Cette méthode peut être utile pour répondre à des questions clés dans les domaines de la neurobiologie tels que la façon dont les terminaux présynaptiques fonctionnent in vivo. Le principal avantage de cet ensemble de techniques est que nous montrons des approches complémentaires pour asses la fonction des voies olfactives en utilisant têtards Xenopus comme modèle animal. La démonstration de cette procédure sera moi-même, Béatrice Terni, et Paolo Pacciolla.
Commencez la procédure de transection en mouillant deux morceaux de papier filtre qualitatif de cellulose dans la solution anesthésique MS2 22 à 0,02 %, et en les plaçant sous la portée de dissectation. Puis choisissez un têtard dans le réservoir et immerger dans un plat de solution anesthésique. Le têtard doit cesser de nager dans les deux à quatre minutes.
Vérifiez l’anesthésie appropriée par l’absence de réaction aux stimuli mécaniques appliqués au niveau de la queue à l’aide d’une pince à épiler. Placez le têtard anesthésié sur le papier filtre sous la portée. Placez l’animal avec son côté dorsal orienté vers le haut afin que les structures cérébrales puissent être visualisées.
Pour les expériences comportementales, utilisez des ciseaux veni pour transecter les deux nerfs pour supprimer toutes les informations sur les odorants arrivant à l’ampoule olfactive. Chargez une pipette en verre poled avec deux microlitres de solution de dextrine vert calcium, et placez-la dans le microinjecteur. Placez un têtard anesthésié sous le microscope disséquant sur du papier filtre, puis déplacez la pointe de la pipette dans la cavité principale de la capsule nasale et livrez de 0,15 à 0,3 microlitres du colorant.
Laissez le têtard en place pendant deux à trois minutes. À l’aide d’une pipette Pasteur, goutte à goutte 0,02%MS2 22 solution sur les parties plus dorloter de l’animal pour éviter le séchage. Transférer l’animal dans le réservoir de récupération où le têtard doit retrouver une nage normale dans les 10 minutes environ.
Observez la florescence au niveau de la couche glomérique de l’ampoule olfactive le lendemain de l’injection. Préparez un têtard anesthésié pour l’imagerie en enlevant d’abord la peau au-dessus de l’ampoule olfactive. Utilisez des ciseaux de veni pour faire une incision latérale sur la peau du têtard sur le bord du système nerveux central au niveau de l’ampoule olfactive.
Évitez d’étendre la coupe au tectum, qui peut être facilement identifié par l’emplacement du nerf optique. Gardez l’animal humide en appliquant des gouttes de solution 0,02%MS2 22 à l’aide d’une pipette Pasteur, puis pincez la peau coupée à l’aide d’une pince à épiler et tirez-la sur le système nerveux. Vérifiez l’enlèvement réussi par l’absence des mélanocytes au-dessus de l’ampoule olfactive.
Placer le têtard dans le puits du plat enduit de garde cellulaire. Placez un slip de couverture en verre recouvert de graisse sous vide élevée pour couvrir le haut du tectum jusqu’à l’extrémité de la queue. Assurez-vous que l’ampoule olfactive et les codes à placodes restent exposés au milieu extracellulaire.
Remplissez le plat de pitri de la solution de Xenopus Ringer contenant 100 tubocurarines micromolaires pour prévenir les contractions musculaires. Placer le plat tenant le têtard sous un microscope droit. Connectez le réservoir contenant la solution de Xenopus Ringer avec le plat à l’aide de tubes en polyéthylène pour une profusion continue de la solution de Xenopus Ringer.
Commencez à perfuser la solution de Xenopus Ringer. Maintenir le niveau de la solution dans le plat constant tout au long de l’expérience. Évaluer continuellement la viabilité des têtards en observant la circulation sanguine à travers les vaisseaux.
Commencez l’imagerie en direct en utilisant un objectif de grossissement faible pour visualiser le têtard. Déplacez l’axe du micromanipulateur pour placer le capillaire fournissant la solution odorante sur le dessus d’une capsule nasale, formant un angle de 90 degrés avec le nerf olfactif. Trouvez l’ampoule olfactive située ipsilaterally à la capsule nasale.
Passez à un objectif d’eau à grossissement élevé avec une longue distance de travail. Vérifier l’émission de florescence par les structures i.glomerular devrait être évident. Commencez par acheminer 20 millilitres de solution d’acides aminés frais dans un réservoir surélevé.
Puis prenez six têtards privés de nourriture de leur réservoir de logement, et placez-les dans deux litres d’eau propre têtard pour minimiser l’exposition aux odorants. Déposer un plat de six puits modifié sur un transilluminateur LED blanc. Remplissez chaque puits de 10 millilitres d’eau têtarde.
Placer un têtard par puits, puis laisser reposer pendant au moins trois minutes. Commencez l’acquisition d’images et achetez des films contenant des périodes de basal, de stimulus et de récupération. Une réponse attrayante peut être détectée comme un mouvement vers la buse offrant la solution des acides aminés.
Retournez les animaux dans leur réservoir après l’imagerie. Le suivi des positions de la tête des têtards dans une zone de 35 millimètres par 35 millimètres, ou la taille équivalente en pixels, permet une analyse quantitative du comportement guidé olfactif. La ligne pointillée représente la zone proximale de l’entrée de solution d’odeur.
Des parcelles individuelles de mouvements de têtards sont construites à l’aide des coordonnées X Y obtenues par analyse d’image. Les parcelles de motilité extraites doivent reproduire fidèlement des images vidéo. Une région d’intérêt de rayon de 8,75 millimètres centrée sur l’entrée de solution est utilisée pour classer la proximité des animaux avec la source du odorant.
Plus de temps passé à proximité de la buse du odorant indique un tropisme positif. Le temps passé par les têtards près de la buse pendant des périodes définies, par exemple, intervalles de 15 secondes, permet d’identifier la capacité de détecter les solutions d’acides aminés. Le comportement global d’une population de têtards peut être obtenu en traçant la distribution de données individuelles.
Le tropisme positif peut être détecté lorsque la solution d’acide aminé est préparée à un millimolaire ou 160 micromolaire. Les animaux ne réagissent pas à l’application de l’eau. Après cette procédure, d’autres méthodes comme les techniques histologiques ou l’électrophysiologie, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires comme l’altération des propriétés synaptiques après une blessure.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer le traitement de l’information olfactive dans le têtard de Xenopus.
