Name: using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da un Grant di ricerca della American Society for Reproductive Medicine e da Charles e Johanna Busch Memorial Fund presso la Rutgers, The State University di NJ per K.S. A.L.N. era sostenuta da una sovvenzione del N.I.H. (F31 HD0989597).

1. molecolare clonazione
<ol><li>Ottenere la figura intera sequenza di codificazione del gene di interesse e la trascrizione in vitro plasmide (pIVT) vector11. Nota: Cloni di cDNA integrale sono disponibili in commercio da vari fornitori o possono essere generati tramite reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR). Centro nazionale per la risorsa online Biotechnology Information (NCBI) fornisce sequenze di trascrizione per i geni dal Nucleotide e sequenza espressa contrassegnati database (EST). Per facilità di proteina nella strategia di clonazione si potrebbe desiderare la visualizzazione e l'analisi dei livelli di espressione, fusione di proteina fluorescente verde (Gfp) o un altro tag fluorescente adatto.</li>
	<li>Utilizzando una strategia di clonazione convalidata, inserire la sequenza di codificazione del gene di interesse della regione di clonazione più di pIVT. Una descrizione dettagliata della clonazione molecolare e i passaggi necessari sono stati precedentemente descritto 12. Nota: Se un prodotto di fusione del gene deve essere generato, essere sicuri che la clonazione è nel telaio della lettura corretta.</li>
	<li>Sequenza del costrutto utilizzando primers globina affinché il gene corretto inserimento, corretto in-struttura fusion, e che nessuna mutazione di punto della polimerasi-indotto sono stata creata. Nota: Se l'attrezzatura di sequenziamento Sanger DNA non è disponibile, molte aziende offrono opzioni di sequenziamento del DNA a basso costo.</li>
	<li>Mutagenizzare DNA se generando polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) o inserzioni/delezioni (INDELS). Mutagenesi di DNA è descritto in passaggi 1.5-1.7 sotto. Per i costrutti di tipo selvatico, procedere con il passo di linearizzazione 1.7.</li>
	<li>Disegnare primers di mutagenesi e completare la reazione di PCR di mutagenesi per generare la costruzione del mutante secondo il protocollo del produttore. PCR-mediata di mutagenesi sito-diretta è stato descritto in precedenza 13. Inoltre, molte aziende offrono kit di mutagenesi sito-diretta, che comprendono protocolli.</li>
	<li>Trasformare mutagenized DNA batterico host. Isolare e purificare il plasmide. Nota: Molte aziende fanno kit che può essere utilizzato facilmente isolare e purificare il DNA del plasmide. Seguire il protocollo di produttori di conseguenza. Se si utilizza un ceppo batterico gram-negativo come e. coli, si consiglia di utilizzare un kit che rimuove le endotossine.</li>
	<li>Sequenza del DNA isolato da batteriche trasformanti utilizzando standard sequenziamento Sanger per confermare introduzione di SNP o INDEL desiderato.</li>
	<li>Linearizzare prodotti finali mediante digestione singolo enzima di restrizione del DNA purificato. Nota: Il vettore pIVT contiene più single-enzima tagliata siti elencati nella mappa del plasmide su Addgene 14.</li>
	<li>Assicurarsi che il prodotto sia lineare tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi. La metodologia per l'elettroforesi del gel dell'agarosi precedentemente è stata definita 14. Nota: Per tutti i passaggi rimanenti, utilizzare barriera (filtro) dispensare consigli e materiali RNasi-free per garantire una produzione di alta qualità stabile del RNA.</li>
	<li>Purificare il prodotto digerito utilizzando un protocollo di pulizia del DNA o kit convalidato ed eluire in acqua privo di RNAsi e dnasi di 30 µ l. Nota: Rotazione di silice-matrice kit a base di colonna sono raccomandati per l'alta qualità, purificato del DNA. Seguire il protocollo di produttori di conseguenza.</li>
	<li>
In vitro trascrivere DNA usando T7 polimerasi seguendo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Purificare ed eluire RNA in 30 µ l di acqua gratuita di RNAsi/dnasi utilizzando un kit di purificazione basata sulla colonna dell'acido nucleico di spin di silice-matrice seguendo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Eseguire Denaturare Elettroforesi del gel di agarosio utilizzo di formaldeide per confermare il formato finale del prodotto di RNA. Vedere i passaggi 1.13-1.22 sotto il 14. (Figura 1).</li>
	<li>Preparare il gel di riscaldamento 1 g agarosio in 72 mL acqua fino a completa dissoluzione, poi raffreddare a 60 ° C.</li>
	<li>Preparare 10 X MOPS tampone di corsa aggiungendo 0,4 M MOPS (pH 7.0), acetato di sodio 0.1 M ed EDTA 0,01 M.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di 10 X MOPS in esecuzione buffer e 18 mL di formaldeide al 37% (12,3 M) per la soluzione di agarosio raffreddato.</li>
	<li>Casta il gel versando la soluzione di agarosio in un contenitore di gelificanti. Utilizzare un pettine grande abbastanza per ospitare 10 µ l. Dopo gel è impostata ed è sodo al tatto, rimuovere delicatamente il pettine.</li>
	<li>Assemblare il gel nel serbatoio dell'elettroforesi e aggiungere abbastanza 1 tampone in esecuzione X MOPS, assicurando il gel è completamente coperto.</li>
	<li>Preparare campione di RNA mediante l'aggiunta di 1 µ g di RNA a 0,5 volumi X della tintura di caricamento contenenti formaldeide.</li>
	<li>Aggiungere il bromuro di etidio alla soluzione di RNA ad una concentrazione di 10 µ g/mL.</li>
	<li>Denaturare soluzione di campione di RNA a 70 ° C per 5 min.</li>
	<li>Utilizzando sterile, 10 µ l filtro consigli, caricare 5 µ l di marcatore di peso molecolare e 5 µ l di RNA dei campioni in pozzetti separati del gel ed elettroforesi a 5 V/cm fino a quando il colorante è migrato almeno i due terzi della lunghezza del gel.</li>
	<li>Visualizzare il RNA nel gel su un illuminatore di trans UV. Garantire che RNA è la dimensione corretta confrontando il marker di peso molecolare.</li>
	<li>Per misurare la concentrazione e la purezza del RNA, trasferire 1,2 µ l di RNA purificato utilizzando sterile 10 µ l filtro consigli su uno spettrofotometro di UV. Si noti che il RNA di alta qualità deve avere rapporti di assorbanza di A260/280 (1.8-2.2) e 260/230 (> 1.7) rispettivamente.</li>
	<li>Utilizzando 10 µ l filtro consigli, aliquotare il rimanente RNA purificato nelle provette di sterile 0,5 µ l centrifuga (3-5 µ l/tubo). Archivio tubi a-80 ° C fino al momento per il microinjection. Nota: Una concentrazione di iniezione finale di 500 ng / µ l è un punto di partenza ottimo. Si consiglia di diluire RNA 1:2 in RNasi free H20 prima microiniezione per ridurre la viscosità di RNA in pipetta microiniezione.</li>
</ol>2. cinetocore-Microtubule allegato Assay
<ol><li>Dividere gli ovociti in gruppi uguali per il microinjection. Nota: Raccolta degli ovociti, trasferimento, microiniezione e maturazione meiotica è stata descritta in dettaglio in Giove precedentemente 15.</li>
	<li>Microinject un gruppo con mRNA sperimentale e il o i gruppi con il controllo WT e PBS o Gfp mRNA. Nota: 500 ng / µ l è la concentrazione di iniezione consigliati per iniziare con 10. Un picoinjector può essere utilizzato per controllare la quantità di iniezione. Un volume di iniezione di 5-10 pL è consigliato 15.</li>
	<li>Usando una mano o bocca apparato pipettaggio azionato dove il vetro pipetta apertura è leggermente più grande del diametro di un ovocita (100-150 µm), trasferimento ovociti in una goccia di 100 µ l di terreno di coltura privo di milrinone in una capsula Petri coperto in embrione qualità olio minerale e incubare gli ovociti per 7 h a 37 ° C in 5% C02 per consentire la maturazione sufficiente alla metafase della meiosi ho (ho incontrato) 15.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, utilizzando la stessa apparecchiatura di pipetta come sopra, trasferire gli ovociti in un piatto di cultura centro-pozzo organo contenente 700 µ l del mezzo di raccolta di pre-refrigerati media essenziale minimo (MEM) nel centro ben e 500 µ l di H20 nell'anello esterno e piatto posto sul ghiaccio per 7 min. Nota: Si consiglia di pre-chill media MEM e centrare bene piatti di cultura di organo a-20 ° C per almeno 20 minuti prima del trattamento degli ovociti.</li>
	<li>Difficoltà gli ovociti trasferendoli utilizzando l'apparato di pipetta in un pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l di 2% paraformaldeide in 1X PBS per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando la stessa pipetta apparato, trasferire gli ovociti in un altro pozzo su un piatto posto contenente 400 µ l di soluzione bloccante (PBS + 0,3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0,02% NaN3) e store a 4 ° C fino al momento di elaborare per immunostaining. Nota: per la memorizzazione di ovociti a 4 ° C, vetro di copertura piatto posto con parafilm per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Con la stessa pipetta apparecchiatura, ovociti di trasferimento ad un nuovo pozzo in un luogo piatto contenente soluzione di permeabilizzazione 400 µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 20 ovociti trasferimento rapidamente attraverso tre gocce di 400 µ l blocco soluzione per rimuovere eventuali residui di detersivo. Nota: Un piatto di vetro trasparente 9-pozzo posto funziona bene per lo spostamento di gruppi attraverso trattamenti multipli su un singolo piatto (passaggi 2.4-2.5).</li>
	<li>Eseguire le restanti procedure di immunocitochimica in una camera umidificata, al riparo dalla luce a temperatura ambiente. Utilizzare un contenitore di plastica medie foderato con tovaglioli di carta umidi e coprire con foglio di alluminio.</li>
	<li>Utilizzando l'apparato di pipetta, trasferire gli ovociti a 30 µ l blocco soluzione sul coperchio di una piastra a 96 pozzetti e posto all'interno della camera umidificata per 10 min. Nota: Gocce vengono inseriti nella circolare indentions sulla piastra.</li>
	<li>Per etichettare i centromeri e mandrino, utilizzando l'apparato di pipetta, trasferimento ovociti in 30 µ l blocco soluzione contenente antigene anti-centromeriche (ACA, Crest) (01:30) e anti-acetilato tubulina (1: 1000) e incubare per almeno 1 h.</li>
	<li>Risciacquare gli ovociti trasferendo attraverso gocce tre 30 µ l di soluzione per 10 minuti ciascuno, di blocco.</li>
	<li>Utilizzando l'apparato di pipetta, trasferimento ovociti per un 30 µ l goccia di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari gratuiti agli anticorpi utilizzati sopra (anti-human IgG 1: 200, 1: 200 IgG anti-topo) e incubare per 1 h.</li>
	<li>Ripetere i passaggi di risciacquo 10 min 3, in 30 µ l soluzione di blocco come descritto al punto 2.11.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta, in 3-5 µ l montaggio medio contenente DAPI (5,9 µ g / µ l) su un vetrino per microscopio.</li>
	<li>Posto 4 piccole gocce (dimensioni di una testa di spillo) di gelatina di petrolio sugli angoli dei vetrini coprioggetto antischiacciamento degli ovociti.</li>
	<li>Delicatamente posizionare il lato di gelatina di petrolio di vetrini coprioggetto sulla diapositiva.</li>
	<li>Guarnizione vetrino coprioggetti bordi con chiaro smalto per unghie e lasciare per asciugare per 5 min.</li>
	<li>Archiviare le diapositive a 4 ° C, al riparo dalla luce, fino al trattamento tramite microscopia confocale. Nota: Assicurarsi che l'indice di rifrazione del mezzo di montaggio e il vetrino coprioggetti, partite i microscopio obiettivi utilizzati. Consigliata per il montaggio materiali precedentemente sono stati descritti 15.</li>
	<li>Immagine utilizzando un obiettivo x 40-63 su un microscopio confocale, catturando piccoli passi di ovociti (≤ 1 µm) nel piano z, ottimizzato per il lavoro obiettivo e l'immagine l'intera regione del mandrino metafase. Nota: Assicurarsi che tutti i 3 canali basati su specifici anticorpi secondari utilizzati nel passaggio 2.11 di immagine. Immagine in media ≥ 4 e uno zoom di 3 è ideali per un'adeguata risoluzione. Una dimensione di passaggio 1 µm offre una visualizzazione chiara dei microtubuli e cinetocori in oocytes del mouse. La procedura per l'acquisizione immagine varierà da un microscopio. Consultare la Guida utente confocale produttore per istruzioni specifiche su come configurare le impostazioni di microscopio.</li>
	<li>Identificare microtubulo-cinetocore allegato stato utilizzando il software di imaging seguendo passaggi 2,21-2.23 qui sotto. Nota: I passaggi seguenti descrivono questa procedura utilizzando il software scaricabile gratuitamente Image J (NIH), tuttavia, può essere utilizzato software di imaging alternativo. Lo stato di attaccamento tipi precedentemente sono stati definiti 16 .</li>
	<li>Apri immagine trascinando file nella barra degli strumenti immagine J.</li>
	<li>Aperto di z-serie, rendere tutti i canali visibili (DNA, cinetocore e mandrino) cliccando su "canali di Unione", disponibile nel menu a discesa "immagine", sotto la scheda di sub "colore".</li>
	<li>Utilizzando l'interruttore nella parte inferiore dell'immagine, spostare attraverso ogni fetta z e determinare allegato microtubule cinetocore. Allegato dettagliata descrizioni sono stati precedentemente descritti 16
</li>
</ol>3. cromosoma allineamento Challenge test
<ol><li>Utilizzando l'apparato di pipetta come descritto al punto 2.3, trasferire gli ovociti in una goccia di 100 µ l di terreno di coltura privo di milrinone sott'olio e incubare gli ovociti per 7 h per consentire sufficiente maturazione alla metafase della meiosi ho (ho incontrato) come precedentemente descritto nel passaggio 2.3 17 . Nota: Le procedure di raccolta, microiniezione e maturazione degli ovociti sono state delineate in precedenza 15. Riferisca al protocollo del saggio allegato nei passaggi 2.1-2.2 per i controlli e per le concentrazioni di microiniezione di RNA.</li>
	<li>Con la stessa pipetta apparecchiatura, trasferimento ovociti ad una cultura centro-pozzo organo piatto contenente 700 µ l di coltura contenente monastrol [100 µM] in centro ben e 400 µ l H20 nell'anello circostante e incubare a 37 ° C per 2 h.</li>
	<li>Sciacquare monastrol trasferendo gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta come sopra, attraverso tre gocce di 100 µ l di CZB coltura e quindi trasferire gli ovociti per un nuovo piatto di cultura centro-pozzo organo contenente 700 µ l terreno di coltura + MG132 [5 µM] per 3 h al centro anello. Aggiungere 400 µ l H20 anello esterno.</li>
	<li>Difficoltà gli ovociti trasferendoli, utilizzando l'apparato di pipetta, in un pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l 2% paraformaldeide in PBS per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo la fissazione, trasferire gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta, in un nuovo pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l soluzione bloccante e conservare a 4 ° C fino a elaborati per immunostaining. Nota: per la memorizzazione di ovociti a 4 ° C, vetro di copertura piatto posto con parafilm per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Permeabilize ed etichettare gli ovociti tramite immunocitochimica, come descritto nei passaggi 2.6-2.16.</li>
	<li>Immagine di ovociti utilizzando un obiettivo x 40-63 su un microscopio confocale, catturando < 1 µm passi nel piano z assicurandosi di tutta la regione del mandrino metafase di immagine.</li>
	<li>Per identificare l'allineamento del cromosoma stato aprire file di immagine utilizzando il software di imaging. Nota: I passaggi seguenti descrivono questa procedura utilizzando il software scaricabile gratuitamente Image J (NIH), tuttavia, può essere utilizzato software di imaging alternativo.</li>
	<li>Trascinare l'immagine nel pannello di controllo di immagine di J.</li>
	<li>Aperto di z-serie, utilizzare lo strumento punto (disponibile facendo clic sull'icona dello strumento punto sulla barra di controllo immagine J) per segnare punti alla fine di ciascun polo dell'alberino nei loro rispettivo fetta z posizionando lo strumento sopra il palo del mandrino nell'immagine e cliccando sull'immagine. Aggiungere questi punti nella regione di interesse (ROI) manager premendo comando + t sulla tastiera.</li>
	<li>Determinare le coordinate specifiche per ciascuna delle posizioni impostate al punto 3.10 mettendo in evidenza il punto specifico in gestione ROI e facendo clic sul pulsante di misura. Ciò fornirà un risultati contenenti tabella coordinate x e y per ogni punto. Questi saranno i punti X1, Y1 e X1, Y2, rispettivamente.</li>
	<li>Successivamente, determinare la coordinata Z true. Questo viene fatto moltiplicando il numero di slice della z-fetta specifico nello z-stack in cui è stato identificato il polo dell'alberino (cioè fetta #2 di 6) che ogni singolo punto è dallo spessore dello stack (cioè 1 µm) (esempio: affettare 2 x 1 µm = 2). Questi saranno i punti Z1 e Z2, rispettivamente.</li>
	<li>Determinare la lunghezza del mandrino usando l'equazione del teorema di Pitagora (a2 + b2 = c2) utilizzando il precedentemente definito coordinate x, y e z da passaggi 3.11-3.13. Per ogni mandrino lunghezza finale è uguale a: √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Determinare la fosforila mandrino. È calcolato come metà della lunghezza del mandrino. Utilizzando lo strumento di riga di immagine J, facendo clic sull'icona linea nella barra degli strumenti immagine J, disegnare una linea che va da un polo di mandrino a fosforila il mandrino. La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti immagine J.</li>
	<li>Determinare lo stato di allineamento del cromosoma valutando la distanza del cromosoma dalla fosforila mandrino utilizzando lo strumento di misurazione di linea. Utilizzando lo strumento della riga disponibile facendo clic sull'icona linea nella barra degli strumenti immagine J, disegnare una linea da fosforila il mandrino al cromosoma. La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti immagine J. Maggiore di 4 µm da fosforila il mandrino di cromosomi sono considerati non allineati 18.</li>
</ol>

<ol>
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J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol,+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin,+Eg5.">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes.">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li><li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells.">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li><li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes,+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase.">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

A causa l'identificazione rapida e crescente di varianti genetiche umane associati alla malattia, è essenziale che i sistemi sono stabiliti per valutare il loro significato biologico. Capire la funzione della proteina in meiosi umana pone sfide particolari perché ovociti umani sono preziosi e raro e umano dello sperma non è suscettibile di manipolazione genetica. Oocytes del mouse sono un sistema di modello mammifero prezioso per la valutazione umana del gene meiotica funzione 10,<su...

La sterilità è una condizione che colpisce il 10-15% della popolazione umana dell'età riproduttiva 1, da cui quasi metà Cerca cure mediche 2. Anche se l'eziologia dell'infertilità è vario e in molti casi multifattoriali, l'anomalia genetica più comune in esseri umani è aneuploide embrionali 3. Aneuploide è definita come la deviazione (guadagno o perdita) del numero corretto di cromosomi in una cella. Il fenomeno di aneuploide in embrioni umani è comune e aumenta con l'età materna avanzata 4,5. Quattro studi controllati randomizzati hanno evidenziato i benefici della selezione solo cromosomicamente normali (euploide) degli embrioni per il trasferimento uterino perché questa strategia ha provocato l'impianto aumento tariffe, tassi più bassi di aborto spontaneo e tempi più brevi per raggiungimento di gravidanza 6,7,8,9. Di conseguenza, capire l'eziologia di aneuploide umana possono avere importanti implicazioni nella riproduzione assistita.
Anche se la prova genetica preimpianto per aneuploidie è vantaggiosa in trattamenti di sterilità, manca ancora una conoscenza approfondita di come origine degli aneuploidi. È ampiamente accettato che esiste una correlazione positiva di aneuploidie meiotiche (originati durante la produzione di gameti) e l'età materna, tuttavia, alcuni tassi di aneuploide embrionali presenti donne che si discostano dal tasso medio per loro era dato 4. Questi casi suggeriscono che la sola età non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Altri fattori possono svolgere un ruolo nell'aumento del rischio di aneuploidia embrionale, come varianti del gene.
Un aspetto fondamentale di studiare il potenziale contributo di una variante del gene di aneuploide durante la meiosi ovocitaria è quello di progettare un sistema per valutare rapidamente la funzione del gene meiotica. A causa di limitazioni di carattere etici e accesso limitato, è poco pratico per eseguire questi esperimenti utilizzando ovuli umani. Questi problemi possono essere aggirati utilizzando oocytes del mouse, e qui una serie di saggi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi io sono descritti. Da microinjecting del RNA messaggero (mRNA) che codifica per la variante del gene di interesse, la localizzazione della proteina umana nell'uovo del mouse può essere visualizzata e utilizzata per determinare se l'espressione ectopica della proteina wild-type e mutanti umana risultati in qualsiasi alterazioni fenotipiche che potrebbero portare a aneuploide. Questi fenotipi comprendono un aumento in microtubuli che si attaccano all'improprio alla sorella cinetocore e l'incapacità di sostenere allineamento cromosomi in metafase della meiosi I. d'importanza, questo protocollo può essere usato per studiare il guadagno e la perdita della funzione varianti genetiche attraverso la definizione di specifiche condizioni sperimentali per sfidare gli eventi chiave nella meiosi ovocitaria come mandrino allineamento edificio e del cromosoma 10.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass spot plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration table</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td><td>Antibodies Incorportated</td><td>15-234</td><td>1:30 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well organ culture dish</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td>For incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Centrifuge (With cooling ability)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>any standard model&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cover Glass 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>thickness will vary for particular microscopes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>For DNA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Enzymes for linearizing pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI or KasI can be used</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Any Fluorescent microscope may be used</td></tr><tr><td>Formaldehyde (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde RNA loading dye</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Full Length cDNA Clones</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#039;.&amp;nbsp; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#039; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Holding pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber</td><td></td><td></td><td>Tupperware can be used</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Any Standard model</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Analysis software</td></tr><tr><td>Lid of 96 well plate</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&amp;nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Sequence analysis software</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tank</td><td></td><td></td><td>for antivibration table</td></tr><tr><td>Nail Polish; Clear</td><td></td><td></td><td>Any clear nailpolish can be used</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Organ Culture Dish 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>XenoWorks Digital Microinjector</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Flaming-Brown Micropipette puller</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT plasmid</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>200523</td><td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td></tr><tr><td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>210512</td><td>mutagenesis kit for single site changes</td></tr><tr><td>Scissors (Fine point)</td><td>Fine science tools</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (Medium point)</td><td>Fine science tools</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td><td>Fine science tools</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

L'aneuploidia embrionale è la principale causa genetica di infertilità nell'uomo. La maggior parte di questi eventi hanno origine durante la meiosi femminile, e seppur correlata positivamente con l'età materna, età da solo non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Pertanto, le varianti del gene potrebbero rappresentare segregazione del cromosoma non corretto durante l'oogenesi. Dato che l'accesso di ovociti umani è limitato per scopi di ricerca, una serie di saggi sono stati sviluppati per studio di funzione del gene umano durante la meiosi I usando i oocytes del mouse. In primo luogo, RNA messaggero (mRNA) del gene e la variante del gene di interesse vengono microiniettati nei oocytes del mouse mi-arrestato profase. Dopo dando il tempo di espressione, gli ovociti vengono rilasciati in modo sincrono nella maturazione meiotica per completare la meiosi I. Contrassegnando il mRNA con una sequenza di un reporter fluorescente, come ad esempio la proteina fluorescente verde (Gfp), la localizzazione della proteina umana può essere valutata oltre le alterazioni fenotipiche. Ad esempio, guadagno o perdita di funzione può essere indagata attraverso la definizione di condizioni sperimentali che sfidano il prodotto del gene per correggere errori meiotic. Anche se questo sistema è vantaggioso nelle indagini di funzione della proteina umana durante l'oogenesi, un'adeguata interpretazione dei risultati dovrebbe essere intrapreso dato che l'espressione della proteina non è ai livelli endogeni e, se non controllato per (cioè bussato fuori o verso il basso), omologhi murini sono anche presenti nel sistema.

Dopo in vitro trascrizione RNA di alta qualità avrà un rapporto A260/A280 di (1.8-2.2) e un ≥1.7 di rapporto A260/A230 quando misurata con uno spettrofotometro. L'immagine nella Figura 1 Mostra la migrazione di in vitro-prodotto RNA su un gel di agarosio denaturante dopo elettroforesi. Una band che è spalmata in modello o un campione che ha bande di dimensioni multiple può indicare contaminazione o degradazione del campione. In alterna...

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Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Come le varianti genetiche associate con la malattia umana cominciano a diventare scoperto, sta diventando sempre più importante sviluppare sistemi con cui valutare rapidamente il significato biologico di quelle varianti identificate. Questo protocollo descrive i metodi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi femminile che usando i oocytes del mouse.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

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RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Ricerca

Genetica

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Biologia dello sviluppo

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Manipolazione funzionale delle materne genica Utilizzando<em&gt; In Vitro</em&gt; La maturazione degli ovociti in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identificazione del danno al DNA negli ovociti arrestati con profase di topi

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autore in primo piano: Comprendere la risposta al danno al DNA negli ovociti dei mammiferi e negli embrioni preimpianto 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine 27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

Manipolazione funzionale delle materne genica Utilizzando

Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Riepilogo

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Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

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