は紡錘体の形成および位置決めを促進するために、紡錘体の微小管に作用します。細胞表層に成長する微小管は中心体に押圧力を発生させます。 （紫）皮質ダイニンは、脱重合微小管をキャプチャし、中心体に引っ張り力を発生させます。 PRC1 / ASE1ファミリーのクロスリンカーは、対向する外側にスライドする力を発生に対し、スピンドル内では、キネシン-5 / Cut7モータータンパク質は、反平行微小管を外側にスライドする力を与える。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> 図2：4マイクロ流体チップを含む4インチのフォトマスクのマイクロ流体チップの設計 （A）設計。 （B）シングルチップの詳細な表現。チップは、1つの出口チャネルとダストフィルタが続く3の入口チャネルが含まれています。入口チャネル1が水相を含有し、脂質/油相とチャネル3 2チャネルは、追加の脂質/油相で形成された液滴を希釈するために使用することができます。 （C）（上下から来る）脂質/油相（左から来る）水相に会う接合部の詳細な表現。ジャンクショ​​ンで、液滴が形成され、右側の出口流路に向かって流れます。 （D）2ミクロンチャネルを有する防塵フィルタの詳細な表現。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> 図 3： 油中水滴型エマルジ ​​ョン液滴形成のための方法論 （A）明視野顕微鏡上のマイクロ流体チップとマイクロ流体チューブ。水及び脂質/油相の管の両方が、それぞれチップ口1,2に接続されています。 （B）水と脂質/油相が満たすマイクロ流体チップの制限。圧力を変化させることにより、液滴サイズを制御することができます。 PDMSコーティングされたフローセルの（C）設計。フローセル内への液滴をロードした後、開放端部には、追加Valapで閉鎖されています。 （D）液滴形成の概略図。液滴は、中心体、チューブリンおよび紡錘体形成のために必要な追加の構成要素を封入するために使用されます。皮質ダイニンターゲティングの（E）の回路図。ビオチン化（バイオ）ダイニンは、ストレプトアビジン（STRP）を介してビオチン化脂質を標的とします。 <ahref = &quot;https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> 図4： 複雑さの増加に伴ってスピンドル・再構成はの代表的な結果 （A）、短い、中間、及び長い微小管の一例を示す2中心体を含む液滴の最大強度投影。中心体と微小管10％HiLyte-488チューブリン標識の添加により可視化されます。スケールバー=10μmです。 （B）非存在下でのGFP-ビオチンダイニン-TMRのローカライズ（ - 、左）とストレプトアビジンの存在（+、右）（STRP）。皮質GFP-ビオチンダイニン-TMRのまたは存在（+、右） - （C）微小管アスター不在の位置決め（左）。 （D）微小管アスター（左パネル、GRASE1の存在下でEEN）ポジショニング（中央のパネル、赤）。 ASE1とCut7（キネシン-5）（中央のパネル、赤）の存在下で、（E）微小管アスター（左パネル、緑）ポジショニング。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> 図 5：in vitroでの イメージングアスターポジショニングダイナミクス （A）、数時間までのために液滴イメージングを可能にするPDMSカップのデザイン。異なる内容を含む液滴の（B）の生成、ストレージおよびイメージング（送信）は、不在蛍光デキストランの（左）インクルージョン（右）（アレクサ647）によって示されています。広告のzスタック（2μmの距離）から取られた60分のタイムラプスの（C）シングル平面画像（2分間隔）単一の中心体を含むroplet。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

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Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

生化学

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

組み立て式、エレクトロ スプレーを組み合わせることによって球形とワーム状ミセル ナノ結晶と溶剤ベースの構造制御の作製

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

化学

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is especially the case during mitosis or meiosis, where the microtubules form the spindle during cell division. The spindle is the machinery used to segregate genetic material during cell division. Toward creating self-organized spindles in vitro, we recently developed a technique to reconstitute microtubules into spindle-like assemblies with a minimal set of microtubule-associated proteins and crowding agents. Specifically, MAP65 was used, which is an antiparallel microtubule crosslinker from plants, a homolog of Ase1 from yeast and PRC1 from mammalian organisms. This crosslinker self-organizes microtubules into long, thin, spindle-like microtubule self-organized assemblies. These assemblies are also similar to liquid crystal tactoids, and microtubules could be used as mesoscale mesogens. Here, protocols are presented for creating these microtubule tactoids, as well as for characterizing the shape of the assemblies using fluorescence microscopy and the mobility of the constituents using fluorescence recovery after photobleaching.

This article presents a protocol for the formation of microtubule assemblies in the shape of tactoids using MAP65, a plant-based microtubule crosslinker, and PEG as a crowding agent.

微小管タクトイドの自己組織化

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

生物工学

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.

粒子テンプレート化乳化により、マイクロ流体フリーのドロップレットアッセイが可能

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

生物学

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

マウス卵子の核形状と凝縮物動態に対する細胞骨格の影響

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

著者スポットライト:マウス卵子におけるメカノトランスダクションと核攪拌のダイナミクスの解明

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

球状エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

要約

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油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマルジョンにおける細胞周期振動の再構成

組み立て式、エレクトロスプレーを組み合わせることによって球形とワーム状ミセルナノ結晶と溶剤ベースの構造制御の作製

完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成

微小管タクトイドの自己組織化

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

粒子テンプレート化乳化により、マイクロ流体フリーのドロップレットアッセイが可能

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

要約

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油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

組み立て式、エレクトロ スプレーを組み合わせることによって球形とワーム状ミセル ナノ結晶と溶剤ベースの構造制御の作製

完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成

微小管タクトイドの自己組織化

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

粒子テンプレート化乳化により、マイクロ流体フリーのドロップレットアッセイが可能

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

球状エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマルジョンにおける細胞周期振動の再構成

組み立て式、エレクトロスプレーを組み合わせることによって球形とワーム状ミセルナノ結晶と溶剤ベースの構造制御の作製

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成