生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

この方法は、生体内でシナプス前末端がどのように機能するのかといった神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立つ。この一連の技術の主な利点は、ゼノプスオタマジャクシを動物モデルとして使用する嗅覚経路の機能を主張する無料のアプローチを示していることです。この手順を実証することは、私、ベアトリス・テルニ、パオロ・パッチョラです。

0.02%MS2 22麻酔液中のセルロース定性的なフィルターペーパーの2枚を湿潤し、解剖スコープの下に置くことによって、セクションの手順を開始します。その後、タンクからオタマジャクシを選び、麻酔液の皿に浸します。オタマジャクシは2〜4分以内に泳ぐのをやめるべきです。

ピンセットを使用して尾部レベルで適用される機械的刺激に対する反応がないことにより、適切な麻酔を確認します。麻酔をしたオタマジャクシをフィルターペーパーのスコープの下に置きます。脳の構造を視覚化できるように、その後ろ側を上向きにして動物を配置します。

行動実験では、静脈はさみを使用して両方の神経をトランセクトし、嗅球に到着するすべての臭気情報を抑制します。2マイクロリットルのカルシウムグリーン1デキストリン溶液を含むポルドガラスピペットをロードし、マイクロインジェクターに入れます。解剖顕微鏡の下に麻酔をしたオタマジャクシをフィルターペーパーの上に置き、ピペットの先端を鼻カプセルの主な空洞に移し、0.15〜0.3マイクロリットルの染料を送達する。

オタマジャクシを2~3分間所定の位置に置いておきます。パスツールピペットを使用して、乾燥を避けるために、動物のより多くのコドル部分に0.02%MS2 22溶液を滴下します。オタマジャクシが10分以内に正常な水泳を回復する必要がある回復タンクに動物を転送します。

注射の翌日に嗅球の糸球体層のレベルで蛍光を観察する。最初に嗅球の上の皮膚を取り除くことによって、画像化のための麻酔付きオタマジャクシを準備します。静脈はさみを使用して、嗅球のレベルで中枢神経系の端にあるオタマジャクシの皮膚に横切りを行います。

視神経の位置によって容易に識別することができるテクタムに切り傷を延長することを避ける。パスツールピペットを使用して0.02%MS2 22溶液の滴を適用し、ピンセットを使用してカット皮膚をつまみ、神経系の上に引っ張ることによって、動物の湿った状態を保ちます。嗅球の上にメラノサイトがないことで、除去に成功したことを確認します。

オタマジャクシをセルガードコーティングされた皿の井戸に入れます。高真空グリースでコーティングされたガラスカバースリップを、テクタムの上部を尾端まで覆います。嗅球とプラコードが細胞外媒体にさらされたままであることを確認してください。

ピトリ皿に、筋肉の収縮を防ぐために100マイクロモルチューブコクラリンを含むゼノプスリンガーの溶液を充填します。オタマジャクシを持った皿を直立した顕微鏡の下に置きます。ゼノプスリンガーの溶液を含む貯蔵所を、ゼノプスリンガー溶液の連続拡散のためのポリエチレンチューブを使用して皿と接続します。

ゼノプスリンガーの溶液を浸透させ始める。実験全体を通して、皿の中で溶液のレベルを一定に保ちます。血管を血行を観察することにより、オタマジャクシの生存率を継続的に評価する。

低倍率の目的を使用してオタマジャクシを視覚化して、ライブイメージングを開始します。マイクロマニピュレーター軸を動かして、臭気溶液を送出する毛細管を1つの鼻カプセルの上に置き、嗅覚神経で90度の角度を形成する。鼻カプセルにイプシララに位置する嗅球を見つける。

長い作業距離で高倍率の水の目的に切り替えます。I.糸球体構造による蛍光放出を確認してください。高い貯蔵所に新鮮なアミノ酸溶液の20ミリリットルをピペットで開始します。

その後、彼らの住宅タンクから6つの食糧奪われたオタマジャクシを取り、臭気への暴露を最小限に抑えるためにきれいなオタマジャクシ水の2リットルにそれらを置きます。白いLEDのトランイルミエーターに修正された6つの井戸皿を置きます。各井戸に10ミリリットルのオタマジャクシ水を入れます。

1ウェルあたり1つのオタマジャクシを置き、少なくとも3分間休ませます。画像の取得を開始し、基礎、刺激、および回復期間を含む映画を取得します。アミノ酸の溶液を送達するノズルに向かう動きとして、魅力的な反応を検出することができます。

画像化後に動物をタンクに戻します。35ミリメートル×35ミリメートルの領域内のオタマジャクシヘッド位置、またはピクセル単位の同等のサイズを追跡することで、嗅覚ガイド行動の定量的分析が可能になります。点線は、臭気溶液入口に近位領域を表す。

オタマジャクシ運動の個々のプロットは、画像解析によって得られたX Y座標を用いて構築される。抽出された運動性プロットは、ビデオ画像を忠実に再現する必要があります。溶液入口を中心とする半径8.75ミリの対象領域は、動物の近接性を臭気源に分類するために使用される。

臭気のノズルの近くで過ごす時間が多いほど、正のトロピズムを示します。定義された期間、例えば15秒間隔の間にノズルの近くでオタマジャクシが費やした時間は、アミノ酸溶液を検出する能力の識別を可能にする。オタマジャクシの集団の全体的な挙動は、個々のデータの分布をプロットすることによって得ることができます。

陽性のトロピズムは、アミノ酸溶液が1ミリモルまたは160マイクロモルで調製されたときに検出することができる。動物は水の適用に応答しません。この手順に従って、組織学的手法または電気生理学のような他の方法は、傷害後のシナプス特性の変化のような追加の質問に答えるために行うことができる。

その開発後、この技術は、神経生物学の分野の研究者がゼノプスオタマジャクシの嗅覚情報の処理を探求する道を開いた。